三陰性乳腺癌的表觀遺傳學研究進展

張凌燕，阮祥燕

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院內分泌科，北京100026)

乳腺癌是全球范圍內女性患病率最高的惡性腫瘤，也是我國女性癌癥死亡的最常見原因[1]。Perou等[2]分析了包含8 102個基因的互補DNA芯片，通過檢測雌激素受體、孕激素受體和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，HER)2的表達，發現了乳腺癌的4個分子亞型，并用于分層靶向治療。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是一類基于分子分型的特殊類型乳腺癌，2005年首次對TNBC進行了描述[3]。由于TNBC缺乏雌激素受體、孕激素受體和HER2，因此無法接受激素或抗HER2藥物治療。TNBC具有特殊的生物學表達和臨床病理特性，其病理特點包括高分級、浸潤性擴散以及高有絲分裂率，表現為高級別的浸潤性導管癌及區域性壞死，TNBC的局部復發率和遠處轉移率均高于其他類型乳腺癌[4]。有證據表明，表觀遺傳調控可能在乳腺癌的發展中發揮重要作用，有助于乳腺癌的異質性和轉移，尤其是TNBC[5]。表觀遺傳學研究是在不改變DNA序列的情況下研究基因表達的可遺傳變化，而表觀遺傳學是T細胞分化的關鍵機制[6]。Schoenborn等[7]證明，輔助性T細胞1和輔助性T細胞2是不同的譜系，而不是細胞因子表型移位。最早記錄的表觀遺傳學修飾是DNA甲基化和組蛋白修飾[8]，其他還包括非編碼RNA和染色質重構。現就TNBC的表觀遺傳學研究進展予以綜述。

1 DNA甲基化與TNBC

DNA甲基化是細胞進化的先決條件，也是許多病理機制發生的根源。DNA甲基轉移酶(DNA methylation transferases，DNMTs)主要在選定基因啟動子的CpG二核苷酸環境中催化胞嘧啶-C5的甲基化，其中DNMT1負責復制后甲基化模式的維持，DNMT3a和DNMT3b啟動從頭甲基化[9]。通過DNA甲基化分析檢測乳腺癌的靈敏度是利用細胞學檢測乳腺癌的2倍，將DNA甲基化分析與細胞學檢測相結合，檢測乳腺癌的準確度可達100%[10]。有研究通過分析69個癌癥相關基因中110個CpG島的高甲基化發現，TNBC中含有5個基因的甲基化和11個基因的非甲基化，其中甲基化DNA-蛋白質半胱氨酸甲基轉移酶、復制后DNA錯配修復系統、DNA結合蛋白抑制劑ID-4與TNBC的相關性最強[11]。最全面的TNBC甲基化分析可以根據不同甲基化區域將患者樣本分層為三個不同水平，TNBC甲基化程度與預后相關[12]。與高甲基化組相比，低甲基化組患者在診斷后的前5年生存率更高，而中甲基化組患者的生存率最低；同時，最全面的TNBC甲基化分析鑒定出17個獨立的不同甲基化區域，根據這些不同的甲基化區域可將TNBC患者分為預后良好和預后不良組；其中甲基化區域包括Wilms腫瘤蛋白基因及Wilms腫瘤蛋白反義基因，Wilms腫瘤蛋白及其反義基因高水平的甲基化與TNBC生存率低相關；雙向啟動子的高甲基化與Wilms腫瘤蛋白及Wilms腫瘤蛋白反義基因表達減少、存活率提高有關[13]。然而，這些發現仍有待更大的隊列研究證實。

約30%的TNBC患者具有乳腺癌基因(breast cancer gene，BRCA)1突變，且通常預后較差[14]。10%～20%的TNBC患者存在種系BRCA突變，在野生型BRCA患者中，同源重組的體細胞突變也能產生類似的突變表型，這種狀態被稱為BRCAness[12]。同源重組的體細胞突變可能是由BRCA1基因啟動子區域的高甲基化導致[14]。癌癥基因組圖譜網絡描述了基底細胞型乳腺癌的低甲基化表型，該亞型的DNA甲基化程度最低，且與80%的細胞瘤抗原p53突變相關，且常與視網膜母細胞瘤相關蛋白和BRCA的缺失相關[15]。在TNBC與非TNBC中，BRCA1和BRCA2啟動子的甲基化無顯著差異，而非甲基化基因DNA結合蛋白抑制劑ID-4是BRCA1的負調控因子[16]，這可能成為一種新的BRCA沉默機制。

