Indian Hedgehog信號通路在軟骨細胞成熟及轉分化過程中的調控作用

王歡博 賀婷 鄭超 盧瑋光 范靜 頡強 楊柳，

【關鍵字】 Indian Hedgehog信號通路；軟骨內成骨；肥大軟骨細胞；轉分化

軟骨內成骨是高等脊椎動物骨形成的主要方式，是軟骨組織不斷生長、退化而后被骨組織取代的骨發生過程。該過程由間充質干細胞凝聚形成軟骨雛形開始，軟骨細胞不斷增殖、分化和凋亡。軟骨膜的骨祖細胞分化成為成骨細胞，與血管組織一起侵入到退化的軟骨基質中，分泌大量骨基質形成骨小梁等結構［1］。先前的研究認為凋亡是肥大軟骨細胞的最終歸宿［2］，然而近年來人們利用譜系追蹤的研究方法證實了在軟骨內成骨過程中肥大軟骨細胞能夠向成骨細胞分化，有助于軟骨內成骨［3?6］。雖然已有研究發現經典的Wnt 信號通路及其下游的IRX3和IRX5分子可以調控肥大軟骨細胞的分化方向［7?9］，但是軟骨細胞向成骨細胞轉分化過程的重要意義以及潛在的分子調控機制仍未詳盡闡明。

Hedgehog（HH）信號通路在物種間具有高度的保守性，其在胚胎生長發育、成體干細胞自穩態以及腫瘤發生發展等方面起到了關鍵的調控作用［10?12］。細胞合成分泌的HH 蛋白能夠啟動HH 信號通路。在哺乳動物中已經發現了三種HH 基因：Sonic hedgehog（Shh）、Desert hedgehog（Dhh）和Indian hedgehog（Ihh）。HH信號通路的啟動需要HH蛋白、PTCH 受體、SMO 受體以及下游轉錄分子GLI 的參與。兩種跨膜受體PTCH 和SMO 在HH信號通路中完成重要的信號接收和傳導工作。當缺乏HH信號時，PTCH 會抑制SMO 的活性，抑制HH 信號通路傳導；當HH 信號增強時，HH 與PTCH 的結合會啟動SMO，SMO被磷酸化進而啟動下游通路。

目前，有大量的研究已經證實Indian Hedgehog（IHH）信號通路對骨骼生長發育以及穩態維持具有不可或缺的功能作用［10?11］。IHH能夠直接調節生長板軟骨細胞的增殖，而且其與PTHrP 組成的負反饋環路能夠嚴格調節生長板軟骨細胞的肥大分化過程［13?14］。另外IHH還能夠調控軟骨膜的骨祖細胞向成骨細胞分化，促進軟骨內成骨過程［15］。但IHH信號通路是否參與軟骨細胞向成骨細胞的轉分化過程尚不清楚。

本研究通過構建基因修飾小鼠，特異性調節肥大軟骨細胞及其子代細胞中的IHH 信號通路的活性，探索IHH信號通路對肥大軟骨細胞分化方向的影響，旨在闡明IHH信號通路在軟骨細胞成熟以及轉分化過程中的調控作用。

材料與方法

一、實驗動物

Col10a1?Cre小鼠由香港大學Kathryn S. E.Cheah 教授饋贈［3］；Rosa26?SmoM2小鼠由哈佛大學Andrew McMahon 教授饋贈［16］；Ihh?floxed小鼠（IhhC/C）由哈佛大學Beate Lanske 教授饋贈［17］；β?actin Cre小鼠由加州大學洛杉磯分校Gail Martin 教授饋贈［18］；Ptch1?floxed小鼠（Ptch1C/C）由昆士蘭大學Brandon Wainwright教授饋贈［19］；Ptch1?LacZ小鼠由斯坦福大學Matthew P.Scott教授饋贈［20］。

