腸道菌群對骨代謝性疾病作用機制的研究進展

鐘小惠，張烽，曹宏，王雪松

(1.江南大學無錫醫學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學附屬醫院a.骨科，b.功能食品臨床研究中心，c.營養科，d.內分泌科，江蘇 無錫 214122)

隨著老齡化社會進程的加快，骨代謝性疾病的患病率以及與年齡相關的骨折發生率越來越高[1]。骨骼具有自我修復和再生能力，骨重建主要是指由骨細胞參與，通過破骨細胞造成的骨降解，以及成骨細胞的骨形成過程。這一過程包括細胞的發育和激活以及信號通路的介導。骨代謝性疾病的發病機制復雜，涉及代謝、免疫、基因遺傳等方面，但骨代謝研究領域仍存在很多未知的問題。目前的研究表明，在成骨細胞分化增殖過程中，核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)通路、胞外信號調節激酶通路、骨形態發生蛋白-2/Smads通路和Wnt等信號轉導途徑起重要作用[2-3]。其中，RANKL通路可能存在3種途徑促進骨吸收，包括核因子κB途徑、c-Jun氨基端激酶途徑和蛋白激酶B途徑。此外，RANKL、核因子κB受體活化因子和骨保護素也參與了骨疾病相關免疫反應，但RANKL-骨保護素結合會阻斷RANKL-核因子κB受體活化因子結合，抑制骨吸收[3]。近年來，腸道菌群對骨疾病的影響逐漸引起眾多學者的關注，這為研究骨疾病的機制和診療帶來新方向。現就腸道菌群對骨代謝性疾病作用機制的研究進展予以綜述，以期為進一步研究腸道菌群在骨代謝性疾病中的作用提供參考。

1 腸道菌群概述

人體內存在著數萬億微生物，在約5 000個物種中，通過宏基因組組裝發現了150 000多個微生物基因組[4]，因此了解人體微生物有助于增加對健康和疾病的認識。包括人體微環境在內的幾乎所有環境中均有特定的微生物群落結構，1 000多種不同的微生物組成腸道菌群，其改變與人類多種慢性疾病有關，如糖尿病[5]、炎性腸病[6]、營養不良[7]和神經系統疾病[8]等。越來越多的學者開始關注腸道菌群或其代謝物對人體遠端器官的影響，通過回顧性研究發現，腸道菌群的改變可通過影響消化功能、內分泌功能、免疫功能、腸保護屏障和神經系統來調節骨代謝、生長因子和代謝通路，從而對骨質疏松癥、類風濕關節炎和骨關節炎等骨疾病產生重要影響[9]。

2 腸道菌群與骨代謝性疾病

腸道菌群的改變可作為骨代謝活性的生物標志物，藥物或益生菌調節腸道菌群具有改善骨結構和質量的潛力。腸道菌群的物種相對豐度每天根據飲食的變化而波動[10]，但總體能保持基本穩定。雖然研究表明腸道菌群可以對很多疾病的自然病程產生重要影響，但其致病機制仍不清楚[11]，特別是在對遠離腸道器官的影響方面。腸道菌群對骨組織代謝的影響涉及3種潛在機制：①調節腸上皮細胞對營養成分的吸收；②調節黏膜和全身免疫系統；③腸道菌群代謝物跨腸內皮屏障的轉運[9]。這些作用機制主要體現在骨質疏松、骨關節炎以及骨生長代謝過程中。

2.1骨質疏松

2.1.1腸道菌群影響骨質的積累 骨質疏松癥的發病機制主要包括骨骼生長過程中營養不良、活動受限、性激素和遺傳背景的改變。臨床及動物模型的研究表明，腸道菌群的存在和結構會影響骨骼生長過程中骨質的積累[12-14]。此外，骨質減少可繼發于炎癥疾病(如炎性腸病)或藥物(如糖皮質激素)治療[15]。近年來，益生元用于調節腸道菌群防治疾病的方法逐漸興起，可通過益生元調節腸道菌群結構，富集有益菌。一方面，有益菌產生的短鏈脂肪酸等代謝物，可以為機體提供能量，補充營養，促進機體炎癥恢復和骨骼生長；另一方面，短鏈脂肪酸降低腸道酸堿度，增強的酸性環境既提高了食物和藥物的吸收利用率，也能抵御外來致病菌入侵，同時還能防止鈣磷結合，促進游離鈣離子吸收入血，從而在防治骨量減少和促進骨質積累方面發揮一定作用。但如何通過益生元、益生菌、食物和藥物之間的聯合應用和糞菌移植等方式，加強腸道菌群發揮骨質積累的作用，值得進一步研究。