乳腺癌干細胞(breast cancer stem cells，BCSCs)是TNBC侵襲性的重要驅動因素，通過研究啟動子甲基化對BCSCs的調控，可闡明DNA甲基化在TNBC中的作用。研究發現，與BCSCs特性相關的CD44、CD133和Musashi-1啟動子區域在原發性乳腺癌中被低甲基化，與TNBC及侵襲性乳腺癌相關[17]。Li等[18]從MDA-MB-231細胞培養中篩選出CD44+/CD24 BCSCs群，結果發現，BCSCs與非BCSCs的DNA及組蛋白甲基化均存在差異，特別是組蛋白3第4位賴氨酸的二甲基化(trimethylation of lysine 4 on histone H3，H3K4me2)和組蛋白3第27位賴氨酸的三甲基化(trimethylation of lysine 27 on histone 3，H3K27me3)在BCSCs中均減少，而H3K4me2、H3K27me3減少可能影響Wnt和促性腺激素釋放激素信號通路。雖然BCSCs在體內和體外均表現出更強的侵襲性和致瘤能力，但具體機制仍有待闡明。

2 組蛋白修飾與TNBC

組蛋白修飾是組蛋白翻譯后的共價鍵改變，可以激活或沉默基因表達，影響染色質結構和基因轉錄，是重要的表觀遺傳學標志。組蛋白修飾包括甲基化、磷酸化、乙酰化、泛素化和蘇酰化等。H3K4me1、H3K4me3、H3K9me3、H3K9ac、H3K27me3、H3K27ac、H3K36me3、H3K79me2八種關鍵性組蛋白修飾已在13個細胞系中被證實，其中的4個細胞系為TNBC MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-468和HCC1937[5]。一些組蛋白N端修飾與基因啟動子區的激活或沉默有關，組蛋白H3在賴氨酸殘基9和27(H3K9me3、H3K27me3)被多梳抑制復合物2甲基化是沉默染色質的標志，賴氨酸乙酰化(H3K9ac、H3K18ac、H4K12ac)、賴氨酸三甲基化(H3K4me3)、精氨酸二甲基化(H4R3me2)等特異性修飾是基因活化的標志，而賴氨酸甲基化(H3K9me2或H3K9me3和H4K20me3)通常與基因沉默有關[19]。

雖然TNBC的組蛋白修飾機制尚不完全清楚，但基于此理論基礎的治療已在臨床前研究中取得了一定進展。表觀遺傳療法是基于組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)和組蛋白乙酰轉移酶的理論基礎。HDAC從組蛋白中去除乙酰基，調控細胞凋亡及相關分化蛋白，進而調節基因表達的穩定性；同時，通過調控腫瘤抑制因子，誘導生長阻滯和分化[19]。HDAC抑制劑目前正在實體和血液惡性腫瘤中進行研究，可多途徑抑制腫瘤生長，如通過抑制血管內皮生長因子-D的表達，對抗淋巴管生成，抑制TNBC的淋巴轉移；通過增加周期蛋白依賴性激酶抑制因子的表達，減少細胞周期蛋白的含量，進而將腫瘤細胞阻滯于G1期或G2期，從而阻止腫瘤細胞的增殖或生長，誘導細胞凋亡[20]。研究表明，HDAC抑制劑亞磺酰苯胺異羥肟酸和丁酸鈉均可抑制TNBC細胞系MDA-MB-231和BT-549中p53突變體的細胞增殖、誘導細胞凋亡并下調轉錄[21]。奧拉帕尼和HDAC抑制劑(NCT023794、NCT01349959)聯合應用可協同抑制表達功能性人類第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因的TNBC細胞的生長，且奧拉帕尼與HDAC抑制劑的聯合作用在異體移植模型中已得到證實[22]，具有廣闊的臨床應用前景。

3 非編碼RNAs與TNBC

大數據轉錄分析表明，在約80%的人類基因組中只有約2%編碼蛋白質[17]。因此，絕大多數哺乳動物轉錄組包含的非編碼RNAs在各種基因表達調節和其他生物學過程作用中起重要作用。根據非編碼RNAs的大小、結構和調節特性其可分為兩類，即長度>200個核苷酸的長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)和長度<200個核苷酸的短鏈非編碼RNAs，其中短鏈非編碼RNAs又包括微RNA(microRNAs，miRNAs)、小核仁RNAs和Piwi蛋白相互作用RNAs[23]。miRNAs由于在腫瘤的生物發生、轉移及治療等領域均具有重要意義而被廣泛研究，而lncRNAs已成為發育過程(包括乳腺發育)的關鍵調控因子，lncRNAs失調與包括乳腺癌在內的各種癌癥的發生有關。

