陰離子交換蛋白2與原發性膽汁性膽管炎發病機制的關系

鉏 曦， 邢練軍

上海中醫藥大學附屬龍華醫院 脾胃二科， 上海 200000

1 背景

1.1 原發性膽汁性膽管炎(PBC) PBC舊稱原發性膽汁性肝硬化，是一種進行性、非化膿性、破壞性的針對肝內小膽管的炎癥，可以導致肝損傷、肝內膽汁淤積甚至最終進展至肝硬化[1]。

PBC的疾病發生率在全球不同地區存在較大區別。整個亞太地區(含中國、日本、新西蘭、韓國、澳大利亞)的PBC發病率約為1.188%(每100萬人中118.75例)，其中中國為1.912%(每100萬人中191.12例)[2]。該病好發于中年女性，其主要臨床首發表現為乏力和瘙癢，之后可逐漸出現黃疸，隨后至終末期可見肝硬化失代償的臨床表現(腹水、脾大等)，PBC終末期患者中可并發出現原發性肝癌[3]。PBC的臨床治療方案主要為熊去氧膽酸(UDCA)和奧貝膽酸。其他口服藥物，諸如環孢素、皮質醇、霉酚酸酯等并沒有顯示出明顯優于UDCA的療效[1,3-4]。

目前關于 PBC 發病機制尚未闡明，根據其流行病學特征，學者們認為是由多種因素共同作用產生。有關PBC發病機制的研究當前聚焦在兩個方面：膽管微環境變化所引起的膽汁酸細胞毒性增加和對于膽管上皮細胞的自身免疫反應增強。有學者[5]認為這兩者存在先后關系，存在一個始作俑者，后者由前者誘發。然而，筆者認為這樣的探討值得商榷，兩者并不是單向的因果關系，而是彼此互為因果的循環因果關系，陰離子交換蛋白2(anion exchanger 2, AE2)的研究結果支持這一觀點。

1.2 陰離子交換蛋白2(AE2) AE2是AE家族中的一員，是一種在細胞膜上的陰離子交換蛋白，主要作用是交換細胞膜內外的HCO3-/Cl-，同屬于這一家族的還有AE1、AE3。AE2分為AE2a、AE2b、AE2c三個變體，變體各自在生理學功能上的區分目前仍處于研究中。AE2主要分布在上皮細胞的外側基底部(正常肝臟的小膽管的外側基底部)[6-7]。在PBC發病過程中至關重要的膽管上皮細胞上亦有AE2。

2 AE2在PBC發病中的作用

最初，AE2被人們注意，是發現在PBC患者肝臟組織和外周血單個核細胞(PBMC)中AE2數量明顯降低，而經過UDCA或其他一些有效治療后，AE2水平又出現了上調[4，8-9]。隨著對AE2和PBC發病之間的研究逐漸深入，目前認為，AE2主要通過兩種方式參與到PBC的發病過程中：參與膽管微環境的改變以及參與對膽管上皮細胞(BEC)的自身免疫反應，且都發揮了重要作用。

2.1 AE2維持膽管微環境的穩定 在正常健康人群的BEC周圍存在一個成分以HCO3-為主的屏障，稱為碳酸氫鹽屏障。在PBC患者中發現該屏障遭到破壞從而導致BEC發生損傷以及凋亡[10-11]。如前所述，AE2可以調節HCO3-濃度，因此認為它是碳酸氫鹽屏障維持穩定的保障[12]。

動物模型實驗證明了上述觀點。在小鼠中人為結扎膽管制造梗阻性膽汁淤積后，肝細胞內和外周血中的AE2 mRNA和AE2數量均有減少。并且結扎后，小鼠細胞中對于HCO3-/Cl-離子交換的效率同對照組相比出現了下降，AE2活性降低。證明膽汁和其中毒性物質在破壞碳酸氫鹽屏障后對BEC和AE2造成損傷，并進一步導致細胞衰老及相應細胞毒性作用[13]。除此之外，膽汁酸所導致的細胞毒性及膽汁酸的結構和PH值存在聯系：疏水程度越高、pH越低，則AE2數量就更低[14-15]。而在服用UDCA，改變膽汁分泌的成分后，PBC以及一些非梗阻性膽汁淤積的患者在病情得到控制的同時，其體內的AE2數量上升，也從側面說明AE2功能對于維持膽道微環境至關重要[9]。經過處理后抑制了AE2的人類BEC可以產生更多的可溶性腺苷酸環化酶(soluble adenylyl cyclase，sAC)，而sAC可以導致膽汁酸對BEC的毒性增強，對其進行抑制則可以降低膽汁酸對細胞的毒性。這表明AE2數目減少會破壞膽管微環境[16]。

綜上，AE2在維持對BEC相對無害的膽管微環境中起到重要作用。當AE2功能由于各種原因受損或數量下降時，膽管微環境發生變化，碳酸氫鹽屏障受損，BEC受到細胞毒性損傷而導致凋亡引起惡性循環。