2.1.2腸道菌群在性激素缺乏后誘導骨丟失 性激素、胰島素樣生長因子-1、胰高血糖素樣肽-1、生長激素、腎上腺皮質激素和血清素等的分泌均受到腸道菌群的影響。其中，性激素使成骨細胞的凋亡被抑制，其水平的降低是人類骨質流失的主要刺激因素[16]。研究表明，腸道菌群的變化與激素狀態和骨質流失有關，是性激素缺乏后誘導骨丟失的中心環節[17]。性激素缺乏使腸道滲透性增加，從而使外周血輔助性T細胞(helper T cell，Th細胞)17數量增加，白細胞介素-17和腫瘤壞死因子水平升高[18]。更年期女性相關的性激素變化(包括雌二醇的減少)易使女性患骨質疏松癥[19]。有文獻報道，給予閉經運動員雌二醇可增加骨密度[20]。其原理為雌二醇在降低腸道菌群α多樣性的同時，可以增加擬桿菌門S24-7菌科的豐度，該菌對人體健康起積極作用，可以促進睪酮分泌，而睪酮具有維持骨骼密度和強度的作用。睪酮雖然可以降低腸道菌群整體豐度，但其在減少有害菌的同時，也可增加厚壁菌門和擬桿菌門的豐度[21]。腸道菌群與性激素之間相互促進的良性循環，有助于防止骨丟失。此外，瘤胃球菌和厚壁菌的梭狀桿菌屬豐度與非卵巢雌激素的濃度密切相關，該菌及其代謝物可增加雌激素的重吸收。藥物誘發的雌激素耗竭，能使無菌小鼠表現出對骨丟失的抵抗力，且不能刺激骨吸收。一項動物實驗發現，脈沖抗生素治療后給予高脂飲食會導致小鼠骨骼生長和全身骨礦密度增加[21]。對于正常飼喂條件下生長的小鼠，給予益生菌補充劑治療可完全保護其免受與雌激素耗竭有關的骨質流失[17]。同時，益生菌也可預防卵巢切除術小鼠引起的骨質流失[22]。乳酸桿菌可調節性激素變化，從而減少骨密度較低的女性發生骨質流失[14]。然而，對于治療腸道菌群相關性激素失衡的方法仍有待研究。

2.2骨關節炎

2.2.1腸道菌群通過參與免疫反應影響骨關節炎 免疫失調可導致骨代謝異常。腸道菌群釋放的代謝產物以及微生物與免疫細胞之間的直接接觸刺激了腸道內皮屏障的免疫反應[23]。免疫細胞(如T細胞和樹突狀細胞)與腸道菌群(如糞桿菌屬)相互作用，并遷移至淋巴結以激活促炎或抗炎反應[24]。這些細胞還可將可溶性促炎或抗炎介質或細胞因子釋放到循環系統中，調節全身性骨重塑。此外，免疫細胞通過遷移至骨骼釋放代謝產物直接調節骨重塑，這些產物包括破骨細胞誘導因子、核因子κB配體的受體激活劑等。而腸道菌群可調節免疫細胞，如Prevotella copri可促進腸道中調節性T細胞(regulatory T cells，Tregs細胞)和Th17細胞的分化，同時Tregs細胞誘導維甲酸相關孤兒受體γt的生成來促進Th17細胞分化[25]。在維甲酸相關孤兒受體γt陽性的Tregs細胞缺失時，與Th2細胞相關的病理活動增強。腸道菌群可通過Th17和Tregs細胞調節Ⅱ型超敏反應，從而平衡腸黏膜表面的免疫反應[26]。一項關于口腔-腸道菌群軸的研究發現，類風濕關節炎的一個病因為口腔菌群的改變，口腔疾病(如牙周炎)會導致腸道菌群的失衡，中性粒細胞和生物膜形成在此過程發揮重要作用[27]。其中，口腔病原菌(如牙齦卟啉單胞菌屬和放線桿菌屬)介導的腸道瓜氨酸蛋白，可以促進抗瓜氨酸蛋白抗體的生成。在這個過程中過度生長的腸道菌群會加強Th1細胞的反應，并通過抑制脆弱擬桿菌屬的生長抑制Treg細胞的激活，使免疫失衡，從而導致類風濕關節炎。雖然腸道擬桿菌門與厚壁菌門的比例可以預測骨關節炎和類風濕關節炎[28]，但菌門中包含的具體菌種和菌屬是否同樣可以起到預測作用有待進一步探究。

