碳酸氫根傘在原發性膽汁性膽管炎發病機制中的作用

常英昊， 景 丹， 徐文姣， 周曉蕾， 王孝平， 湯善宏

西部戰區總醫院 消化內科， 成都 610083

原發性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis, PBC)是一種自身免疫性疾病，其主要病理特征為免疫系統特異性識別并殺傷肝內膽管上皮細胞，導致肝內小膽管漸進性消失，引起肝內膽汁淤積，致使肝組織反復再生并導致纖維化與肝硬化。PBC的發病機制尚未闡明，研究[1]顯示PBC中膽管上皮細胞在氧化應激等有害因素作用下易于發生凋亡，凋亡細胞所產生的自身抗原可被其他膽管上皮細胞攝取并呈遞給免疫系統，從而激活免疫應答并對膽管造成免疫損傷。近年來有研究[2-3]提出膽管碳酸氫根(HCO3-)傘的概念，指出膽管上皮細胞分泌HCO3-并在細胞表面形成HCO3-薄膜，HCO3-薄膜可阻擋膽汁酸自由擴散進入細胞，保護膽管上皮細胞免受疏水性膽汁酸介導的氧化應激與細胞損傷，從而減少凋亡細胞與自身抗原的產生。HCO3-傘被破壞可能是PBC發病機制的重要環節，了解HCO3-傘的產生機制與影響因素有助于闡明PBC發病機制和發現治療靶點。現將有關PBC中膽管HCO3-傘的研究進展擇要介紹如下。

1 膽管上皮細胞分泌HCO3-的生理功能

膽管上皮細胞所分泌的HCO3-在膽汁酸代謝中具有重要作用，其生理功能包括：(1)維持膽汁流動；(2)促進膽汁成分的代謝；(3)使膽汁呈堿性以促進營養物質的消化吸收；(4)在膽管上皮細胞表面形成“HCO3-傘”[4-6]。其中形成HCO3-傘并保護膽管上皮細胞免受膽汁酸損傷的功能與PBC病理生理直接相關。膽汁酸在肝細胞中由膽固醇合成，通過膽汁酸鹽輸出泵跨過肝細胞頂端膜排入膽管后與磷脂、膽紅素等多種成分混合形成膽汁。膽管上皮細胞膜外的負電荷吸引膽汁酸鹽與質子結合形成的膽汁酸，導致膽汁酸鹽通過自由擴散穿越胞膜進入細胞，使其發揮細胞毒性作用并通過氧化應激等途徑造成細胞損傷。膽汁酸鹽通過與磷脂酰膽堿形成膠束[7-8]，可減少膽汁中具有細胞毒性的游離膽汁酸含量。盡管如此，膽管上皮細胞仍暴露在毫摩爾濃度的游離膽汁酸鹽中。為防止疏水性膽汁酸鹽誘導的細胞凋亡，膽管細胞具有針對膽汁酸鹽的保護機制。碳酸氫鹽薄膜(也稱為HCO3-傘)是膽管上皮細胞的重要保護機制，碳酸酐酶催化CO2水合生成HCO3-和H+是膽管上皮細胞分泌HCO3-的主要來源，之后HCO3-通過陰離子交換蛋白(anion exchanger protein，AE)2分泌到膽汁中，Na+/H+交換蛋白將H+轉運出細胞，共同調節膽汁的pH值。糖萼是膽管上皮細胞頂端膜上的糖蛋白，可富集HCO3-并在頂端膜附近形成堿性微環境，從而形成HCO3-傘[9]。HCO3-與膽汁酸發生化學反應使其脫去質子形成膽汁酸鹽，從而防止膽汁酸通過自由擴散進入膽管上皮細胞并介導細胞損傷與凋亡[6]。

