外泌體與非癡呆型血管性認知障礙的研究進展

梁紫君，鄭 娜，張雪兒綜述，安紅偉審校

0 引 言

隨著我國人口老齡化的加劇、腦卒中發病率的提高，血管性認知障礙(vascular cognitive impairment, VCI)的發病率顯著增加，引起廣泛關注和重視。VCI是指與腦血管疾病相關的所有形式的認知障礙，可分為3種亞型：非癡呆型血管性認知障礙(vascular cognitive impairment no dementia, VCIND)、血管性癡呆(vascular dementia, VaD)和混合性癡呆[1]。VCIND是VCI的早期階段，其認知障礙還未達到癡呆水平。VCIND是我國最常見的輕度認知功能障礙亞型，占總病例的42.0%[2]。有研究報道，50%的VCIND患者在5年的隨訪中發展為癡呆[3]。另外，Tang等[4]對香港大學附屬地區醫院的328例急性腦梗死患者進行研究，發現有180例在3個月后患VCIND；對其中的143例VCIND患者進行15個月的隨訪，發現29例受試者可從認知障礙(非癡呆癥)恢復到正常認知狀態(返回者)，不返回者和進展為癡呆癥的受試者分別為98例和16例。因此，及時發現和干預VCIND，可延緩VCI進程，對提高患者生存質量、減輕家庭和社會負擔，具有極大的必要性和重要性。

近年來，外泌體逐漸成為醫學領域研究的一大熱點，越來越多研究表明其各系統疾病的診斷、預后判斷和治療等方面均表現出作為生物標志物的巨大潛力。因此，了解外泌體及其所攜帶分子對神經血管的作用機制，根據外泌體的性質挖掘其潛在的應用價值，這有望在VCIND的診療方面發揮極大的優勢。本文外泌體與VCIND研究進展作一綜述。

1 外泌體概述

1.1 生物學特性1987年，Johnstone等[5]在研究網織紅細胞的成熟過程中，發現了一種可分泌到細胞外面的膜型囊泡，并將其命名為外泌體。外泌體是細胞通過“內吞-融合-外排”等調控過程而形成的胞外納米級多泡體，其本質是一種直徑約為30～150 nm的脂質雙層囊泡。目前已證實外泌體內含物主要包括蛋白質、脂質和核酸等多種生物活性成分。外泌體中普遍存在的蛋白質包括四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)和熱休克蛋白70等, 這些蛋白質常作為外泌體標記物。外泌體富含膽固醇、磷脂、磷脂酰絲氨酸和前列腺素等脂質，包含的核酸主要有mRNA、miRNA、DNA等。由于miRNA在基因表達中重要的調節作用，所以外泌體miRNA也被廣泛研究。2007年Valadi等[6]首先發現了外泌體中存在miRNA，并且可轉移到受體細胞中從而發揮相關的作用。外泌體已被發現可由多種細胞產生并釋放，還可從血液、腦脊液、唾液、尿液、精漿等多種人體體液中檢測和分離，在許多疾病的研究中顯示出重要的潛在價值[7-8]。

1.2 生物學功能作為細胞-細胞交流媒介，外泌體最為重要的生理作用是細胞間的信號轉導和物質傳遞，其作用機制為：外泌體可作為一種信號復合體通過受體介導直接刺激靶細胞；外泌體可轉運蛋白質、核酸等生物活性成分進入靶細胞內，通過影響靶細胞基因轉錄和翻譯，調節細胞信號通路，從而改變受體細胞表型和影響細胞功能狀態[9]。外泌體在體液中高度穩定，具有來源廣泛、易獲取、具有非侵襲性的優勢。研究發現，外泌體具有穿越血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)的能力[10]，在神經保護及可塑性、血管新生、免疫應答等方面具有重要的生物學功能。因此，我們可通過獲取其分子內容物研究大量原始細胞生理和病理狀態下信息。