3.1lncRNAs與TNBC 對TNBC患者的微陣列分析研究發現，與正常組織相比，許多lncRNAs的表達模式不同[24]，但lncRNAs的具體功能、作用途徑及重要意義還有待進一步闡明。有研究報道了4個不同的lncRNAs集簇，第一個集簇幾乎完全由基底樣亞型組成，其中HOTAIR M1(HOXA transcript antisense RNA，myeloid-specific 1)在該簇中過表達[25]，但HOTAIR M1的作用仍有待確定。另一個有前景的lncRNAs靶點為Fox-1同源物1基因啟動子上游轉錄體，Fox-1同源物1可能是一種負責基底樣腫瘤侵襲性表型的促癌基因[26]。HOTAIR是一種通過H3K27甲基化與乳腺癌侵襲性進展相關的lncRNAs，HOTAIR在MCF-7-TNR細胞中上調，MCF-7-TNR細胞是管腔型MCF-7細胞的基底樣衍生物；另外，HOTAIR與其伴侶zeste同源物2形成復合物，在基底樣TNBC表型中發揮關鍵作用，當HOTAIR或zeste同源物2受到抑制時，管腔型及基底樣標志物的表達均減少，MCF-7-TNR細胞的增殖受到抑制[27]。

一項關于TNBC患者組織樣本中lncRNAs的微陣列圖譜研究發現，TNBC中雌激素受體的功能失調可能與lncRNAs LINC00993有關[28]。研究表明，lncRNAs肺腺癌轉移相關轉錄物1與TNBC的轉移潛能相關，并可作為TNBC的潛在預后標志物[29]。Liu等[30]通過整合miRNAs和lncRNAs信息，創新性地將TNBC分為四類，即免疫調節型、腔面雄激素受體型、間質型和底樣及免疫抑制型。這種分型方法與Lehmann和Pietenpol[31]的分型部分相同，其中免疫抑制型侵襲性最強。有文獻報道，在乳腺癌和其他癌癥的lncRNAs中，低甲基化發生率更高，lncRNAs EpIC1(epigenetically-induced lncRNA1)的低甲基化可上調腫瘤細胞的表達，而EpIC1過表達與患者的不良生存結局獨立相關，特別是基底樣亞型B乳腺癌，基底樣亞型B乳腺癌通過與MYC直接作用增加MYC靶基因的表達、促進細胞周期進程等，促進腫瘤生成[32]。

3.2miRNAs與TNBC miRNAs在腫瘤中有兩種作用形式，分別發揮抑制和促進腫瘤發生的作用，抑制腫瘤的miRNAs包括miR-200家族、miR-205家族和let-7家族等，促進腫瘤的miRNAs包括miR-155及miR-21等，因此miRNAs也是潛在的TNBC生物標志物。研究發現，miR-10b、miR-26a、miR-146a和miR-153在乳腺癌細胞系中的表達水平與BRCA1相關，在MDA-MB-231細胞中，BRCA1的表達水平被miR-10b和miR-26a下調，miR-146a在TNBC中顯著過表達但并不影響BRCA1的表達，而miR-153可以上調MDA-MB-231細胞中BRCA1的表達[33]。然而，Kumaraswamy等[34]的研究顯示，BRCA1的表達與miR-146a呈正相關，與HER2呈負相關。此外，Garcia等[35]報道，miR-146a和miR-146b-5p可下調TNBC中BRCA1的表達。Murria等[36]研究發現，miR-590-5p和miR-4417在TNBC中高表達，miR-590可以通過與雌激素受體的兩個信使RNA序列相互作用影響雌激素受體調控，而miR-4417可以調控BRCA1信使RNA。Gasparini等[37]在TNBC中發現了一個miRNAs組合，可以將患者分為高危組和低危組，其中miR-493和miR-155上調與患者預后良好相關，而miR-30a和miR-27a下調與患者預后不良相關。

