Wnt/β-catenin信號通路在骨肉瘤中的機制研究進展

王安然，張文凈，王朝夫

骨肉瘤是一種惡性骨腫瘤，發病人群以兒童及青少年為主，累及長骨干骺端、股骨遠端及腔骨近端等[1-2]。目前，骨肉瘤的診斷和臨床治療有了明顯的改善，但仍有50%的骨肉瘤患者在確診時已發生遠處轉移，外科手術的治愈率不足20%，隨著放、化療治療方案的不斷完善，治療效果有所提高，但骨肉瘤患者5年生存率仍較低[3]。

Wnt是一種具有生物調節作用的分泌蛋白，已知Wnt與多種腫瘤產生及進展存在相關性，如在乳腺腫瘤、結直腸腫瘤、肝腫瘤及胰腺腫瘤等中均存在Wnt異常表達，Wnt相關轉錄因子加快整個通路異常活化，導致腫瘤細胞過度增殖。Wnt信號通路主要分為兩種形式發揮細胞轉導作用，一種是細胞間交流，另一種是自體細胞的交流。Wnt信號通路存在高度保守型，按照信號傳遞方式分為經典及非經典通路途徑，共同發揮生物調節作用[4]。以往文獻證實，Wnt信號通路表達上調能夠加快腫瘤形成，β-catenin是Wnt發生作用的關鍵因子，是信號從細胞質轉遞至細胞核內的關鍵環節[5]。正常細胞內β-catenin含量較少，主要表達于細胞質，另一部分主要與其他信號通路(如GSK-3p)形成復合體，大部分表達于細胞膜，具有調節細胞間黏附作用。β-catenin能夠在Wnt激活時進入細胞核，發揮啟動靶基因而增加腫瘤細胞生長及增殖等作用[6]。目前，關于Wnt/β-catenin信號通路與骨肉瘤的產生、治療的相關文獻較少。因此，探討Wnt/β-catenin在骨肉瘤中的作用對了解疾病發生、發展機制具有重要作用。本文針對Wnt/β-catenin信號通路在骨肉瘤中的機制研究進展作一綜述。

1 Wnt信號通路及相關蛋白

Wnt是在乳腺癌小鼠模型中發現的具有細胞生長發育調節作用的蛋白，能夠導致果蠅無翅，隨著分子生物技術的進步在人類器官中發現了Wnt基因。Wnt能夠結合自身細胞膜上的受體發揮生物作用，但是不同Wnt蛋白在不同生理病理中存在特異性[7-8]。Yun等[9]的研究結果證實Wnt蛋白中一個半胱氨酸能夠被棕櫚酰化，提示Wnt蛋白受脂質化調節。Frizzled1(FZD1)是FZD基因家族，是參與編碼Wnt受體蛋白的基因，FZD1為反復7次跨膜蛋白，其是Wnt信號通路的受體蛋白，能夠參與Wnt經典及非經典通路途徑[10]。蓬亂蛋白(dishevelled, DVL)是Wnt信號調節蛋白，由670個氨基酸殘基組成，作為關鍵的中間信號分子介導不同Wnt信號通路的激活,其包括3個高度保守的結構域DIX、PDZ和DEP，其中DIX結構域介導經典Wnt信號，DEP結構域在非經典Wnt信號通路中起作用，而中間的PDZ結構域在兩種通路中均起作用[11]。

2 β-catenin結構及功能

β-catenin是由多肽鏈組成的位于人體染色體3p21-3p22的蛋白，因位置不同而存在兩部分功能：(1)β-catenin能夠在細胞膜上與E-cadherin結合后發揮細胞之間連接作用；(2)參與Wnt信號通路，可以作為下游因子在細胞核中激活核轉錄因子而啟動細胞轉錄作用[12-13]。正常情況下，β-catenin主要集中在細胞膜，少部分與GSK-3β及軸素形成多聚蛋白聚合物，導致β-catenin磷酸化，進一步被泛素蛋白所降解保持低水平狀態。但當Wnt活性升高時，FZD1能夠連接其他信號蛋白形成復合物，抑制GSK-3β對β-catenin的降解能力，增加細胞質中β-catenin的含量，當β-catenin含量達到一定水平時能夠從細胞質中進入細胞核，發揮腫瘤信號傳導作用[14]。