2 外泌體在VCIND發生發展中的作用

VCIND多有腦血管危險因素(如高血壓、糖尿病和高血脂癥等)，或有明顯(如腦梗死和腦出血等)或不明顯的腦血管病史(如白質疏松和慢性腦缺血)，與血管性腦組織損傷存在密切關系。而這些危險因素和腦血管病的發生可引起或加重VCIND，影響著VCIND的發生與發展。VCIND有著各種復雜的生理病理機制，神經血管單元的概念的出現讓我們以大腦的整體性的視覺來看待VCIND這一疾病。神經血管單元(neurovascular unit, NVU)是由神經元、血管細胞(即內皮細胞、周細胞和血管平滑肌細胞)、膠質細胞(即星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞)組成。NVU控制BBB滲透性和腦血流量，并維持神經元環境的化學成分，這是神經元回路正常運作所必需的[11]。各組分之間緊密聯系，組分的完整性對大腦功能的正常發揮具有重要意義。外泌體在NVU中對信號傳遞有著重要作用，通過作用于靶細胞而促進疾病的發生與恢復，而這些信號傳遞通路中可能存在VCIND治療和藥物研發的潛在靶點。

2.1 外泌體與缺血后神經損傷當腦血管堵塞或破裂時，形成血液循環障礙，誘發腦組織由于缺血缺氧而死亡，最終可導致認知障礙的發生。星形膠質細胞是大腦中BBB結構的主要成分，并參與BBB完整性和血流量的調節，其功能受到腦微血管內皮細胞的外泌體調控。有研究發現，氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation, OGD)條件下培養的內皮細胞所產生的外泌體通過調節PI3K/Akt途徑抑制星形膠質細胞的增殖，下調星形膠質細胞活化的標志物膠質纖維酸性蛋白，促進星形膠質細胞的凋亡，從而加劇BBB破壞，減少局部腦血流量，導致梗塞體積增加和神經功能缺損[12]。Zhang等[13]在創傷性腦損傷大鼠模型中發現，外泌體可顯著增加大腦缺血病變邊緣區和齒狀回新生內皮細胞的數量，以及提高齒狀回新生的未成熟和成熟神經元的數量，減少神經炎癥，促進神經血管的重塑，從而改善認知功能。以上研究結果表明，外泌體參與缺血后神經損傷的的調節。

2.2 外泌體與神經可塑性及保護作用在缺血缺氧環境刺激下，外泌體可通過促進神經突起再生而參與神經細胞重塑，減少神經細胞變性，對受損神經進行修復和保護。有研究顯示，使用過表達miR-133b的間充質基質細胞分泌的外泌體，能促進OGD情況下星形膠質細胞外泌體的二次釋放，明顯促進大腦中動脈閉塞大鼠大腦神經軸突的生長和伸長，提高腦卒中后的神經可塑性和促進功能恢復[14]。同時，缺氧缺血產生的炎性作用會刺激星形膠質細胞釋放外泌體，其中起到保護作用的除miRNA還有外泌體所攜帶的蛋白質，如朊蛋白可提高神經元在氧化應激狀態下的存活率，從而實現神經保護作用[15]。

2.3 外泌體促進動脈粥樣硬化的形成動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)與血管性認知障礙相關[16]。有研究表明，頸動脈粥樣硬化會造成血管狹窄而導致血流動力學異常和腦供血不足，與VCI密切相關，是VCI的獨立危險因素之一[17]。在一項探討急性缺血性卒中患者頸動脈狹窄與認知障礙之間的潛在聯系的橫斷面研究中，頸動脈高度狹窄患者患認知障礙的可能性是無頸動脈狹窄患者的1.49倍，而且其認知障礙與右頸動脈高度狹窄更相關[18]。而高血壓、糖尿病、高血脂癥、高同型半胱氨酸等腦血管疾病危險因素均可導致血管內皮破壞而促進動脈粥樣硬化，造成腦血管狹窄或閉塞，局部腦血流量減低，導致大腦的新陳代謝受到損害而影響VCIND的發生和發展。

