慢性阻塞性肺疾病鼠類動物模型研究進展

姜友軍，張培蓓，葉賢偉

(貴州醫科大學附屬人民醫院呼吸與危重癥醫學科，貴陽 550002)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以持續進行性發展的不完全可逆的氣流受限為主要特征的呼吸系統疾病[1]。Wang等[2]的組織流行病學調查研究顯示，我國COPD總患病人數將近1億，約占全球COPD患者的25%。因此，通過COPD動物模型探究其發病機制、治療措施具有重要意義。

構建動物模型是進行COPD各類研究的基礎[3]，由于疾病的復雜性及不同動物品系對誘導因素的反應差異，國內外尚無公認的最佳建模方案及評價標準[4-6]。目前常用于構建COPD模型有煙草煙霧暴露[7]、空氣污染物質暴露[8]、氣道內炎癥刺激[9]、氣道內蛋白酶滴注[10]、免疫反應[10]及基因改造[11]等單因素誘導方法，以及高效的多因素聯合誘導方法，不同實驗中所采用的動物品系[4]及模型評價指標[5]也不同，雖然構建標準化的動物模型十分重要，但具體建模方案及評價指標仍取決于實驗研究目的[6,12]。現對近年來常用的構建COPD動物模型所涉及的建模方法、模型評價進行歸納，以期為構建適用的COPD鼠類動物模型提供參考。

1 動物模型的選擇

多種動物(如鼠、犬、羊、牛、豬、猴)被用于構建COPD模型[4]。研究者主要從解剖結構、基因信息、實驗可行性、飼養條件及經濟效能等因素綜合考慮，目前較多選用鼠類(豚鼠、小鼠、大鼠等)進行研究[4-5]。

1.1豚鼠 豚鼠肺臟解剖結構及生理特征與人類大致相似，即左側肺2葉，右側肺3葉，具有二分叉細支氣管結構，可減少吸入肺內的顆粒，大氣道內有黏液腺和杯狀細胞，且受神經元細胞和局部蛋白調節，對呼吸道平滑肌舒縮的激動劑和拮抗劑反應與人類相似，且變態反應、炎癥反應幾乎與人類相同，構建的黏液高分泌和進行性發展的COPD動物模型較其他動物更典型[3,13-16]。豚鼠對肺損傷反應大多表現為軸突反射，而軸突反射在人類肺損傷中表現并不明顯[12]；此外，豚鼠價格相對較高，無可供采血和給藥的尾巴，且缺乏研究分子學的工具和相關蛋白抗體，故影響研究的深入。

1.2小鼠 常見的小鼠品系有C57BL/6J、BALB/c和A/J等，不同品系、性別的小鼠對COPD動物模型誘導因素存在敏感性差異[5-6,17]。目前已明確小鼠基因信息與人類基因組接近，易制備基因改造小鼠供實驗選用[18]；近交系小鼠可消除遺傳變異的影響；品系多，可根據實驗目的選擇對誘導因素敏感性高的品系；體內存在多種酶及抗體，有利于完成抗原鑒定、免疫印跡實驗、細胞流式實驗、免疫組織化學等相關檢測；小鼠易飼養、成本低、繁殖周期短、飼養及藥物成本較低，可操作性強。但小鼠肺臟解剖結構異于人類，呈左側肺1葉，右側肺4葉，單軸氣管分支模式[19]，支氣管分支數量明顯少于人類，且缺乏有呼吸功能的細支氣管及定義明確的肺小葉結構[20]；氣道黏膜下腺體數量少，因此不能引起黏液高分泌的病理變化[13]；且纖毛細胞分布較少，無杯狀細胞。小鼠與人類的免疫應答存在差異，小鼠在停止煙草煙霧暴露后不同于人類所呈現的進行性發展的肺氣腫特點[21]，但曹君等[22]發現，暴露于煙草煙霧環境3個月后，小鼠肺組織病變仍呈進行性發展。盡管如此，小鼠動物模型仍可精確復制出COPD急性加重期和慢性穩定期的重要特征[7]，如氣流受限、動態肺順應性下降等肺功能改變，氣道炎癥、肺氣腫、氣道重塑等病理改變，運動耐量下降等。

1.3大鼠 大鼠作為動物模型的優缺點與小鼠相似。與小鼠相比，大鼠靜脈及氣管內給藥、肺組織和肺泡灌洗液等標本采集更加便利。有研究表明，大鼠對煙草煙霧暴露抵抗力較強，但Smith等[23]發現大鼠煙草煙霧暴露3 d即出現氣道炎癥改變，具有COPD研究價值[7]。更多的研究證實，大鼠可用于快速建立COPD模型[4-5,24]。