2 膽管上皮細胞中HCO3-分泌的相關機制

膽管上皮細胞中HCO3-的分泌受到多種因素共同調控[10]。在膽管上皮細胞中，促胰液素與乙酰膽堿分別作用于基底膜上的促胰液素受體(secretin receptor,SR)與M3毒蕈堿型受體(muscarinic type-3 receptor,M3R)激活HCO3-分泌的信號通路。促胰液素作用于SR，激活跨膜腺苷酸環化酶(tmAC)產生環磷酸腺苷(cAMP)，cAMP活化囊性纖維化跨膜電導調節器(CFTR)并將Cl-轉運出細胞，由AE2在轉運Cl-進入細胞的同時完成HCO3-的分泌[11]；并且CFTR活化后可促進細胞內ATP通過旁分泌作用于頂端膜上的嘌呤受體P2Y，由P2Y激活內質網上的鈣離子通道3型肌醇三磷酸受體(InsP3R3)并釋放Ca2+，Ca2+通過鈣激活氯通道TMEM16A將Cl-轉運出細胞從而促進HCO3-的分泌[12]。在完成HCO3-分泌的同時，促胰液素還可誘導cAMP和微管依賴的囊泡在細胞內遷移并將含有CFTR與AE2的囊泡定位到頂端膜，協助相關離子的轉運與HCO3-的分泌[13]。乙酰膽堿作用于膽管上皮細胞基底膜外側的M3R，M3R與G蛋白偶聯并動員磷酸肌醇生成肌醇三磷酸，肌醇三磷酸與1型和2型肌醇三磷酸受體結合并釋放內質網中的Ca2+進入胞漿，再通過TMEM16A增強促胰液素誘導的HCO3-分泌[9]。在上述信號通路中，Ca2+與SR等多種物質均可活化腺苷酸環化酶并產生cAMP，但由于細胞內磷酸二酯酶的存在以及cAMP具有選擇性和特異性，不同信號通路所產生的cAMP只能在很小的分布范圍中發揮各自的生物學效應[14]，并不會出現相互干擾的情況。

PBC患者存在膽管上皮細胞pH升高的現象。考慮到HCO3-是膽管上皮細胞調控膽汁酸堿性的主要物質，pH升高可能與HCO3-分泌障礙有關。為了解PBC患者的HCO3-分泌情況，有研究[15]采用同位素示蹤法通過對注射H11CO3-的患者進行正電子發射計算機斷層顯像檢測，結果顯示在促胰液素刺激的條件下，PBC患者的HCO3-的分泌水平與健康人群相比明顯降低，PBC患者膽管上皮細胞向膽汁中分泌HCO3-的功能出現異常，當PBC患者接受熊去氧膽酸(UDCA)治療后HCO3-的分泌水平較治療前有明顯提升。并且PBC患者中cAMP刺激膽管上皮細胞分泌的HCO3-水平降低，負責Cl-/ HCO3-轉運的AE2活性也出現下降。因此膽管上皮細胞的HCO3-分泌功能障礙導致HCO3-在胞內積累使得pH升高，進一步導致HCO3-傘的破壞，引起膽汁酸介導的細胞損傷與凋亡[1]。

3 PBC中膽管上皮細胞分泌HCO3-的影響因素

為進一步探究膽管上皮細胞HCO3-分泌障礙的原因，現有研究從HCO3-分泌機制著手，探索出多個可能影響膽管上皮細胞中HCO3-分泌的因素。

3.1 miR-506/AE2/sAC軸 AE2是膽管上皮細胞向膽汁中轉運HCO3-的唯一通道，Brian等[16]發現AE2 mRNA在PBC患者肝臟中的表達水平明顯低于在其他原因的肝硬化與膽汁淤積患者肝臟中的水平。PBC患者肝臟中AE2 mRNA水平與其血清GGT水平呈負相關，而且在接受UDCA治療的PBC患者中，肝臟AE2 mRNA水平有所升高，介于未接受治療患者和健康人群之間[16]，提示AE2表達降低可能與膽汁淤積有關。此外，AE基因在PBC患者其他細胞中的表達也出現異常。PBC患者的AE2基因在外周血單核細胞中的表達水平比健康人群以及其他原因的膽汁淤積或肝硬化患者更低，同時外周血淋巴細胞中AE1的mRNA水平明顯升高，該現象可能是由于AE2表達下降使得AE1表達代償性增高所致[1]。由此可見PBC患者AE2表達下降是導致膽管上皮細胞HCO3-分泌下降的原因。

為探究AE2表達下降的原因，有研究[17-18]從PBC患者異常表達的miRNA中篩選出結合于mRNA的3′端非翻譯區并下調AE2表達的miR-506。miR-506表達水平在PBC患者的肝組織中升高，而在其他肝病患者的肝組織與正常肝組織中沒有升高，并且PBC患者膽管上皮細胞AE2活性降低的現象可以被抗miR-506的寡核苷酸逆轉。miR-506在人膽管細胞系中過度表達不僅降低AE2表達并減少HCO3-分泌水平，還使得細胞對膽汁酸鹽誘導的細胞凋亡更為敏感并出現丙酮酸脫氫酶復合體E2亞單位過表達等PBC特征性改變[19]。雖然miR-506與AE2表達密切相關，但PBC患者膽管細胞、肝細胞和外周血單個核細胞都存在AE2表達下調的現象，而上述細胞中miR-506上調的現象僅在膽管細胞中出現[18,20]。此外PBC患者膽管上皮細胞在體外培養條件下仍存在miR-506上調的現象，提示miR-506上調可能與表觀遺傳有關。除了下調AE2表達之外，Meenakshisundaram等[20]發現miR-506也可作用于InsP3R3的mRNA 3′端非翻譯區并抑制其表達，從而下調HCO3-的分泌。