3 Wnt/β-catenin信號通路的組成及調節因子

Wnt/β-catenin信號通路傳導分別在細胞膜、細胞質及細胞核等完成，Wnt啟動依賴于β-catenin進入細胞核而發揮作用。目前，關于Wnt/β-catenin信號通路的研究逐漸深入，其調節因子包含多種。RNF43和ZNRF3均是Wnt/β-catenin信號通路負性調節因子，能夠快速識別Wnt受體并能夠快速溶解酶破壞而特異性介導FZD受體多泛素化。R-脊椎蛋白1(R-spondin1, Rspo1)是位于人胚胎的腦cDNA的新基因，可在人胚胎及肌肉組織中亦被檢測到。Rspo1蛋白可以激活Wnt/β-catenin信號通路[15-16]。

4 Wnt/β-catenin信號通路與骨肉瘤的發生、發展

常用的人骨肉瘤細胞株有SAOS-2、U2OS、143B等，骨肉瘤的發生、發展與多信號通路激活或沉默相關，Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤產生具有相關性，Wnt3a和Wnt10b能夠增加骨肉瘤實驗中小鼠病灶的轉移，與激活β-catenin表達相關。相關實驗結果證實，Wnt信號能夠通過自分泌或旁分泌方式參與骨肉瘤細胞的轉移而降低患者的生存率[17-18]。體外實驗結果發現[19]，激活Wnt5a、U2OS細胞株后細胞顯示出明顯的侵襲性，抑制Wnt5a會抑制骨肉瘤的侵襲力。Wnt5b能夠聯合酪氨酸激酶樣孤獨受體-2(ROR2)共同促進骨肉瘤細胞的增殖、生長及轉移，臨床認為可以通過干預該信號通路發揮治療骨肉瘤的作用。黏結蛋白聚糖2(syndecan-2, SDC2)為抗腫瘤效應的調節劑，在骨肉瘤細胞中Wnt/β-catenin信號通路具有抑制SDC2的表達，反向調節能夠利用Wnt信號通路拮抗劑分泌型卷曲相關蛋白1(SFRP1)而增加SDC2的表達，進而改善骨肉瘤疾病的進展[20]。RhoA信號通路是治療骨肉瘤的靶點指標，抑制RhoA表達能夠提高SDC2活性而改善疾病進展，為探索Wnt信號通路在骨肉瘤的發展中提供新的治療思路。