2.2.2腸道菌群代謝物通過跨腸屏障轉運影響骨關節炎 腸道菌群的代謝產物穿過腸屏障進入體循環可影響骨細胞功能，如變形菌門產生的脂多糖進入循環系統，到達肝臟后，肝臟的脂多糖結合蛋白會將脂多糖多聚體轉化為單聚體，加強CD14受體與脂多糖的結合，促進自身免疫，造成低度炎癥，從而影響骨關節。在一項由內側半月板失穩致骨關節炎模型的實驗中，與無特定病原菌小鼠相比，無菌小鼠的骨關節炎嚴重程度更輕，其關節軟骨結構、滑膜增生和骨贅大小量表得分更低，血漿脂多糖和脂多糖結合蛋白更少[29]。一項利用非線性降維方法識別菌群類別的研究發現，類風濕關節炎患者腸道宏基因組的氧化還原反應相關基因(R6FCZ7)減少，而擬桿菌具有這種基因，故該菌在類風濕關節炎患者中的豐度下降，由其參與的多種代謝活動減少，包括脂肪酸生物合成和黏多糖降解[30]。

腸道菌群通過調節和抑制作用對攝入的食物產生炎癥反應，這些食物作為抗原在免疫系統中發揮關鍵作用[31]。微生物相關的分子模式(microbe-associated molecular patterns，MAMPs)(如脂多糖、肽聚糖和鞭毛蛋白)作為一種跨膜運輸物質，在進入體循環后可影響遠處器官的生理活動[31]。已知MAMPs通過刺激骨細胞上的先天性免疫受體，直接影響骨重塑，如Toll樣受體[32-33]。MAMPs易位時，活細菌可以穿過腸內皮屏障，易位細菌通常會被免疫細胞迅速殺死，未被殺死的細菌隨MAMPs進入并停留在腸內皮屏障，在誘導屏障內免疫細胞死亡后，少量的MAMPs可能釋放到體循環中[34]，一旦分布到遠程器官(如骨骼)，MAMPs便可以激活免疫反應，產生局部炎癥。一些穿過腸內皮屏障的細菌可以穿透天然細胞并存活，從而避免炎癥反應[35]。

2.3骨生成障礙 骨質疏松、骨關節炎等骨疾病的治療均涉及骨生成，因此如何促進骨生成非常關鍵。機體營養供應不足可能會導致骨骼的新陳代謝受損，飲食干預引起的宿主新陳代謝的變化也存在個體差異，這種異質性除了來自宿主生理外，還來自獨特的腸道菌群特征。研究表明，腸上皮細胞對營養成分的吸收受腸道菌群調節[36]。除影響熱量吸收外，腸道菌群還可通過維生素的生物合成來促進宿主和微生物代謝，如鈷胺素、維生素K和四氫葉酸等，這些維生素在腸壁處吸收，并與營養素一起通過全身循環分布于全身，其功能包括調節脂肪、蛋白質及碳水化合物代謝和維持骨量[9]。目前有關飲食營養和腸道菌群相互作用的研究已不局限于骨骼生長發育，通過個體化營養來重塑宿主-微生物群的相互作用，為骨代謝性疾病的控制和預防提供了新的治療途徑。對于個性化飲食，單獨或同時控制血液中特定分子的水平(鈣離子、維生素和氧化三甲胺等)可能成為未來研究通過個性化營養促進骨生成的關鍵。

腸道菌群的多樣性在不同年齡的宿主中可能存在差異。腸道菌群多樣性隨骨齡增長而下降[37]，有研究觀察到骨礦密度的變化根據動物的年齡有所不同，與常規飼養的小鼠相比，8周齡左右雌性C57BL/6無菌小鼠的破骨細胞減少，骨密度增加[18]。雌性無菌小鼠在20周齡時的股骨皮質體積和皮質厚度較傳統飼養小鼠大[17]。一項針對8周齡雄性BALB/c小鼠的研究顯示，與常規飼養小鼠相比，無菌小鼠的股骨長度更短、皮質厚度更薄且骨密度更低[38]。有學者在近交系小鼠中觀察到腸道菌群的差異[39]，由于細菌鞭毛蛋白的Toll樣受體5沒有已知的內源性配體，其表型變化完全取決于宿主與微生物相互作用。在Toll樣受體5缺陷型小鼠中，鞭毛蛋白表達增加導致細菌運動性增強，且細菌穿過內皮屏障的轉運增加，從而觸發免疫反應導致腸上皮發炎[40]。Toll樣受體5的缺失會導致腸道菌群發生變化，這支持了某些小鼠骨表型的變化可能取決于微生物組結構變化的觀點。