AE2表達下調將導致HCO3-在膽管上皮細胞內積累，可溶性腺苷酸環化酶(sAC)[21]作為HCO3-感受器，能夠被HCO3-活化并使得細胞易于發生凋亡。H69膽管細胞中AE2的敲除使得sAC表達增加，并且抑制sAC使得AE2缺陷型H69膽管細胞對多種膽汁酸鹽誘導的細胞凋亡不再敏感[22]。前文提到tmAC可通過cAMP促進HCO3-的分泌，雖然sAC與tmAC同屬腺苷酸環化酶家族[14]，但是二者存在諸多差異[23]：首先，sAC主要存在于胞漿、線粒體和細胞核中而tmAC主要在細胞膜上表達；其次，sAC的活化主要依賴HCO3-并由Ca2+進行微調，而tmAC則受到激活G蛋白偶聯受體的細胞外信號調控；第三，sAC與tmAC存在互相拮抗的功能，sAC可促進氧化應激誘導的細胞凋亡過程并具有削弱細胞屏障的作用，tmAC則具有抑制凋亡與增強細胞屏障功能的功能。膽管上皮細胞中存在sAC與tmAC相互拮抗的平衡狀態，而HCO3-的積累使sAC活性增加并通過細胞色素C和蛋白酶caspase 3相關的凋亡途徑參與膽汁酸鹽誘導的膽管上皮細胞凋亡。

由此可見，miR-506/AE2/sAC軸通過下調HCO3-分泌引起HCO3-在細胞內積累與HCO3-傘的破壞，最終導致膽汁酸介導的膽管上皮細胞損傷與凋亡。Chang等[23]報道了miR-506/AE2/sAC軸作為PBC重要發病機制的假說：miR-506的基因位于X染色體上，膽管細胞中X染色體連鎖的表觀遺傳改變激活了miR-506表達，上調的miR-506從翻譯水平抑制AE2表達，減少HCO3-的分泌并導致HCO3-傘的破壞，同時在胞內積累的HCO3-可上調sAC活性并促進膽汁酸誘導的膽管上皮細胞凋亡；除引起自身抗原表達外，膽管上皮細胞凋亡意味著膽道屏障破壞，可使得膽汁酸直接作用于肝細胞并造成損傷，同時膽汁酸等有毒物質導致的急性損傷遷延形成慢性炎癥，持續促進細胞的氧化應激損傷與炎性細胞因子的產生，進一步上調miR-506表達，這種惡性循環最終導致膽管細胞衰老、膽管減少和肝硬化。而女性個體中由于兩個X染色體均被激活，導致相關基因的表達量明顯增高，造成發病率出現明顯的性別差異。該假說為PBC以女性患者為主以及膽管上皮細胞凋亡并產生自身抗體等現象提供了合理解釋，為揭示PBC發病機制提供了重要的理論依據。

3.2 脂多糖(LPS) 既往研究[24-25]通常認為LPS在PBC中通過Toll樣受體4被膽管上皮細胞識別，激活核因子κB(NF-κB)等核轉錄因子并促進IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α等炎性細胞因子的產生，從而激活免疫細胞并導致炎癥。值得注意的是，人NF-κBp65的3′端非翻譯區含有miR-506的應答序列，miR-506可下調NF-κBp65亞基的表達水平。在LPS誘導的小鼠炎癥模型中，miR-506過表達并發揮改善LPS所介導炎癥損傷的作用[26]。最新研究[27]發現，LPS在膽管細胞和膽管癌細胞中激活NF-κB可導致InsP3R3表達下降并影響Ca2+的釋放，進而可能影響HCO3-分泌。作為PBC潛在的危險因素，LPS引起的炎癥反應可能導致miR-506表達上調，從而參與下調HCO3-分泌及膽汁酸介導的細胞損傷和凋亡，LPS在PBC中的作用機制及其影響值得進一步研究。

3.3 G蛋白偶聯膽汁酸受體(TGR)5 膽汁酸鹽通過與膽管上皮細胞中的多種配體結合，可發揮介導Cl-和HCO3-分泌以及促進細胞增殖等生物學效應。其中膽汁酸鹽通過與TGR5結合實現激活Cl-和HCO3-分泌的功能。膽汁酸鹽通過作用于TGR5激活G蛋白，進一步活化腺苷酸環化酶，通過cAMP激活CFTR，啟動Cl-和HCO3-的分泌過程。另外TGR5在膽管上皮細胞中還具有通過激活蛋白激酶A促進抗凋亡信號轉導以及激活表皮生長因子受體促進細胞增殖等效應[3]。雖然TGR5參與了HCO3-的分泌過程，但尚未發現TGR5與PBC患者HCO3-分泌功能障礙和疾病進展是否有關。

