免疫組庫測序在腫瘤免疫治療中的應用

莫欣，吳茂芳，周永春

(昆明醫科大學第三附屬醫院 云南省腫瘤醫院分子診斷中心云南省肺癌研究重點實驗室，昆明 650118)

免疫組庫是指特定時間段內機體T淋巴細胞和B淋巴細胞多樣性的總和，可反映特定時間段內機體免疫系統應對外界刺激應答的能力，能夠準確而全面地反映機體免疫系統的健康狀況[1]。人體的適應性免疫系統有許多機制來保護組織和器官免受外來病原體或癌細胞的損害，其中，B淋巴細胞和T淋巴細胞表面的B細胞受體(B-cell receptor，BCR)和T細胞受體(T-cell receptor，TCR)上的互補決定區(complementarity determining region，CDR)與主要組織相容性復合體-抗原肽分子進行識別及特異性結合，從而激活免疫系統，高效準確地殺傷特定目標[2]。TCR與BCR通過體細胞重排和超突變產生，具有巨大的多樣性，其中CDR3是決定抗原識別特異性的最大可變基因區域，CDR3的多樣性主要取決于兩個或三個基因片段的重組，包括變量、多樣性和連接以及基因插入或缺失，另外，成熟B細胞的體細胞超突變使BCR的多樣性更加復雜[3]。由于復雜的多樣性，傳統的蛋白組學技術不適用于大規模免疫系統分析，隨著下一代測序技術的發展，使在信使RNA和DNA水平上的高通量免疫系統分析成為可能，從而促進了免疫組庫測序的廣泛應用。近年來，腫瘤免疫治療取得了巨大的臨床研究進展，已經成為腫瘤治療的熱點之一。免疫組庫測序技術有望為腫瘤免疫治療提供有用的生物標志物?，F就免疫組庫測序在腫瘤免疫治療中的應用予以綜述。

1 免疫組庫測序技術

免疫系統是保護機體免受自身及外界抗原傷害的重要防御措施，包括癌癥、自身免疫疾病、傳染病、器官移植等。針對淋巴細胞表面受體的免疫組庫研究是多個領域的研究重點，而免疫組庫測序技術主要以T/B淋巴細胞為研究目標，采用多重聚合酶鏈反應技術或cDNA末端擴增技術決定BCR或TCR的CDR3的多樣性，再結合高通量測序技術全面評估免疫系統的多樣性，深入探索免疫組庫與疾病的關系[4]。BCR在B淋巴細胞膜上表達免疫球蛋白的膜結合形式，由兩個相同的重鏈和輕鏈組成[5]。TCR是一種異二聚體，由T細胞膜表面的兩個二硫鍵連接的跨膜蛋白組成：一條α鏈和一條β鏈(或一條γ鏈和一條δ鏈)[6]。BCR和TCR包含可變區和常量區。BCR和TCR的可變區由3個CDR(CDR1、CDR2和CDR3)組成，由許多種系、非連續變量、多樣性和連續基因片段重排產生BCR與TCR的多樣性與特異性，可變區有助于與大量不同的抗原結合，從而產生有效的適應性免疫反應[7-8]。其中CDR3的變異最大，直接決定TCR的抗原結合特異性，因此對CDR3序列的分析有助于獲得適應性免疫系統所需受體的特異性和多樣性。免疫組庫技術主要包括從目標淋巴細胞中分離和純化遺傳物質、擴增遺傳模板、基因測序和生物信息學分析，通過對BCR和TCR中的CDR3進行深度測序和分析，能夠為BCR和TCR庫提供更廣泛和更高分辨率的圖像[5]。

目前在臨床上，免疫組庫技術已經用于B細胞或T細胞惡性腫瘤的微小殘留白血病、腫瘤復發[9]和異基因造血干細胞移植后免疫重建的診斷和監測。此外，免疫組庫技術分析還可用于非B/T細胞惡性腫瘤中腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)的定量分析，以及預后生物標志物的開發[10-12]。近年來，免疫組庫技術在腫瘤免疫治療方面顯示出巨大的潛力[13-14]。哺乳動物的免疫系統對腫瘤具有雙重作用，一方面，被抑制的免疫系統有利于腫瘤細胞逃逸，導致不受控的轉移和復發；另一方面，增強的免疫系統產生過度生長的淋巴細胞，誘發造血系統惡性腫瘤。而尋找免疫系統的有效信息是探索腫瘤免疫學分子機制的關鍵，這對于確定腫瘤抗原和開發新的免疫療法至關重要。