β-catenin在骨肉瘤組織中的陽性率為70%，與癌旁組織中的表達存在差異。骨肉瘤細胞發生侵襲作用的條件之一為β-catenin，在細胞核內β-catenin含量增加能夠促進骨肉瘤細胞上皮-間質轉化，增加干細胞形成，上述兩種能力均能夠增加骨肉瘤細胞的生長及擴散，加快腫瘤細胞的侵襲及遷移[21]。通過調控人骨肉瘤SAOS-2細胞株中PI3K/AKT/GSK-3β信號通路和抑制氧化應激可抑制腫瘤細胞的生長。β-catenin在骨肉瘤的表達與骨肉瘤的發生、發展和轉移密切相關，可能在骨肉瘤細胞侵襲、轉移的過程中起重要作用，β-catenin可作為骨肉瘤診斷和預測轉移的指標。Yang等[22]的實驗結果證實，在骨肉瘤細胞中Wnt/β-catenin信號通路中的抑制因子-1(WIF-1)的表達水平顯著降低。WIF-1表達降低與Wnt/β-catenin信號通路激活相關，上述結論在眾多腫瘤細胞中得以證實，如WIF-1基因在甲狀腺乳頭狀癌中表達下調，促進了β-catenin蛋白在細胞質中的累積，導致靶基因Cyclin D1過度激活。WIF-1能夠通過抑制β-catenin表達上調Cyclin D1表達而加快甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖及轉移。在膽管癌中，WIF-1啟動子的甲基化導致其在膽管癌細胞中表達下降，進而不能抑制Wnt/β-catenin信號通路而發揮抑癌作用。WIF-1在膽管癌發生、發展及轉移過程中起極其重要的作用。在骨肉瘤細胞體外研究中，WIF-1表達降低，能夠導致β-catenin蛋白在細胞質中異常積聚，從而使經典Wnt信號通路過度激活，參與細胞的生長、增殖，促進疾病的發展。Wnt/β-catenin信號通路中存在多種致癌因子，研究發現骨形態發生蛋白9(BMP9)過表達對人骨肉瘤MG63細胞有正性調節作用，該調控作用可能與Wnt/β-catenin信號通路表達激活相關[23]。TIKI2基因在骨肉瘤組織中表達降低，過表達能夠減少骨肉瘤細胞的生長和侵襲，這與TIKI2能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路激活相關。在骨肉瘤中，FHL2作為一種致癌因子，沉默FHL2表達可明顯抑制骨肉瘤U2OS細胞增殖并促進細胞凋亡，使細胞阻滯于G0/G1期，FHL2介導了p53對Bax啟動子的轉錄調節作用。相反，FHL2表達升高時能夠促進Wnt/β-catenin信號通路激活導致腫瘤形成。

國內最新研究證實，Wnt/β-catenin通路也參與了骨肉瘤的發生、發展，促進細胞外基質的調節，使腫瘤細胞具有侵襲性，誘導腫瘤細胞的免疫耐受和血管生成，最終導致轉移擴散的增加[24]。另外，骨肉瘤細胞中典型Wnt信號通路的異常激活似乎與細胞增殖、上皮-間質轉化過程的誘導、骨肉瘤促腫瘤細胞干細胞特性的獲得以及轉移擴散密切相關[25]。在前列腺癌骨轉移PC-3細胞中Wnt/β-catenin信號表達活躍，是Wnt配體(Wnt2和Wnt8b)過度活化增加腫瘤細胞生物活性作用，在抑制Wnt2和Wnt8b表達后能夠抑制腫瘤細胞增殖及降低骨損傷，基于以上背景，通過給予白鮮堿干預后，β-catenin的核異位增加以及促進β-catenin抑癌作用的靶基因表達增加，癌細胞活性降低。但是部分研究者認為Wnt通路在骨肉瘤中失活，晚期Wnt通路活化促進腫瘤干細胞參與耐藥或轉移[18]。

最新國際研究[26]，骨肉瘤細胞中Wnt/β-catenin存在異常激活，在原發性或繼發性骨腫瘤中能夠發揮加快骨肉瘤細胞轉移等作用。Wnt/β-catenin信號通路能夠通過增加降低骨肉瘤細胞自噬而加快疾病發展。骨肉瘤細胞轉移過程中相關信號生物學的改善與腫瘤化療抵抗性相關，因此針對性改變相關信號通路分子生物學能夠顯著升高患者的臨床療效。余湘等[27]的實驗結果證實，Wnt/β-catenin信號通路能夠沉默Beclin1基因而減少MG63骨肉瘤細胞的凋亡，提示Wnt信號與骨肉瘤細胞化療藥物耐藥性存在相關性。

5 Wnt/β-catenin信號通路在骨肉瘤防治中的研究

Wnt/β-catenin信號異常活化參與骨肉瘤的生物學行為，侵襲及遷移是骨肉瘤細胞最基本的特征，Wnt/β-catenin信號通路能夠通過增加骨肉瘤細胞的侵襲及遷移加快疾病的肺轉移，惡化病情。目前，臨床關于抑制Wnt/β-catenin信號通路阻礙下游信號通過的研發主要由藥物以及酶類抑制劑組成。