1.4其他鼠類 倉鼠、金黃地鼠、昆明鼠、斑點鼠等品系鼠類也被用于構建COPD模型，但因針對其的實驗試劑較少、遺傳變異影響等因素而受到限制[4]。

2 COPD動物模型建立方法

2.1氣道吸入方法

2.1.1煙草煙霧暴露 吸煙是COPD最重要的誘因，因此常采用煙草煙霧暴露構建COPD模型[5]。煙草煙霧中含有尼古丁、焦油、一氧化碳、氮氧化物、醛類、烯烴、芳香烴等4 000多種有害物質[25]，已知有60多種物質可能參與COPD發病過程。暴露方式主要分為鼻暴露和全身暴露，周鳳等[26]將小鼠全身暴露于煙草煙霧環境180 d，成功構建COPD穩定期模型。Shu等[27]發現，通過鼻暴露和全身暴露10周均成功構建COPD動物模型，但鼻暴露可控性和可重復性更強，且右心室壓力變化和肺小動脈內膜增厚的病理生理特征更明顯。與全身暴露導致焦油、尼古丁等有害物質附著在皮膚并進入體內的缺點相比，鼻暴露能更準確地控制煙霧吸入量，有助于準確判斷干預效果，且符合人類吸煙過程，可產生更多表型，實驗重復性更穩定[28-29]。單純煙草煙霧暴露是較為理想的建模方法，一般暴露2個月可出現氣道炎癥等早期COPD病理改變，6個月則出現典型的COPD病理及功能改變，如氣道炎癥、氣道重塑、肺氣腫、肺功能下降[15]。但短時間內單純煙草煙霧暴露很難引起明顯的肺泡腔擴大、氣道重塑及肺功能下降等特征，且不同實驗中的煙草煙霧暴露設備、時間、煙霧濃度(總顆粒物密度、氧氣濃度、二氧化碳濃度)等不同[5,30]。單純煙草煙霧暴露構建COPD模型所需時間長，且暫缺標準煙草煙霧暴露方案。

2.1.2空氣污染物質暴露 空氣污染物暴露與COPD的發生、發展聯系緊密，空氣污染物濃度與COPD患者住院水平呈正相關[31-33]。有研究證實，將實驗小鼠或大鼠暴露于可吸入顆粒物質(particulate matter，PM)和(或)有害氣體環境均可成功構建COPD模型[34-39]。PM是空氣污染的主要成分，其中PM2.5被認為在COPD發病機制中起關鍵作用。Zhao等[34]將小鼠全身暴露于PM2.5(560 μg/m3)中，40周后出現肺氣腫、氣道慢性炎癥等病理改變，建模成功。劉菁等[35]發現，通過吸入PM2.5顆粒和氣管內滴注PM2.5混懸液建模3個月后，兩組均出現典型COPD特征，氣管內滴注PM2.5混懸液組以急性肺損傷為主，故認為PM2.5顆粒暴露更適合構建COPD模型。He等[36]將大鼠分別暴露于生物質燃料、機動車尾氣毒染的空氣中，含有PM、一氧化碳、氮氧化物、二氧化硫等有害物質，7個月后建模成功。單純有害氣體暴露(如二氧化硫、二氧化氮和臭氧)也可構建COPD模型[37-39]。該動物模型可用于探究空氣污染物參與誘發COPD的發病機制以及長期空氣污染物暴露所導致的肺臟病理生理改變。但是空氣污染物建模方法耗時長，對污染物定量及暴露條件的要求較高，且較難控制污染物的穩定濃度。

2.2氣道內滴注方法

2.2.1氣道內滴注病原體或病原體相關成分 病原體感染是COPD急性加重的主要誘因，急性加重次數與肺功能下降速度呈正相關[40-41]。氣道內病原體及病原體所產生的損害因素[如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖及酶類]刺激氣道和肺實質、誘導炎癥細胞浸潤并釋放炎癥介質，進而誘發炎癥反應，最終發展為COPD[42]。目前常被用于構建COPD模型的病原體有銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、流感病毒等；LPS是革蘭陰性菌的細胞壁成分，常存在于空氣污染物及有機粉塵中。文文等[43]給予大鼠氣道反復滴注銅綠假單胞菌菌液，第2周氣管壁及伴行血管壁開始增厚，第16周可見中央多個肺泡相互融合、肺泡腔不規則擴大、肺泡間隔斷裂、肺大皰等典型肺氣腫表現。Kobayashi等[9]給予小鼠氣道內滴注LPS，暴露后第1天氣道內巨噬細胞明顯增高，第3天氣道內總體炎癥水平最高，符合COPD急性加重期表現。氣道內滴注建模方案中，干預因素及劑量相對明確，常通過單因素或聯合其他誘導因素構建COPD急性加重期模型；單次給藥干預后，早期出現明顯氣道炎癥反應，但未見明顯的氣道重塑、肺氣腫等病理特征[9]，需多次給藥，但與其他模型相比，該建模方法所需時間仍較短[9,44-46]。