為了探究肥大軟骨細胞合成的IHH 蛋白對軟骨內骨化的影響，我們構建了肥大軟骨細胞特異性Ihh基因敲除小鼠：先由Ihh?floxed小鼠與β?actin Cre小鼠雜交產生β?actin Cre;Ihhnull/+小鼠，再與野生型小鼠雜交獲得Ihhnull/+小鼠，最終與Col10a1Cre/+; IhhC/+小鼠雜交獲得Col10a1Cre/+; Ihhnull/C小鼠（對照組為Col10a1Cre/+;Ihhnull/+小鼠）。為了明確IHH信號通路是否參與肥大軟骨細胞的轉分化過程，我們構建了肥大軟骨細胞特異性IHH信號通路持續啟動小鼠：①Col10a1Cre/+;R26SmoM2/M2小鼠（對照組為Col10a1Cre/+小鼠）；②Col10a1Cre/+;Ptch1LacZ/C小鼠，主要敲除了Ptch1基因的3號外顯子序列（Ptch1?E3），由Ptch1?lacZ小鼠與Col10a1Cre/+;Ptch1C/+小鼠雜交最終獲得（對照組為Col10a1Cre/+;Ptch1LacZ/+小鼠）。構建方式見圖1。所有小鼠均為SPF級，飼養于空軍軍醫大學實驗動物中心，所有動物實驗操作均嚴格遵守《空軍軍醫大學實驗動物福利倫理規范》。

圖1 基因修飾小鼠構建模式圖 a～c：Cre重組酶驅動Ihh?floxed（a）、Rosa26?SmoM2（b）和Ptch1?floxed（c）等位基因發生重組；d：Ptch1?lacZ等位基因示意圖

二、主要儀器與試劑

（一）主要儀器

石蠟切片機（Leica 公司，德國）；純水機（Milli?pore 公司，美國）；顯微成像系統（Olympus 公司，日本）；Senograph 600T Senix HF X線機（GE公司，美國）。

（二）主要試劑

SHH 抗體（Santa Cruz 公司，美國）；RNA 酶、DNA酶、蛋白酶K以及TUNEL染色試劑盒來源于瑞士Roche公司；蘇木精、伊紅、阿利新藍染液、核固紅染液、DAB顯色劑以及檸檬酸鹽抗原修復液來源于美國Sigma 公司；35S?UTP（Amersham Biosciences 公司，美國）。

三、樣本收集與切片制備

將10 日齡小鼠行安樂死（吸入麻醉后頸椎脫臼）后取脛骨組織，受精15.5天孕鼠行安樂死后取胎鼠脛骨組織。隨后依次進行4%多聚甲醛固定、EDTA 脫鈣、梯度酒精脫水、透明及浸蠟包埋等操作，最終制作5 μm石蠟切片備用。

四、組織學分析

取10日齡Col10a1Cre/+;Ihhnull/C小鼠脛骨組織石蠟切片，常規脫蠟、水化后，入1%阿利新藍染液（pH 2.5）染色30 min，流水沖洗5 min 后，再入0.1%核固紅染液復染10 min，又經流水沖洗1 min 后，依次進行梯度酒精脫水、透明、中性樹脂封片。軟骨基質中的酸性黏液物質能夠與阿利新藍結合，呈現亮藍色。

取受精15.5 天胎鼠（Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/C和Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/+）或10 日齡小鼠（Col10a1Cre/+;R26SmoM2/M2和Col10a1Cre/+）脛骨組織石蠟切片，常規脫蠟、水化后，蘇木精染液染色5 min，分化液分化3 min后自來水沖洗，而后入伊紅染液1 min，依次進行梯度酒精脫水、透明、中性樹脂封片。

五、原位雜交

（一）探針制備

Ptch1?E3的cDNA 來源于香港大學Kathryn S.E.Cheah 教授；Ihh的cDNA 來源于哈佛大學Andrew P.McMahon 教授；Ptch1的cDNA 來源于麻省總醫院Henry M.Kronenberg 教授；Cre的cDNA 來源于南加州大學Takahiro Ohyama 教授；Gli1的cDNA 來源于多倫多大學Chi?chung Hui 教授；Col1a1的cDNA 來源于弗朗西斯·克里克研究所Robin Lovell?Badge 教授。經限制性內切酶消化、PCR 擴增，同位素35S?UTP標記和純化后，分裝保存于-80 ℃冰箱備用。

（二）原位雜交

預雜交：取受精15.5 天胎鼠（Col10a1Cre/+;Ptch1LacZ/C和Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/+）或10 日齡野生型小鼠脛骨組織石蠟切片行常規脫蠟復水后，蛋白酶K消化5 min，再浸入中性多聚甲醛固定液3 min，經洗滌后浸入乙酸酐溶液10 min，并洗滌、梯度酒精脫水，最后晾干備用。雜交：用雜交液稀釋探針，覆蓋組織，放入濕盒，在55 ℃孵育16～20 h。雜交后充分洗滌，并脫水晾干，最后進行顯影拍照。