2 免疫組庫測序技術在腫瘤免疫治療中的應用

2.1免疫組庫測序技術在過繼細胞療法(adoptive cell transfer，ACT)中的應用 ACT是將腫瘤患者體內提取分離的免疫活性細胞(包括TIL、淋巴因子或細胞因子激活的殺傷細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞和嵌合抗原受體修飾的T細胞等)進行體外擴增和功能鑒定后，再回輸到患者體內，從而達到直接殺傷腫瘤或激發機體免疫應答殺傷腫瘤細胞的目的[15]。1988年，Rosenberg等[16]通過過繼移植將黑色素瘤中提取的TIL用于轉移性黑色素瘤的治療，這是最早的ACT，隨后基因工程T細胞治療、嵌合抗原受體修飾的T細胞治療和TCR工程T細胞治療也開始用于腫瘤的免疫治療[17-18]。其中以嵌合抗原受體修飾的T細胞為基礎的過繼免疫治療可以使某些血液惡性腫瘤(如急性淋巴細胞白血病)病情得到長期緩解，效果優于標準聯合治療[18]，但是對上皮性實體腫瘤有效的ACT治療仍處于發展階段。

由于腫瘤的異質性，ACT對某些實體腫瘤的作用有限，另外，正常組織抗原與工程化T細胞抗原相似，因此正常組織的毒性是ACT治療面臨的重要問題之一。為了使選中T細胞攻擊腫瘤而非正常組織，需要在ACT治療過程中選擇合適的生物標志物來監測藥理反應和免疫基因組學。表面和細胞內標志物、轉錄譜、細胞因子譜、體液免疫蛋白[19-20]等生物標志物已經應用于T細胞治療的臨床試驗，在這些生物標志物中，TCR的免疫組庫測序具有高敏感性。系統、全面地描述TIL的特征有助于探究腫瘤免疫治療的作用機制，其作為患者治療反應的預測性生物標志物具有重要意義，而TIL的克隆組成可以通過分析TCR的α鏈和β鏈體細胞重組產生的TIL基因庫來評估[21-22]。

TCR中高度可變的CDR對確定每個T細胞克隆的特異性至關重要，因此對TCR的CDR3進行深度測序可在很大程度上揭示TIL的克隆組成[23-24]。目前多通過TCR測序探究TIL的異質性，Sherwood等[25]利用TCR序列分析對結直腸癌患者的黏膜組織和腫瘤組織的克隆進行鑒定和跟蹤，發現腫瘤組織中的免疫反應與相鄰黏膜組織中的免疫反應不同。Page等[26]的研究也證實，可以根據治療前后TIL的TCR變化評價T細胞反應和免疫治療的有效性。另有研究證實，ACT后的白血病和神經母細胞瘤[27-28]等實體瘤患者的TCR多樣性得到改善，表明TCR的深度檢測可作為ACT的適用診斷和監測方法。

2.2免疫組庫測序技術在免疫檢查點療法中的應用 目前，免疫治療在干預及增強腫瘤適應性免疫反應方面取得了重大進展，大部分腫瘤患者的治療反應顯著[29]，其中使用檢查點阻斷劑單獨或聯合ACT進行腫瘤免疫治療最具有潛力[30]。迄今為止，這種免疫檢查點治療主要集中在細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)、程序性細胞死亡受體1和程序性細胞死亡配體1三個靶分子上，它們參與了免疫抑制機制。針對這些靶點的抗體可以激活受抑制的T細胞功能，使其對腫瘤有顯著的免疫應答[31]。由于免疫檢查點療法的成本高、僅對部分患者有效、治療可造成免疫相關不良反應，需要免疫相關標志物來預測治療反應和確定相應療法的有效性，以便臨床上選擇適配患者進行免疫治療。雖然一些生物標志物與免疫檢查點治療的結果相關，如程序性細胞死亡配體1表達、腫瘤突變負荷、TIL、錯配修復缺陷和免疫基因標記[18,32-35]，但這些生物標志物均不能反映免疫治療前后免疫細胞數量的動態變化。

免疫組庫可直接反映細胞介導的免疫反應，有研究發現使用曲美母單抗進行CTLA-4阻斷治療后，患者外周TCR基因多樣性(克隆豐富度和香農指數)增加，而健康對照組無明顯變化[36]，這種多樣性的增加與接受CTLA-4抑制抗體治療患者的腫瘤反應和毒性相關，同時該研究還發現，CTLA-4阻斷后應答者和非應答者的TCR多樣性沒有差異。另一項使用伊匹單抗作為CTLA-4阻斷劑的研究發現，阻斷劑治療后基線TCR多樣性與臨床效益相關[37]。與抗程序性細胞死亡受體1免疫治療相關的研究也表明，接受尼魯單抗治療患者的TCR序列豐富性和均勻性與臨床效益相關[38]，且在尼魯單抗應用前接受抗CTLA-4治療患者的TCR表現出的豐富性更高，更可能在后續治療中受益。但Hogan等[39]發現，外周血T細胞多樣性較差的患者可在抗程序性細胞死亡受體1治療中受益，但不受益于抗CTLA-4治療。因此，基線TCR多樣性可能是某些患者治療的預測性生物標志物，分析TCR多樣性可為不同患者選擇最適合的免疫檢查點抑制劑提供合理依據。相關研究表明，TCR多樣性不僅可作為預測惡性腫瘤患者免疫反應的生物標志物，還能成為評估患者臨床預后的指標[40]。