2.2.2氣道內滴注蛋白酶 吸煙、氧化應激、氣道炎癥反應均可導致蛋白酶-抗蛋白酶失衡，引起肺組織損傷，最終出現肺氣腫改變。在彈性蛋白酶誘導COPD模型過程中，除直接肺損傷外，還存在炎癥反應機制[10]。常用的蛋白酶有豬胰蛋白酶、人中性粒細胞彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶等。Shibata等[47]予BALB/c小鼠鼻內單次滴注豬胰蛋白酶，第7天小鼠肺部出現明顯的肺氣腫征象，第21天肺泡平均線性截距增加2倍以上，符合COPD特征。該方法建模時間短[48]，誘導因素明確、藥物劑量易控制，肺泡破壞程度與蛋白酶劑量呈正相關，可構建重度COPD動物模型，暴露后肺組織破壞呈進行性發展[9]；但蛋白酶給藥劑量窗狹窄，不同動物品系對蛋白酶存在敏感性差異[49]。

2.3腹腔內注射方法

2.3.1腹腔內注射煙草煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE) CSE幾乎含有煙草煙霧中的所有化合物[50]。近年來，研究者通過腹腔注射CSE成功構建COPD動物模型[51-52]。He等[51]自制CSE溶液，于第1、12、23天以0.3 mL/20 g的劑量注入小鼠腹腔，12周后，小鼠肺功能下降、肺泡腔擴大、肺泡破壞、肺泡間隔細胞凋亡增加，符合肺氣腫模型，與單純煙草煙霧暴露相比無明顯差異。Chen等[52]于第1、8、15天向大鼠腹腔注入1 mL CSE溶液，3周誘導出肺氣腫模型。該方法建模時間較短、CSE易制備、操作簡單、價格低，但尚無煙草種類、CSE制備方法、給藥時機的公認方案，且具體病理生理機制尚不明確，可能與血管重塑、氣道高反應[50]、氧化應激、白細胞介素-6水平增高[51]等機制相關。

2.3.2腹腔內注射異種內皮細胞 體液免疫和細胞介導的免疫調節失衡可能參與肺組織破壞、肺泡細胞凋亡和肺氣腫的發展[53]。Taraseviciene-Stewart等[54]首次采用大鼠腹腔內注射人臍靜脈內皮細胞，2～3周后發現，抗內皮細胞抗體增多，并出現肺泡細胞凋亡及小葉中央型肺氣腫病理改變，證實體液免疫和細胞介導免疫參與了COPD的發病機制。有學者應用彈性蛋白酶[10]、α-半乳糖基神經酰胺[55]驗證了自身免疫調節機制誘導COPD形成，并探討了先天性和適應性免疫調節機制在COPD動物模型中的作用[56]。腹腔內注射異種內皮細胞構建自身免疫型肺氣腫模型較為常用[57]，建模時間較短，以肺泡凋亡、肺泡腔擴大為主要表現，但無明顯氣道炎癥、氣道重塑病理改變，且操作過程相對復雜。

2.4皮下注射方法 血管內皮生長因子是內皮細胞生存所必需的營養因子，在肺組織中大量表達，以維持成人肺組織結構[58]。血管內皮生長因子受體2表達減少導致肺泡間質細胞凋亡增加，最終導致肺氣腫[59]。Kasahara等[58]予大鼠皮下注射血管內皮生長因子受體阻滯劑(SU5416 20 mg/kg，每周3次)，3周后出現肺泡間隔結構消失、肺泡腔擴大等肺氣腫病理改變，證實了內皮細胞破壞、血管內皮生長因子與肺氣腫的相關性。Bilan等[60]予大鼠單次皮下注射SU5416 200 mg/kg，26 d后出現肺泡細胞凋亡、肺泡腔擴大等肺氣腫表現，合并肺動脈高壓及肺血管損傷。該建模方法可建立肺氣腫并肺動脈高壓、肺血管損害相關模型[61]，但其與人類肺氣腫合并肺動脈高壓、肺血管損害發生發展機制的相似性仍需深入研究。