作為VCI、VCIND的重要病理原因，動脈粥樣硬化是一種血管壁的慢性炎性反應性疾病，主要病理表現為炎性細胞浸潤，脂質沉積，細胞增殖和凋亡；最初形成脂紋，最終形成脂質粥樣斑塊，斑塊的出血、破裂可引起腦血管損壞而導致認知障礙。有研究表明，外泌體作為血細胞和血管組織之間交流的媒介，參與AS的介導炎癥、氧化應激和細胞凋亡等過程[19]。CD137修飾的內皮細胞的外泌體(CD137-Exo)通過NF-КB途徑介導促炎性細胞因子IL-6表達，觸發Th17細胞分化，促進AS的形成[20]。另外，血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)的外泌體介導KLF5誘導的miR-155從平滑肌細胞向內皮細胞轉移，破壞緊密連接和內皮屏障的完整性，導致內皮損傷從而促進動脈粥樣硬化[21]。此外，含有miR-223，miR-339和miR-21的活化的血小板源性外泌體可以轉移到VSMC中并抑制血小板衍生的生長因子受體β的表達，誘導血小板聚集，介導凝血途徑，從而促進AS的形成[22]。炎癥反應是AS的重要病理過程，因此及時抗炎可以延緩AS所致的疾病進程，降低相應器官功能的損害。有研究發現，分子工程M2巨噬細胞衍生的外泌體通過表面結合的趨化因子受體和從抗炎M2巨噬細胞釋放的抗炎細胞因子，表現出良好的趨炎和抗炎作用；此外，被包裹的5-氨基乙酰丙酸己酯鹽酸鹽可進行血紅素的內源性生物合成和代謝，產生抗炎的一氧化碳和膽紅素，從而進一步增強抗炎作用并最終緩解AS[23]。以上研究結果表明，外泌體對AS有著重要的參與作用。

2.4 外泌體促進血管新生和修復外泌體參與腦血管損傷后的血管修復和血管再生過程。Xu等[24]研究發現，神經元通過分泌含有miR-132的外泌體作用于血管內皮細胞中Eef2k基因，進而抑制Eef2k基因的表達從而上調血管連接蛋白Cdh5分子表達，調節血管完整性。在局灶性腦缺血小鼠模型中，下調腦血管中miR-15a的水平，可提高成纖維細胞生長因子2和血管內皮生長因子的表達水平，從而促進缺血性腦卒中后周邊區域的血管生成[25]。另一項研究發現，人腦微血管內皮細胞和人臍靜脈內皮細胞來源的外泌體分泌的δ樣蛋白4，能刺激周細胞上的Notch3受體，維持腦血管結構穩定和調節血管形成[26]。

2.5 外泌體與Aβ及tau蛋白的關系β-淀粉樣蛋白(β- amyloid, Aβ)的異常沉積和tau蛋白過磷酸化是阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)的主要病理學特征。研究發現，腦血管疾病與AD之間有著密切的關系[27]，且血管性認知障礙與AD有著重疊的危險因素及病理改變(如Aβ聚集和tau纏結等)。有研究表明，缺血誘導的Aβ42/ tau病理改變可能與腦卒中后認知功能障礙的發生發展有關[28]。由此猜測，在缺血缺氧的條件下，神經血管單元受到破壞，引起Aβ的異常沉積和tau蛋白磷酸化改變而造成神經退行性變，導致認知功能減退。外泌體可自由穿過血腦屏障，能攜帶來源細胞的某些特異性物質穩定存在血液等體液中，這對研究血漿外泌體與認知障礙之間的關系有很大的價值。

近年來大量研究表明外泌體可通過調節Aβ的沉積和tau蛋白磷酸化，從而影響認知障礙的發生發展。在體外實驗中，小膠質細胞外泌體中的miR-124-3p(EXO-124))可通過靶向Rela基因，發揮促進Aβ分解的作用，從而抑制Aβ異常[29]。神經纖維纏結是tau蛋白過度磷酸化造成的。有研究表明，AD患者中的外泌體可通過不同的機制招募與神經退行性變相關的線粒體蛋白和軸突發生蛋白，促進tau蛋白過磷酸化[30]。此外，Mullins等[31]研究發現外泌體可通過胰島素抵抗途徑參與神經元凋亡；與對照組相比，在AD患者中神經源性的血漿外泌體含有更高的pSer312-IRS-1(無效胰島素信號蛋白)和更低的p-panTyr-IRS-1(有效胰島素信號蛋白)，前者與腦體積成負相關，可引起Aβ沉積和tau異常磷酸化。這些研究表明，外泌體可通過不同的途徑參與β-淀粉樣蛋白和tau蛋白的調節，影響認知障礙的進展。