六、免疫組化染色

取10日齡野生型小鼠脛骨組織石蠟切片，行常規脫蠟復水后，浸入檸檬酸鹽抗原修復液，煮沸繼續加熱2 min后自然冷卻，隨后在3%H2O2溶液中浸泡10 min以滅活內源性過氧化物酶，經BSA封閉30 min后，一抗4 ℃孵育過夜，復溫，二抗室溫孵育1h，DAB顯色，蘇木精復染及中性樹脂封片。

七、TUNEL染色

取受精15.5 天胎鼠（Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/C和Col10a1Cre/+;Ptch1LacZ/+）脛骨組織石蠟切片，經常規脫蠟復水后，按照TUNEL 試劑盒說明書進行染色操作，最后于熒光顯微鏡下進行觀察，對比分析肥大軟骨細胞的凋亡水平。

八、影像學檢查

將4 周齡Col10a1Cre/+; Ihhnull/C小鼠和Col10a1Cre/+;Ihhnull/+小鼠麻醉并擺好姿勢后，使用Senograph 600T Senix HF X 線機對小鼠全身進行掃描，對比分析小鼠的骨骼發育狀況。

結 果

一、IHH信號通路相關分子的表達特征

我們用原位雜交和免疫組化的方法檢測野生型小鼠出生后Ihh的表達特點，結果（圖2）顯示小鼠10日齡時，Ihh在肥大軟骨細胞中大量表達，合成的IHH 蛋白主要分布于細胞外基質內。肥大軟骨細胞不表達Ptch1和Gli1，而其周圍細胞，如軟骨-骨交界及骨小梁區域的部分細胞則高表達Ptch1和Gli1。

圖2 10日齡野生型小鼠脛骨生長板區IHH信號通路相關分子的表達特征（HZ：生長板肥大層） a：Ihh的原位雜交結果；b、c：IHH蛋白的免疫組化結果，其中c為b中黑色框選區域的高倍圖；d：Ptch1的原位雜交結果；e：Gli1的原位雜交結果

二、抑制肥大軟骨細胞合成IHH 損害軟骨內成骨過程

與對照組小鼠相比，Col10a1Cre/+;Ihhnull/C小鼠在4周齡時呈現明顯的短肢侏儒的表現（圖3 a）。X 線檢查結果也顯示該小鼠骨骼發育異常，表現為胸廓狹小、球形頭骨及椎骨發育異常（圖3 b）。股骨遠端及脛骨近端明顯的異常表現提示抑制肥大軟骨細胞合成IHH蛋白可能損害軟骨內骨化過程。

圖3 抑制肥大軟骨細胞合成IHH 導致骨骼發育異常 a：4 周齡Col10a1Cre/+; Ihhnull/C小鼠與對照小鼠（Col10a1Cre/+; Ihhnull/+）的大體形態觀察；b：4周齡Col10a1Cre/+; Ihhnull/C小鼠與對照小鼠（Col10a1Cre/+; Ihhnull/+）全身X線掃描結果，箭頭所指黃色圈選區域顯示小鼠股骨遠端和脛骨近端結構

隨后，我們通過阿利新藍染色對10 日齡Col10a1Cre/+;Ihhnull/C小鼠脛骨近端組織進行分析后發現其生長板和骨小梁結構紊亂。并且在生長板下方出現一混雜著軟骨和骨小梁組織的膨大區域（圖4）。

圖4 10 日齡Col10a1Cre/+;Ihhnull/C小鼠脛骨組織阿利新藍染色結果顯示軟骨內成骨異常，黑色框選區域顯示混雜著軟骨組織與骨小梁組織的膨大區域

三、IHH 信號通路持續啟動不影響肥大軟骨細胞終末分化

為了驗證Col10a1Cre/+;Ptch1LacZ/C小鼠是否構建成功，我們在受精15.5天胎鼠脛骨組織中采用原位雜交的方法檢測Cre、Ptch1?E3和Ptch1等基因的表達水平。兩端肥大區軟骨之間為晚期肥大軟骨細胞。CremRNA嚴格表達于肥大軟骨細胞中，證明了基因敲除的特異性（圖5 a、d）。晚期肥大軟骨細胞截短的Ptch1表達上調證明基因敲除成功，IHH信號通路順利啟動（圖5 b、c、e、f）。