2.5基因改造方法 吸煙是最重要的COPD誘導因素，但并非所有吸煙者均患病，因而個體易患因素逐漸受到重視。最新研究表明[18]，基因決定因素與COPD發病、COPD相關表型及肺功能變化相關，在基因改造小鼠模型中，大約有119個基因、84個COPD基因位點顯示COPD相關表型；位于COPD全基因組關聯研究位點的8個基因(刺猬相互作用蛋白、家族序列相似性13A、鐵反應元件結合蛋白2、晚期糖基化終末產物受體、基質金屬蛋白酶1、基質金屬蛋白酶12、表面活性蛋白D和衰老關鍵蛋白5)也表現為小鼠COPD表型，可能是COPD易感基因。基因工程技術應用前，常選用自然基因突變形成的自發性COPD模型，如緊皮、蒼白、米色、斑點型小鼠，但這些基因突變的病理生理影響并不局限于肺臟。目前多選用基因改造技術調控基因序列，以增強或減弱相關蛋白的表達，通過誘導蛋白酶/抗蛋白酶機制失衡、增加誘導因素易感性等構建COPD模型。Shuto等[62]應用基因工程技術改造小鼠相關基因，以誘導氣道上皮Na+通道b亞基表達增強，成功建立Na+通道b亞基COPD小鼠模型，并證實蛋白酶-抗蛋白酶失衡和氧化應激是該小鼠模型的主要病理生理特征，以探討絲氨酸蛋白酶抑制劑和抗氧化劑對COPD的潛在作用。Jiang等[63]構建家族序列相似性13A-/-小鼠，并與同等暴露于煙草煙霧中的家族序列相似性13A+/+小鼠進行比較發現，前者對煙草煙霧暴露有抵抗能力，證實家族序列相似性13A基因為COPD易感基因。Richmond等[64]發現，聚合免疫球蛋白受體缺陷小鼠氣道內分泌型免疫球蛋白A分泌減少，導致呼吸道對常駐肺微生物區系的先天免疫反應的持續激活，進而出現進行性小氣道重塑和肺氣腫改變。目前已有α1抗胰蛋白酶、轉化生長因子-β等基因改造動物模型可供選用[12]，該模型具有遺傳穩定性及重復性，可從分子水平分析特定基因的作用及功能，探索免疫及基因靶向治療；但COPD非單基因致病，具有罕見表型，建立符合人類COPD基因組的動物模型仍需深入研究。

2.6多種方法聯合

2.6.1以煙草煙霧暴露為主 單純煙草煙霧暴露構建COPD模型耗時長，多用于構建COPD穩定期表型；目前多采用煙草煙霧暴露聯合方案，可有效縮短建模時間，建立COPD急性加重期表型。如聯合應用氣道內滴注病原體[46,65]、LPS[26-27]、彈性蛋白酶[48,66]、PM2.5混懸液滴注[67]，腹腔內注射CSE[30]等。

2.6.2以氣管內滴注LPS為主 單純氣管內滴注可誘發氣道內急性炎癥反應，可聯合其他誘導因素加強誘導肺組織的形態結構改變，縮短建模時間，并模擬具有氣道炎癥反應、氣道重塑、肺氣腫表現的典型COPD特征的動物模型，如氣管內滴注LPS+蛋白酶[9]、LPS+CSE[68]、LPS氣管內滴注+煙草煙霧暴露[26]、機動車尾氣暴露[69]。

2.6.3其他聯合方法 在建模過程中，聯合應用中醫辨證學可達到更穩定的實驗效果[70]。不同聯合方案也不斷出現，如基因工程技術增加誘導因素敏感性+誘導因素[63-64,71]、CSE+蛋白酶[72]、血管內皮生長因子阻滯劑聯合低氧暴露[61]等。采用何種誘導因素聯合方案主要取決于實驗研究目的，在已明確的單因素誘導機制作用下聯合其他因素誘導，以縮短建模時間或構建復雜表型。目前，應用于實驗研究的建模方案較多，但仍未構建出完全符合人類COPD所有特征的動物模型。

3 動物模型評價

理想的COPD動物模型應與人類COPD有相似的致病因素及疾病發生發展過程，即呈進行性發展的不完全可逆的氣流受限以及氣道炎癥、氣道重塑、肺氣腫、氧合功能下降等病理生理改變[21]，并具有切合實驗目的且更具有價值及意義的評價方法。崔紅新等[73]以肺功能、肺組織形態學、肺泡灌洗液分析、炎癥指標等指標評估COPD模型，而多數實驗主要采用肺功能、肺組織病理改變、炎癥水平進行評價。