2.2 AE2參與自身免疫反應調控 將PBC小鼠模型表達AE2a、b的基因敲除后，發現小鼠產生了和PBC類似的改變，包括：AMA抗體陽性、血清IgG和IgM升高、外周血ALP升高、CD8+T淋巴細胞水平增加、調節性T淋巴細胞(Treg)水平降低、膽管內存在大量炎癥細胞[17-18]。進一步研究[19]顯示，在AE2敲除的早期(1～9個月)，肝內T淋巴細胞數量減少，PD-1/PD-L1被激活；在10個月后CD8+T淋巴細胞數目增加使得PD-1受到抑制從而更有利于誘導自身免疫反應。進一步研究AE2和自身免疫反應之間的關系，發現當AE2數量減少時，BEC會產生更多的趨化因子和細胞因子(IL-6、IL-8、CXCL10)，進一步導致BEC受到更多的自身免疫損傷，并使得更多的免疫細胞向BEC周圍移動，讓BEC更易受損和衰老[14]。研究[20]還發現肽鏈(p17AE2)的水平和效應T淋巴細胞、Treg的數量及表達水平有關，而其有助于AE2蛋白完成離子交換。對免疫細胞進行篩選及分離之后進行試驗，結果顯示當有多種淋巴細胞存在時，AE2缺失對于離子交換的影響要遠小于單純只有CD8+T淋巴存在的環境[21]。提示相較于其他淋巴細胞，CD8+T淋巴細胞更加依靠AE2進行HCO3-/Cl-的交換來調節細胞內pH值，從而維持CD8+T淋巴細胞的穩定[22]。而CD8+T淋巴細胞是膽管損傷的關鍵，在PBC患者的肝臟組織、外周血、肝淋巴結中均可以被檢測到較正常人增加[21]。

以上研究表明，AE2對T淋巴細胞和一些細胞因子及趨化因子可以起到調控作用。推測AE2可能通過改變細胞內PH值，影響其特定細胞作用和功能，從而參與自身免疫反應的調控，進而參與到PBC發病過程中的自身免疫反應。

2.3 PBC相關的AE2調控 當前對于AE2的調控主要聚焦在2個方面，表觀遺傳學和microRNA(miRNA)。

對表觀遺傳學的研究顯示，基因甲基化是常見的表觀遺傳學改變，是轉錄抑制的機制。在PBC患者肝組織及PBMC中分離出AE2的mRNA后進行檢測，結果發現在某些片段[AE2的啟動子區域(-274a、-254a、-249)、AE2的可變啟動子區域(-307b2、-280b2、-263b2、-261b2)]上PBC相比其他肝臟疾病及正常對照存在特有的甲基化。從而可能導致后續AE2 mRNA表達降低,從而對AE2產生負調控[23]。對于進一步的甲基化原因以及上述不同甲基化片段各自是否存在不同之處，進而導致PBC不同時期的不同表現仍有待進一步研究。

對miRNA的研究顯示，其通過和mRNA之間互相作用從而影響編碼和翻譯過程，并進一步影響基因及對應蛋白的表達。在肝臟疾病中有許多的miRNA參與了發病的各個過程[24-25]。和正常人相比，PBC患者中發現有35個獨立的miRNA水平出現了變化，其中11個上調、24個下調[26-27]。miRNA-506(miR-506)是上調的11個miRNA之一，其上調導致BEC上AE2活動及表達水平的下降。當受到促炎癥因子包括IL-12、IL-17、IL-18和TNFα刺激時，miR-506的水平會提升，之后與AE2 mRNA的3′端未翻譯區(3′UTR)結合，抑制其蛋白的翻譯，導致AE2活性下降并進一步對AE2的表達進行抑制[28-29]。與此同時研究[26]發現抑制miR-506可以改善BEC中細胞凋亡及損傷，并且降低膽汁酸對它的毒性。提示AE2的水平受到miR-506的調控。

除了上述兩大方面，碳酸酐酶(CA)中的CAⅫ對于激活正常人體細胞上的AE2功能同樣重要，因此有研究者認為CAⅫ發生突變后糖基化異常及錯誤的構型折疊也會引起AE2活性減退，從而引起疾病[30]。另外有相當多的研究[31-32]發現一些藥物諸如戒酒硫(disulfiram)、利福平均對于特定細胞上的AE2表達存在調控及影響。但是此類研究并沒有針對PBC患者或BEC，因此是否對于PBC中的AE2同樣具備調控作用仍然有待進一步研究證實。

3 結論

膽管微環境和自身免疫反應是PBC發病機制中不可忽視的兩個關鍵點，研究顯示AE2對上述兩方面均有參與，因此通過AE2可以將PBC中的部分自身免疫反應和膽管微環境改變聯系起來。進一步研究以期更好地闡明膽管微環境和自身免疫反應之間關系以及PBC發病機制的相關假說。

與此同時，有關AE2仍然有許多問題等待進一步研究和解決：AE2變體之間的區別；miR-506調控AE2的具體機制；miR-506的影響因素；引起AE2表觀遺傳學改變的因素；AE2是否參與到更多的免疫反應；膽管上皮細胞上的AE2如何和其他細胞上的AE2進行區分等。更進一步，通過探索AE2調控及起效的上下游物質，希望可以尋找到潛在的新的PBC治療方法以及相關診斷及預后判斷指標，從而為PBC的診斷和治療提供更多幫助。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：鉏曦負責資料分析，撰寫論文；邢練軍負責指導撰寫文章并幫助修改論文。