圖5 Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/C 小鼠模型的評估（LHZ：晚期肥大軟骨區，即星號指示區域），胚胎15.5 天，Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/C 小鼠（a～c）與對照組（Col10a1Cre/+ ; Ptch1LacZ/+ 小鼠）（d～f）脛骨組織的Cre（a、d），Ptch1?E3（b、e）和Ptch1（c、f）的原位雜交結果

胚胎15.5 天時，Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/C小鼠的脛骨形態結構與對照組相似（圖6 a、e）。而且與對照組相比，該小鼠的Ihh（preHCs 和HCs 的標志物）和Col1a1（成骨細胞的標志物）的表達特征均未發生改變（圖6 b、c、f、g）。另外，肥大軟骨細胞的凋亡水平也未發生改變（圖6 d、h）。

圖6 IHH 信號通路持續啟動不影響軟骨細胞終末分化：受精15.5 天Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/C 胎鼠（a～d）與對照組（Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/+ 胎鼠）（e～h）脛骨組織的HE染色結果（a、e），Ihh（b、f）和Col1a1（c、g）的原位雜交結果以及TUNEL染色結果（d、h）

四、IHH 信號通路持續啟動導致出生后骨骼發育異常

雖然肥大軟骨細胞中IHH 信號通路啟動的小鼠在胚胎15.5天時未出現異常表現，但是我們對出生后的Col10a1Cre/+;R26SmoM2/M2小鼠脛骨進行組織學分析時發現除骨小梁結構發生輕微改變外，骨內膜以及皮質骨均出現了明顯的發育異常；與對照組小鼠相比，該小鼠皮質骨厚度下降，而且在骨內膜上發現了一些異常聚集的細胞，細胞形態相似，體積較大，細胞核較大，而且排列擁擠、無序，具有腫瘤細胞的一般特征（圖7）。

圖7 Col10a1Cre/+; R26SmoM2/M2小鼠出生后骨骼發育異常，10日齡Col10a1Cre/+; R26SmoM2/M2小鼠（a～c）和對照組（Col10a1Cre/+小鼠）（d～f）脛骨組織的HE染色結果，星號指示小鼠骨小梁（a、d），皮質骨（b、e）和骨內膜（c、f）的結構，黃色框選區域為星號指示區域的高倍圖像

討 論

近年來，軟骨內成骨過程中肥大軟骨細胞的分化方向一直是研究熱點。細胞譜系追蹤研究已經證實肥大軟骨細胞是成骨細胞的另一來源并參與骨形成［3，5?6］，逐漸改變了凋亡是肥大軟骨細胞最終歸宿這一固有認識。然而肥大軟骨細胞轉分化過程的重要意義與潛在的調控機制仍有待闡明。鑒于IHH信號通路在骨軟骨生長發育中發揮了關鍵的調控作用，我們推測該通路可能對軟骨細胞轉分化過程具有調控功能。本研究通過構建基因修飾小鼠，特異性地調節肥大軟骨細胞及其子代細胞中的IHH 信號通路的活性，探究IHH信號通路在軟骨細胞成熟以及轉分化過程的調控作用。

一、肥大軟骨細胞分泌的IHH 蛋白對軟骨內骨化過程具有關鍵調控功能

首先我們明確了IHH 信號通路相關分子在軟骨內骨化過程中的表達特征，IHH 在胚胎早期階段主要由前肥大軟骨細胞表達［21］。我們在10 日齡野生型小鼠脛骨生長板區域觀察到肥大軟骨細胞也能夠合成分泌IHH 蛋白，但卻不表達Ptch1和Gli1。Ptch1和Gli1均是IHH信號通路的下游靶基因，能夠顯示該通路的啟動狀態。這一結果表明肥大軟骨細胞不是IHH蛋白的響應細胞，可能不接受IHH信號通路的調控。然而不可忽視的是，臨近肥大區軟骨的軟骨-骨交界及骨小梁區域的部分細胞高表達Ptch1和Gli1，因此我們推測肥大軟骨細胞分泌的IHH蛋白以旁分泌的形式影響周圍細胞IHH信號通路的活性，從而參與調控軟骨內骨化過程。