3.1行為學分析 在建模過程中，通過觀察實驗動物的行為學改變進行模型評價，如口鼻腔分泌物增多[70]，活動耐量下降，體重增長緩慢[30]等行為學變化，該法簡單、直觀，但影響動物行為變化的因素較多，缺少標準評價方法。

3.2肺功能分析 肺功能測定有無創和有創兩種方法[74]。有創肺功能測定指在麻醉狀態下行氣管插管，通過肺功能儀記錄動物被動呼吸的氣道阻力、肺順應性及彈性、敏感性和特異性，可直接觀察用藥前后肺功能改變[75]，由于為非正常生理狀態下肺功能測定，且不能縱向多次檢測等，較少采用。無創肺功能測定包括體積描記法、脈沖震蕩法等[74]，可在生理狀態下多次重復測量，被較多采用。常測定的肺功能指標包括氣道阻力、肺順應性、用力肺活量等，其中以氣道阻力相關性較大[73]。通常測定0.05、0.1、0.2、0.3 s的用力呼氣量，并分析0.3 s用力呼氣量/用力肺活量、0.2 s用力呼氣量/用力肺活量等參數。

3.3肺組織病理學分析 肺組織病理檢測是COPD動物模型最重要的指標，可完成多種檢測進行相關分析。鐘小寧等[76]觀察直徑≤1 100 μm(管腔最短徑/最長徑≥0.7)的膜性細支氣管，并通過評分表量化氣道炎癥水平；應用蘇木精-伊紅染色測定平均內襯間隔、肺泡破壞指數等，評估肺泡破壞情況[30]；通過Masson染色觀察氣管厚度等，評估氣道重塑[74]；通過AB-PAS染色檢測黏多糖分泌情況；應用TdT介導dUTP末端標記技術分析細胞凋亡情況；應用免疫組織化學法進行生物信號通路、自噬等相關分析[30,58]。

3.4炎癥水平分析 肺泡灌洗液和血液中的炎癥細胞及炎癥介質水平也是評價COPD模型的常見指標，通常對準確性更高的肺泡灌洗液中的炎癥相關指標進行分析，如白細胞總數、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、CD4+、CD8+及炎癥介質、氧化抗氧化指標、金屬蛋白酶/抗金屬蛋白酶、趨化因子等[5,9,44,73,77-78]，其中白細胞總數及分類計數較常用且準確性較高[73]。

3.5影像學分析 微型計算機斷層掃描的分辨率達納米級，可無創并長期動態觀察肺組織結構變化，并進行定性和定量分析。Kobayashi等[9]應用微型計算機斷層掃描檢測肺泡平均線性截距、肺體積、炎癥表現，并進行肺臟三維重建，可更好地分析肺臟體積改變，其評價參數中以低衰減面積百分比最為敏感。微型計算機斷層掃描的空間及時間分辨力高，聯合衍射增強成像方法可對早期肺氣腫進行評估，發現微觀結構改變[61,79]。

3.6其他指標 除上述評價內容外，其他常見指標[61](如血氣分析、呼吸肌功能、肺血流動力學)亦可用于COPD模型評價，其中肺臟血流動力學檢測可應用于評估COPD模型是否合并肺動脈高壓、慢性肺源性心臟病等并發癥。

4 小 結

鼠類被普遍用于構建COPD模型，具有基因明確、品系多、研究技術成熟等優勢，是較理想的COPD模型實驗對象。不同誘導因素具有獨特的研究價值，需根據實驗目的選擇合適的建模方案，并根據模型特點選擇相應的檢測指標，結合結構、功能、病理生理、細胞、分子水平指標綜合考量，使研究具有客觀性、準確性、可重復性。隨著對空氣污染物的重視以及基因改造技術的發展，使用空氣污染物誘導構建COPD動物模型逐漸興起；此外，無創微型計算機斷層掃描可長期動態評價肺臟結構改變指標，具有重要應用價值。人類COPD病因、發病機制、病理生理改變復雜，單因素誘導構建COPD模型耗時長、效果欠佳、特征分離，目前常采用的多因素聯合誘導建模方法可提高建模效率、構建復雜表型，但仍未能完全模擬人類COPD特征。隨著基因改造技術、誘導條件的不斷改進以及COPD動物模型的不斷發展，終將構造出更切合人類COPD特征的動物模型，以為預防及治療COPD提供更好的研究平臺。