3.4 堿性磷酸酶 堿性磷酸酶除了作為膽汁淤積與預后的標志物外，還通過介導ATP去磷酸化和調控嘌呤受體P2活性參與HCO3-的分泌過程。堿性磷酸酶的活性取決于膽管上皮細胞外pH，pH較高時催化ATP去磷酸化的活性也較高。由此可見，堿性磷酸酶介導ATP去磷酸化，抑制ATP通過旁分泌激活TMEM16A，從而下調HCO3-分泌并調控頂端膜外pH[9]。雖然堿性磷酸酶在HCO3-水平升高條件下對其分泌具有負性調控作用，但HCO3-分泌受阻時堿性磷酸酶的作用仍有待進一步研究。考慮到PBC患者廣泛存在膽汁淤積現象并且堿性磷酸酶的合成與釋放均增加，堿性磷酸酶對于PBC患者膽管上皮細胞HCO3-分泌的影響值得探究。

3.5 M3R抗體與Na+/H+交換蛋白 作為乙酰膽堿受體，M3R是乙酰膽堿介導膽管上皮細胞分泌HCO3-信號通路的關鍵環節。多數PBC患者體內存在M3R抗體[28]，推測M3R抗體可能會影響乙酰膽堿介導的HCO3-分泌，但目前尚不清楚M3R抗體在PBC中的功能。另外，有研究[29]發現PBC患者膽管上皮細胞中Na+/H+交換蛋白活性相比健康人與其他肝病患者出現下降，提示調節細胞外HCO3-水平與pH的H+轉運出現異常，導致該現象出現的原因尚不清楚。目前關于M3R抗體與Na+/H+交換蛋白的研究較少，二者是否與PBC中HCO3-傘的破壞相關仍有待研究。

4 HCO3-傘與PBC治療

作為膽管上皮細胞的重要保護機制，維持HCO3-傘的穩定并恢復其抵御膽汁酸損傷的功能對于PBC患者具有治療價值。現有的PBC治療藥物除了調節膽汁酸代謝并降低游離膽汁酸水平外，還具有調節HCO3-分泌與修復HCO3-傘的作用。

4.1 熊去氧膽酸(UDCA) UDCA除了增加親水性膽汁酸水平、減小膽汁酸鹽的細胞毒性等作用外，也具有刺激膽管上皮細胞分泌HCO3-的作用。研究[9]顯示，UDCA可通過一氧化氮相關信號通路，激活蛋白激酶PKB與磷脂酰肌醇激酶PI3K，促進CFTR依賴的ATP分泌過程，從而上調HCO3-的分泌水平并維持HCO3-傘穩定。此外UDCA同系物去甲熊去氧膽酸也具有促進HCO3-分泌的作用[30]。作為PBC的一線治療藥物，維持HCO3-傘穩定是UDCA的重要作用之一。

4.2 皮質醇類藥物 盡管皮質醇類藥物已被證實對PBC缺乏良好的療效，但地塞米松與布地奈德可在膽管細胞中通過作用于糖皮質激素受體，上調AE2的表達水平從而實現促進HCO3-分泌的功能[9]。雖然皮質醇類藥物療效不佳，但也有助于維持膽道HCO3-傘的穩定。

5 結語

綜上所述，HCO3-傘是膽管上皮細胞抵御膽汁酸損傷的重要保護機制。在miR-506/AE2/sAC軸等因素的作用下，HCO3-分泌障礙導致失去HCO3-傘保護的膽管上皮細胞受到膽汁酸損傷并發生凋亡的理論為PBC患者中自身抗體的產生提供了合理的解釋。由于HCO3-傘可保護膽管上皮細胞免受膽汁酸介導的損傷和凋亡進而減少自身抗原的產生，維持HCO3-傘的穩定對PBC患者而言可能具有重要的治療價值。HCO3-傘的破壞在PBC的發病機制中具有重要作用，當從免疫學角度難以解釋PBC病理生理的全貌時，著眼于HCO3-分泌以及相關的膽汁酸代謝將有助于揭示PBC發生和發展的機制。

利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：常英昊負責收集分析文獻與論文撰寫，同時參與擬定了寫作思路；景丹、徐文姣參與了收集分析文獻以及論文修改；周曉蕾、王孝平參與了收集分析文獻；湯善宏負責擬定寫作思路，指導撰寫文章與最后定稿。