隨后，我們構建了肥大軟骨細胞特異性Ihh基因敲除小鼠，以探究肥大軟骨細胞分泌的IHH蛋白的具體功能。我們觀察到在敲除Ihh基因后，小鼠出現了明顯的骨骼發育異常，進一步證實來源于肥大軟骨細胞的IHH 蛋白對胚胎晚期以及出生后小鼠的軟骨內骨化過程具有關鍵的調控功能。

二、IHH 信號通路不參與調控軟骨細胞終末分化但對其轉分化過程具有重要調控作用

為探究IHH 信號通路對肥大軟骨細胞成熟分化的影響，我們構建了兩種基因修飾小鼠（Col10a1Cre/+;R26SmoM2/M2小鼠和Col10a1Cre/+;Ptch1LacZ/C小鼠），持續啟動肥大軟骨細胞及其子代細胞中的IHH信號通路。前期研究中我們發現在胚胎15.5天時，表達Col10a1的肥大區軟骨之間存在著Col10a1表達顯著下調、主要表達Mmp13的一群肥大軟骨細胞［3］。這群細胞是肥大軟骨細胞的終末分化階段，在軟骨內骨化過程中能夠進一步分化成為成骨細胞，我們將其定義為晚期肥大軟骨細胞［3］。結果顯示，持續啟動IHH信號通路后胎鼠脛骨組織的形態結構、肥大軟骨細胞和成骨細胞的標志物以及肥大軟骨細胞的凋亡水平均未發生明顯變化。這些結果再次證實肥大軟骨細胞不接受IHH 信號通路的調控，IHH 信號通路不參與調控軟骨細胞的終末分化過程。然而出生后小鼠骨小梁、皮質骨以及骨內膜結構的顯著異常則表明持續啟動的IHH 信號通路會影響軟骨細胞的轉分化，損害軟骨內骨化過程。

三、持續啟動IHH信號通路促進腫瘤形成

當肥大軟骨細胞中的IHH 信號通路持續啟動時，我們在出生后小鼠脛骨骨內膜區域觀察到一群異常聚集的細胞，這些細胞形態相似，體積較大，細胞核較大，而且排列擁擠、無序，具有腫瘤細胞的一般特征。據此，我們初步推測骨內膜上的細胞團可能是腫瘤組織。與之相符的是，IHH 信號通路具有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡以及促進腫瘤發生的功能作用。在軟骨內骨化過程中，該通路能夠直接促進生長板軟骨細胞不斷增殖從而維持生長板長度［21］。除此之外，IHH 信號通路能夠通過調節細胞周期因子發揮致癌作用［22?23］。先前的研究表明抑制PTCH1 或者持續啟動SMO 均會導致與IHH 信號通路相關的腫瘤發生過程［24］。因此我們推測骨內膜上異常的細胞團是肥大軟骨細胞的子代細胞在IHH信號通路持續刺激下異常增殖的結果。

骨腫瘤是比較常見的原發性骨骼病變，其中包括良性腫瘤以及惡性的骨軟骨肉瘤［25?26］。近期，研究人員利用間充質干細胞、軟骨細胞和成骨細胞特異性基因修飾小鼠對骨腫瘤的細胞來源進行了相應的研究。在Prx1+間充質干細胞中敲除Ptch1基因后會導致內生軟骨瘤及骨肉瘤的發生［23］；在Ctsk+間充質干細胞中敲除Ptpn11也會導致內生軟骨瘤的發生［27］；在表達Col2a1的軟骨細胞中抑制FGFR3 和LKB1的活性會導致臨近生長板的軟骨腫瘤［28?29］；分別在表達Osterix和Col1a1的成骨細胞中沉默p53和Rb基因則會導致骨肉瘤的發生［30?32］。耐人尋味的是，我們的研究也發現在晚期肥大軟骨細胞中持續啟動IHH 信號通路會導致具有腫瘤細胞特征的細胞團出現。這表明軟骨細胞轉分化過程的異常調控具有一定的病理學意義，而晚期肥大軟骨細胞可能是某些骨腫瘤形成的前體細胞。

綜上所述，IHH 信號通路在軟骨內骨化過程中具有不可或缺的功能作用。雖然該通路不參與調控肥大軟骨細胞的終末分化，但其在軟骨細胞的轉分化過程中具有重要的調控作用。