此外，腸道菌群失調可能導致宿主各系統失衡。腸道菌群失調在骨生成中的作用，可以解釋與普通小鼠相比，無菌小鼠的骨量減少程度更小的原因[38]。首先，不同小鼠品系的骨表型可能對影響腸道菌群因素(供應商和環境等)的敏感性不同。其次，腸道菌群失調在骨生成中的作用表明通過定量性狀基因座或相關分析對表型進行遺傳表征，可能會鑒定出某些基因不是直接調節骨骼生理基因的骨表型，而是通過調節腸道微生物組發揮作用[41]。改變腸道菌群結構、定植的時間和數量均會影響骨吸收和骨量[42-43]。有學者利用脂多糖誘導雞的腸道菌群失調，結果發現雞胚指骨的小梁體積和骨密度均減小，原因為成骨細胞基因(Ocn、Runx2、Osx和Dlx5)的表達因腸道菌群失調而受到抑制，成骨細胞生成減少，最終導致骨生成障礙[44]。失調的菌群通過激活核因子κB信號干擾胚胎骨的骨化，刺激白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α釋放，激活維甲酸信號，直接抑制Dlx5的轉錄，最終限制胚胎骨化。一項利用高脂飲食誘導小鼠肥胖，使小鼠腸道菌群失調的實驗發現，疣狀菌門、放線菌門和變形菌門在小鼠回腸和盲腸增加，這些細菌代謝產生的脂多糖水平升高，損害骨微環境，刺激造血干細胞分化為脂肪細胞，同時菌群失調會抑制成骨細胞Runx2基因表達，且形成骨髓生態位的基因(Jag-1、Cxcl12和白細胞介素-7)被高度抑制，故使成骨細胞減少，骨生成受到抑制[45]。此外，動物實驗表明，通過改變小鼠腸道菌群結構或減少腸道細菌的數量，降低丁酸水平，抑制成骨細胞增殖和分化，最終能縮短骨齡[18,46-47]。丁酸是一種腸道菌群產生的有益的短鏈脂肪酸，可恢復甲狀旁腺激素誘導的骨合成代謝，甲狀旁腺激素可借助丁酸來增加骨髓Treg細胞的數量，Treg細胞通過骨髓CD8+T細胞刺激產生成骨Wnt配體Wnt10b，激活Wnt依賴性骨生成。上述實驗表明，菌群失調可導致骨生成障礙。

有文獻報道，飲食干預可改善骨代謝[48]，但未表明腸道菌群的作用，而通過飲食調節腸道菌群可改善高血壓[49]、低血糖癥[50]、動脈粥樣硬化[51]等疾病，現已有文獻陸續報道飲食干預對骨代謝性疾病的改善過程有腸道菌群的參與。

3 飲食干預調節腸道菌群對骨代謝性疾病的影響

腸道菌群通過代謝食物衍生的短鏈脂肪酸和氧化三甲胺等信號分子，與宿主受體觸發大量的信號轉導過程，直接或間接影響骨骼、腦和皮膚等遠端器官。飲食在塑造腸道菌群結構和功能方面起重要作用[52]。特定食物的有益代謝物，有利于富集腸道有益菌發揮積極作用。因此，也可以通過補充益生菌來調節腸道菌群結構和免疫反應，益生菌不僅可以恢復性腺功能減退或卵巢切除導致的骨丟失[42,53]，還可以改善炎癥性骨疾病[54]。

3.1發酵碳水化合物產生的短鏈脂肪酸促進骨形成 腸道菌群可以對營養吸收和熱量吸收產生深遠影響，直接或間接影響骨骼代謝。腸道菌群通過發酵產生短鏈脂肪酸、多聚胺、吲哚衍生物以及ATP。腸道菌群發酵碳水化合物產生的短鏈脂肪酸主要包括乙酸、丙酸和丁酸，不僅為腸上皮細胞提供營養，同時也抑制免疫應答[24]，通過抑制破骨細胞的組蛋白去乙酰酶，或作為G蛋白偶聯受體配體和過氧化物酶體增殖物激活受體γ發揮信號分子的作用[4]。短鏈脂肪酸既可以調節胰島素樣生長因子-1和胰高血糖素樣肽-1間接促進骨形成，也可以直接降低腸道pH值，減少腸道鈣磷化合物形成，增加鈣離子入血，促進骨形成[55]。此外，短鏈脂肪酸可通過抑制破骨細胞的基因表達，抑制RANKL信號通路誘導的破骨細胞生成[56]。慢性營養不良導致的腸道菌群失調與青春期骨骼生長受損有關。