5.1 GSK-3β抑制藥物近些年，關于針對GSK-3β信號通路的抑制因子及藥物逐漸被發現，并已經應用于體外實驗研究中。青蒿素存在抗骨肉瘤的作用，雙氫青蒿素抑制人骨肉瘤細胞143B增殖及侵襲作用顯著，這與能夠減少腫瘤血管生成及抑制MMP-9的活性相關，但是青蒿素對骨肉瘤的抑制作用還能夠通過抑制其他因子而發揮作用，青蒿素能夠降低骨肉瘤細胞中GSK-3β的表達而抑制β-catenin水平，研究機制在于青蒿素能夠抑制GSK-3β下游因子Dvl蛋白，發揮Dvl蛋白對GSK-3β及復合物的降解作用而使其活性抑制，從而降低了Wnt/β-catenin信號通路傳導作用，能夠改善骨肉瘤。向雨晨等[28]的研究結果證實，重樓皂苷(PPI)能夠降低骨肉瘤活性的可能機制在于抑制Wnt/β-catenin活性，PPI主要是能夠靶向抑制GSK-3β活性，進一步下調β-catenin表達改善病情。

5.2 β-catenin抑制藥物夾竹桃苷能夠發揮抗骨肉瘤細胞活性作用，研究機制與夾竹桃苷能夠抑制β-catenin從細胞質進入到細胞核，降低了Wnt/β-catenin合成及信號傳導作用而改善病情。Lee等[29]的熒光素酶報告顯示，抑制GSK-3β因子轉錄能夠下調Wnt/β-catenin信號通路中的MMP-2和MMP-9，進而減少骨肉瘤細胞的侵襲及遷移。過表達β-catenin能夠增加骨肉瘤細胞系MG-63的體外增長，但是特異性抑制β-catenin基因后能夠抑制細胞侵襲及轉移，而淫羊藿苷與特異性抑制β-catenin基因作用相似，亦能夠降低細胞的生物活性，機制是能夠下調GSK-3β表達而間接抑制Wnt/β-catenin信號通路活性相關。

5.3 酶類抑制劑研究證實，酶類物質環氧化酶COX2塞萊希布能夠通過激活GSK-3β信號通路減少β-catenin信號異常激活而降低細胞核中轉入，增加Wnt/β-catenin信號通路降解而減少骨肉瘤細胞的生長、侵襲及遷移等。TIKI2是抑制Wnt/β-catenin信號通路蛋白酶，在骨肉瘤細胞中表達降低，能夠通過抑制下游GSK-3β信號通路的活性，去除N-末端氨基酸而Wnt/β-catenin被寡聚化而失活。通過腺病毒轉染TIKI2恢復其表達后促進β-catenin的磷酸化GSK-3β表達，減少細胞核β-catenin水平，抑制了骨肉瘤細胞增殖[30]。

6 小結

Wnt/β-catenin屬于經典信號通路，能夠調節骨肉瘤細胞的分化、增殖及凋亡。目前，靶向調控Wnt/β-catenin信號通路活性已為臨床干預骨肉瘤提供新思路。但是，現階段還處于研究及探索階段，臨床研究較少。關于此類的研究主要集中在細胞實驗及動物實驗，能夠證實干預Wnt/β-catenin信號通路對骨肉瘤細胞增殖有抑制作用。但是部分學者提出抑制Wnt/β-catenin信號通路對骨肉瘤疾病有改善作用的同時是否能夠導致其他不良反應的發生。因此，在后續的研究中應加深對骨肉瘤研究機制的探討，觀察導致Wnt/β-catenin信號通路激活的相關特異性標記因子，開發靶向抑制藥物，為臨床應用提供強有力的實驗證據。