3 外泌體在VCIND診斷中的潛在應用

研究表明，外泌體不僅與VCIND的發生演進密切相關，而且在診斷中也發揮著重要作用。近年來，越來越多的研究表明外泌體具有作為疾病的早期診斷及預后的生物標志物的潛在優勢。在中樞神經系統中，外泌體能夠成為診斷標志物可能有以下幾方面的原因[32]：第一，在疾病過程中，外泌體的內容物(核酸、蛋白質和脂質)會發生變化；第二，外泌體可無創性地從易獲得的血液、尿液等體液中分離出來，這有利于疾病早期診斷的檢測；第三，外泌體可通過BBB，可提供有關中樞神經系統細胞的信息；第四，外泌體具有比較穩定的膜結構，保護其內含物質不容易降解，而且外泌體高度穩定，可長期保存；第五，不同細胞分泌的外泌體具有不同的特性，根據其特性可判斷外泌體的組織細胞來源。

有研究發現，無癥狀性頸動脈狹窄(管腔狹窄率> 50%)患者的血漿外泌體miR-199b-3p、miR-27b-3p、miR-130a-3p、miR-221-3p和miR-24-3p明顯增高，可作為無癥狀性頸動脈狹窄進展的生物標志物[33]。趙維納等[34]通過采集68例VCI患者血樣，發現血漿外泌體miR-29c表達量越高，MoCA評分越低，FA、VitB12 水平越低，Hcy、CRP水平越高，認知功能損傷越嚴重，這提示血漿外泌體miR-29c具有作為VCI診斷候選生物標志物的潛能。Kenny等[35]研究發現，MicroRNA Let-7b和miRNA-206的表達水平在輕度認知障礙(mild cognitive impairment, MCI)和AD患者的血漿中均升高，其中前者水平升高可用于識別MCI患者，而后者與認知功能衰退和記憶缺陷有很強的相關性，5年的縱向隨訪發現miRNA-206在癡呆癥發病前增加，因此miRNA-206血漿水平的變化可用于預測MCI階段認知功能下降和癡呆的進展。黃菁菁等[36]通過分析比較有癡呆或嚴重認知功能障礙的老年患者和無癡呆或嚴重認知功能障礙的老年患者血漿中MiRNA210的表達水平，發現前者血漿中MiRNA210的表達水平明顯高于后者。另外有研究發現，血液中神經源性外泌體中的提取物P-S396-tau、P-T181-tau和Aβ1-42的水平可預測阿爾茨海默病的發生，最長可在臨床發病前10年出現陽性表達[37]。

綜上所述，外泌體及其相關成分可為探索VCIND診斷的分子標志物提供依據，在VCIND診斷和預防方面具有潛在價值。

4 外泌體在VCIND治療中的潛在作用

有關外泌體對VCIND治療方面的研究目前尚處于基礎研究階段。一系列研究表明，外泌體能通過血腦屏障，具有將分子特異性物質輸送至中樞神經系統的潛力，有望成為一種新型治療性運載工具。Toyama等[38]通過建立血管認知障礙的小鼠模型，發現TNFα-miR-501-3p-ZO-1軸在腦低灌注引起的工作記憶障礙和腦白質損傷的發病機制中起重要作用。因此抑制miR-501-3p有可能成為治療慢性腦低灌注所致血管性認知障礙的一種潛在新療法。由此推測，以與損害血腦屏障相關的miRNA作為作用靶點，可以通過改善BBB功能障礙來改善認知障礙。另外，間充質干細胞和造血干細胞具有強大的外泌體產生和釋放能力。已有大量研究證實，間充質干細胞可通過分泌相關外泌體因子促進腦損傷后的血管生成、神經發生和白質重塑，而經改造的造血干細胞分泌的外泌體可促進梗死區域周圍的血管新生及神經功能恢復[39]。

5 結 語

近年來，越來越多的研究證實外泌體在血管性認知障礙的發生、發展過程中發揮著重要的調控作用，且研究主要集中在腦缺血后的損傷修復機制方面。外泌體在VCIND中的診療方面展示出極大的應用潛力，但研究仍處于起步階段，依然存在很多問題尚未解決，如外泌體攜帶的特異性內容物對VCIND的作用機制尚未完全闡明；目前外泌體中的RNA研究主要集中在miRNA，其他特異性RNA的發現很少等。探索外泌體與VCIND疾病之間的關系，將會為VCIND的發病機制提供新的思路，為VCIND的診療和預防帶來新的希望。