3.2代謝食物膽堿產生的氧化三甲胺增加骨密度 左旋肉堿和膽堿來自肉、魚和奶制品，腸道菌群將飲食中的左旋肉堿和膽堿轉化為三甲胺，后在肝臟由單氧化酶轉化為氧化三甲胺。一項關于減肥飲食干預的試驗發現，腸道菌群循環代謝生成的氧化三甲胺可防止骨密度降低[57]。另一項研究將健康和營養貧乏幼兒(6～18月齡)的腸道菌群移植到無菌小鼠中，5周后，與營養貧乏小鼠相比，移植了健康幼兒腸道菌群小鼠的體重增加更快；而與接受健康幼兒腸道菌群移植的小鼠相比，接受營養貧乏幼兒腸道菌群移植的小鼠雖然體重減少，但股骨皮質的骨量和骨密度有所增加[58]。在一項研究中，以營養貧乏飲食飼養的動物骨骼生長受損，其骨骼生長可通過對特定的乳酸桿菌菌株進行單菌落化或完全重建腸道菌群來改善[32]。氧化三甲胺促進骨生成的機制可能是通過增加成骨細胞基因表達，上調骨形態蛋白信號和Wnt信號，促進成骨細胞分泌骨保護素[59]。然而，血液循環中氧化三甲胺水平升高是心血管疾病的重要危險因素[60]其原因可能為濃度差異或個體差異。因此，氧化三甲胺水平與機體疾病的關系需要大量的試驗驗證。

3.3益生菌降低骨質流失 除了預防雌激素消耗引起的骨質流失外，長期口服乳酸菌、糞球菌和雙歧桿菌等有益菌，可增加骨細胞活性和數量以及骨骼密度，降低骨質流失。骨體積分數的增加歸因于腸道中鈣或營養物質吸收的改變，而不是全身性炎癥的改變。此外研究顯示，腸道乳酸桿菌屬豐度增加可預防患1型糖尿病的肥胖癥患者(鏈脲霉素)模型中的骨質流失，這歸因于誘導1型糖尿病后維持Wnt10b基因的表達[61]。機體炎癥與增加的破骨細胞因子有關，這些因子是造成骨質流失的關鍵因素，與鈣以及一些營養物質的吸收無關[62]。未來需確定益生菌對骨代謝的作用機制，共生菌群的相對豐度或腸道菌群水平與骨表型之間的關系也有待進一步研究[22,38,58]。

4 小 結

雖然有研究描述了微生物組對主要器官系統的影響[62]，但有關其對骨骼系統的影響研究較少。目前認為的遺傳背景或藥物治療的確定作用，如骨質疏松、骨關節炎和骨生成障礙等疾病的病程進展和藥物治療效果，可能是繼發于腸道菌群調節之后產生的作用。根據腸道菌群的特定比例和結構，不僅可以預測骨代謝疾病類型和嚴重程度，還可以通過飲食干預調節腸道菌群結構，有效預防和治療骨代謝性疾病。因此，腸道菌群防治骨代謝性疾病的機制應進一步探討。目前，增進對腸道菌群與骨代謝性疾病聯系的認識主要有三個挑戰：①相對較慢的骨骼變化速率，很難通過實驗產生腸道菌群的持續變化。如常見的利用腸道菌群的方法是將微生物群從供體轉移到無菌動物中。當暴露于新的宿主環境時，轉移的微生物群結構會隨時間而變化[63]。②與骨質疏松癥相關的臨床前研究集中于成年骨骼表型，這需要年齡較大的動物。成年表型可能對微生物暴露的時間非常敏感[64]，因此成熟骨骼的腸道菌群的變化難以研究。③有效利用腸道菌群及其代謝物，達到靶向治療效果的方法仍較少。未來，應針對上述挑戰進行重復性的臨床試驗，以檢查腸道菌群失調情況下，人體骨骼的生長、質量、結構、強度和骨骼愈合情況，使腸道菌群成為骨代謝性疾病預防和治療的新靶點。