除治療效果不確定性外，免疫檢查點療法還可導致不良反應，其所致不良反應通?？赡?，如結腸炎、腸炎、肝炎和皮膚炎癥等，嚴重者可出現危及生命的神經系統疾病和心臟疾病。因此，免疫治療中的毒性預測和評估同樣重要。臨床研究表明，如果抗CTLA-4治療后早期T細胞多樣性增加，或治療后外周血中CD8 T細胞克隆性擴增，腫瘤患者更可能發生免疫相關毒性反應[41-42]。此外，在接受抗CTLA-4和抗程序性細胞死亡配體1聯合治療患者中，循環B細胞減少、胞質細胞和CD21loB細胞亞群增加與免疫相關不良反應有關[43-44]。由此可見，在免疫檢查點抑制劑治療后，免疫系統的變化可能是預測不良反應的潛在生物標志物。

2.3免疫組庫測序技術在癌癥疫苗中的應用 癌癥疫苗能夠產生活躍的腫瘤特異性免疫反應，并由于其對腫瘤細胞的特異性和持久的免疫記憶性(可以預防復發)而成為理想的治療方法[45]。傳統疫苗以病原體相關抗原為基礎，區別于宿主的自身抗原，而癌癥治療性疫苗非常復雜。1928年，Coley[46]提出了免疫系統能夠識別并對腫瘤產生反應的觀點，并通過注射腫瘤患者體內的減毒細菌或細菌產物的方式證實，減毒細菌或細菌產物可刺激機體產生腫瘤壞死因子，并在某些情況下使腫瘤消退。預防性疫苗(如乙型肝炎病毒和人乳頭瘤病毒疫苗)可成功預防疾病，針對腫瘤新抗原的治療性疫苗也具有臨床效益。在許多臨床研究中，治療性癌癥疫苗主要作用是延長患者生存期，與其他免疫療法相比，客觀持久性退化的效果有所降低[47]。雖然大多數腫瘤抗原與自身抗原相似，但兩者的表達水平不同，疫苗注射抗原在癌癥免疫治療中起著重要作用，使用這些疫苗應該注意避開免疫耐受機制，同時避免引起過度的免疫反應。

目前已有多種方法用于監測治療性癌癥疫苗接種后的免疫反應，包括酶學檢測、血清學方法和免疫系統分析[47-48]。免疫系統是一個多功能的指標，有助于評估疫苗的效果，選擇疫苗靶點和預測癌癥預后。一方面，有效的治療性癌癥疫苗可以誘導免疫反應，以特異性克隆擴增、TCR/BCR多樣性和均勻性改變等重要模式重塑免疫系統。通過分析接種前后免疫指標的變化判斷疫苗的預防效果。此外，TCR能識別具有保守CDR3序列的同一抗原，TCR序列的多樣性受到抗原進化的影響[49-50]。利用免疫組庫測序技術可以發現新的抗原或優化先前存在的疫苗，其中細胞毒性T淋巴細胞的TCR在抗原識別中起著關鍵作用，包括病毒抗原和腫瘤相關抗原。研究細胞毒性T淋巴細胞的基因表達譜可以為抗原選擇、T細胞活化和抗原識別過程中的衰竭提供信息，促進癌癥治療性疫苗的發展[51-52]。而BCR的全序列分析也被用于追蹤記憶B細胞和接種后B細胞反應以及抗體選擇[53-55]。免疫組庫測序既可鑒別腫瘤反應性B細胞，也可區分針對公共腫瘤抗原的共享抗體和針對特定癌癥新抗原的共享抗體，有利于抗腫瘤抗體的開發。此外，免疫組庫測序清晰地反映了疫苗接種后B/T細胞反應和克隆擴增，使對疫苗不同傳遞方式的評價更直觀、方便。在治療性癌癥疫苗的研制過程中，很難優化合適的傳遞方式，應用免疫系統分析可以促進選擇甚至發現新的傳遞方式。

3 小 結

描述腫瘤細胞與宿主適應性免疫系統的相互作用對于理解腫瘤免疫學，特別在確定治療靶點和監測免疫治療方面至關重要?；赥CR的獲得和功能，認為TCR是人類認識感染、自身免疫、衰老和癌癥期間免疫反應的工具，因此，TCR有望成為免疫調節治療的預測性指標。隨著高通量測序和多重聚合酶鏈反應技術的發展，免疫組庫測序有助于進一步認識癌癥發展過程中免疫反應的調節。通過比較不同時空條件下TIL的TCR全譜可能有助于發現的新抗原和腫瘤微環境的關鍵變化，從而促進腫瘤治療的進展。對于免疫療法的臨床應用，免疫組庫測序可從治療效果和不良反應等方面為免疫療法的雙重評價提供新思路，并可通過TCR和BCR序列評估癌癥治療性疫苗的有效性和耐藥性。