另外，miRNAs也是上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的驅動因子，這是啟動TNBC轉移的一個重要過程。miR-200家族通過靶向EMT過程中的兩個關鍵基因[鋅指E盒結合同源框(zinc finger E-box-binding homeobox，ZEB)1和ZEB2]逆向調控腫瘤的EMT過程[37]。miR-200c、miR-141位點甲基化與TNBC中miR-200c的低表達及淋巴結浸潤有關，有利于腦轉移，進而影響TNBC患者的預后[38]。在小鼠乳腺癌異體移植模型中，miR-200b通過抑制蛋白激酶Cα抑制TNBC轉移；miR-200a還可通過調控磷酸化上皮細胞激酶2基因的表達調節TNBC遷移；而miR-200b-3p和miR-429-5p過表達通過抑制LIM激酶1/絲切蛋白1通路抑制TNBC細胞的增殖、遷移和侵襲[39]，為TNBC的靶向治療開辟了新視野。

近年，有學者將血液中的外泌體miRNAs作為診斷和評估癌癥患者預后的新型標志物[40]。外泌體含有大量的分子，如細胞類型特異性蛋白、脂質、信使RNA和豐富的miRNAs等。Meng等[40]發現，與非轉移性乳腺癌細胞和正常乳腺癌細胞相比，轉移性乳腺癌細胞中的外泌體miRNAs水平更高，其中miR-10a、miR-10b、miR-21、miR-27a、miR-155、miR-373均顯著上調；在小鼠模型中，MCF-10A細胞經MDA-MB-231細胞外泌體或乳腺癌患者來源外泌體處理后導致腫瘤發生[37]。Wei等[41]報道，MCF-7來源的外泌體可以呈劑量依賴性地促進宿主細胞增殖，外泌體miR-128特異性地通過靶向Bax基因增強MCF-7細胞的增殖。Wang等[42]發現，與非侵襲性MCF-7細胞釋放的外泌體相比，高侵襲性MDA-MB-231細胞釋放的外泌體可以刺激受體細胞產生更強的運動能力。

4 染色質重構與TNBC

染色質重構是指通過修飾染色質結構調控基因表達允許或限制轉錄，其可以通過對組蛋白或非編碼RNAs的轉錄后修飾以及對多梳抑制復合物2的招募或通過ATP依賴的染色質重構蛋白復合體來實現。SWI(mating-type switching)/SNF(sucrose fermentation)是與染色體重構相關的最常見的復合體之一。SWI/SNF的兩種ATP酶BRG1(brahma-related gene 1)和BRM(brahma)在乳腺癌中的水平均升高，其中BRG1在TNBC細胞系中的下調導致體內腫瘤形成減少，體外細胞增殖減少，而敲除BRG1導致TNBC細胞株對阿霉素、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、順鉑、環磷酰胺和紫杉醇的靈敏度增加[43]。

此外，有研究發現了亞型特異性組蛋白修飾譜，包括TNBC細胞系中獨特的H3K36me3模式[44]。另一個特異性TNBC染色質狀態是肌動蛋白纖維相關蛋白1-反義RNA1，其標記為H3K4me3和H3K79me2的活性修飾。有報道顯示，肌動蛋白纖維相關蛋白1-反義RNA1與TNBC無關，但其在食管腺癌、胰腺導管腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、結直腸癌等其他癌癥中高表達并預示預后不良；同時，肌動蛋白纖維相關蛋白1-反義RNA1也可能通過EMT促進腫瘤的侵襲[6]。在MDA-MB-231和HCC1937細胞中，小干擾RNA介導的肌動蛋白纖維相關蛋白1-反義RNA1缺失可導致細胞增殖和集落形成減少[44]。

5 小 結

TNBC因具有獨特的臨床病理和分子特征而備受關注。目前，化療仍是TNBC患者唯一有效的治療方法。由于TNBC患者表現出不同的治療反應和預后，TNBC患者的個體化治療和預后分析較困難，尤其是當TNBC患者的診治取決于常規的臨床和病理特征(包括組織學分級、原發腫瘤大小、淋巴結轉移以及雌激素受體/孕激素受體/HER2表達)時。分子分型破譯了不同亞型TNBC的特征，是實現靶向治療目的和(或)分層的必要前提。隨著靶向治療的出現，篩選更可靠的分子標志物迫在眉睫，而全面了解調控腫瘤生長的表觀遺傳學，有助于建立準確的TNBC分子分型和有效的治療方案。