防己諾林堿通過Nrf2/NLRP3途徑對去卵巢骨質疏松大鼠骨結構和成骨細胞凋亡的影響

左遠勝，何智圣，付中明，李名武，孫法瑞，周 強

0 引言

骨質疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種全身性骨病，主要特征是骨密度降低、骨量減少、骨組織的微結構退化，具有骨折的趨勢[1-2]。OP由多種因素引起，如衰老、遺傳和雌激素缺乏[3]。更年期婦女可能由于卵巢功能低下而導致雌激素缺乏癥，從而誘發OP，這將導致骨質流失和骨骼脆弱，甚至在嚴重的情況下還會導致骨質疏松性骨折[4]。因此，由雌激素缺乏引起的骨質疏松的研究引起了廣泛的關注。核因子E2相關因子2(Nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)在OP中起重要作用[5-6]。研究表明，Nrf2是骨細胞中骨平衡的重要調節劑，其激活可以增強內源性抗氧化劑對活性氧的抑制作用，從而調節OP的發生[7]。Nrf2通過誘導抗氧化劑和II期解毒酶，在細胞的壽命中對細胞防御抗氧化劑和氧化應激起著重要作用[8]。此外，Nrf2下調了NLRP3介導的炎癥過程和先天性免疫反應[9]。但是，Nrf2/NLRP3途徑對體內骨結構的影響及其在OP中的可能作用尚未完全了解。防己諾林堿(Fangchinoline,FAN)是一種生物堿，具有抗炎活性[10]。防己諾林堿可減弱TNF-α、IL-6和IL-1的產生，并抑制環氧合酶的活性[11]。防己諾林堿還具有較強的自由基清除、降壓、抗癌、抗氧化和抗血栓形成活性[12-13]。但是，防己諾林堿在去卵巢OP中研究甚少。本文嘗試研究防己諾林堿是否對去卵巢骨質疏松大鼠的骨結構和成骨細胞凋亡有影響，其作用機制是否與Nrf2/NLRP途徑有關，為臨床治療OP提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 60只成年雌性SD大鼠(SPF級，200～220 g)購自華中科技大學實驗動物中心。實驗大鼠飼養于標準動物房中，正常飲食飲水。大鼠適應環境2周后進行實驗。

1.1.2 試劑 防己諾林堿購自美國Sigma公司。大鼠血清ALP試劑盒和大鼠OC試劑盒購自杭州誠維生物公司。大鼠IL-6試劑盒和大鼠血清TNF-α試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。HE試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。TUNEL分析試劑盒購自美國Promega公司。RIPA裂解液和BCA試劑盒購自美國Promega公司。兔抗Nrf2抗體、兔抗NLRP3抗體、兔抗GAPDH抗體和山羊抗兔IgG抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 去卵巢OP大鼠模型制備 大鼠經腹腔注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉，麻醉條件下打開大鼠腹腔去除雙側卵巢，逐層縫合。假手術組僅打開腹腔，不切除卵巢。

1.2.2 分組及給藥 SD大鼠分為4組：假手術組(sham組)、OP組、防己諾林堿低劑量組(OP+FAN-L組)和防己諾林堿高劑量組(OP+FAN-H組)，每組15只。OP組、OP+FAN-L組和OP+FAN-H組大鼠按”1.2.1”項進行OP模型制作。

給藥方式：腹腔注射；給藥時間：造模后1周，連續給藥4周；給藥次數：1次/d。Sham組：生理鹽水4 ml/kg；OP組：生理鹽水4 ml/kg；OP+FAN-L組：1 mg/kg防己諾林堿，給藥體積為4 ml/kg；OP+FAN-H組：3 mg/kg防己諾林堿，給藥體積為4 ml/kg。

1.2.3 微型計算機斷層掃描(μCT) 將大鼠脛骨固定在70%的乙醇中，使用Scanco μCT-35儀器進行μCT以評估骨體積和結構。使用Scanco軟件計算骨小梁參數(包括BV/TV、Tb.Th和Tb.Sp)，以分析直接位于脛骨近端生長板遠端的小梁區域。

1.2.4 ELISA ①ALP和OC水平測定：實驗結束后，各組大鼠經3%戊巴比妥鈉麻醉后，于腹主動脈取血，并置于離心管中，3 000 r/min 離心15 min，吸取上層血清。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶聯儀在450 nm波長依序測定各孔的OD值，根據OD值所繪制的標準曲線計算血清中ALP和OC的表達水平。②IL-6和TNF-α水平測定：將各組大鼠骨組織放入到9倍體積的PBS中，用勻漿器分散到勻漿中，在4 ℃以3 000 r/min離心15 min，收集上清液。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶聯儀在450 nm波長依序測定各孔的OD值，根據OD值所繪制的標準曲線查出骨組織中IL-6和TNF-α的表達。

1.2.5 HE染色 各組大鼠股骨在10% NBF中固定，并在10%乙二胺四乙酸(EDTA)中脫鈣3周，包埋在石蠟中，制成5 μm的石蠟切片。切片放入蘇木素染液中5 min，自來水清洗后，置于1%的鹽酸酒精分化數秒，并用流水沖洗。切片放入伊紅染液中染色3 min，流水稍洗。之后切片置于梯度酒精中脫水，各5 min，再放入二甲苯I、II中透明，各5 min。將切片取出，用濾紙輕輕拭干切片上殘余的二甲苯，在組織上滴加中性樹膠封片，使用萊卡顯微鏡進行拍攝。

1.2.6 TUNEL 石蠟切片固定，漂洗并用0.1% Triton X-100浸潤，然后使用TUNEL分析試劑盒對凋亡的DNA片段進行FITC末端標記。熒光顯微鏡觀察FITC標記的TUNEL陽性細胞并拍照。

1.2.7 Western blot 各組大鼠骨組織用RIPA裂解提取總蛋白，用BCA法測定總蛋白含量。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h后，將PVDF膜與以下抗體在4 ℃孵育過夜：兔抗Nrf2抗體(1∶1 000)、兔抗NLRP3抗體(1∶1 000)、和兔抗GAPDH抗體(1∶2 000)。隨后，將PVDF膜用TBST洗滌3次，持續5 min，并與山羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)孵育1 h，用TBST洗滌3次，持續5 min。最后顯影曝光，用Image-Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶的灰度值進行分析。

2 結果

2.1 防己諾林堿對OP大鼠骨組織的影響 μCT結果表明，與sham組相比，OP組大鼠的BV/TV和Tb.Th指數顯著下降(P<0.01)，Tb.Sp指數顯著上升(P<0.01)；與OP組相比，OP+FAN-L組和OP+FAN-H組大鼠的BV/TV和Tb.Th指數顯著上升(P<0.05)，Tb.Sp指數顯著下降(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠骨組織μCT圖像和μCT圖像計算的骨參數注：與sham組比較，**P<0.001；與OP組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.2 防己諾林堿對OP大鼠血清中ALP和OC表達水平的影響 ELISA結果表明，與sham組相比，OP組大鼠血清中ALP的表達水平顯著上調，OC的表達水平顯著下調，差異均有統計學意義(P<0.01)；與OP組相比，OP+FAN-L組和OP+FAN-H組大鼠血清中ALP的表達水平下調，OC的表達水平上調，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠血清中ALP和OC的表達水平注：與sham組比較，**P<0.01；與OP組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.3 防己諾林堿對OP大鼠骨組織中IL-6和TNF-α表達水平的影響 ELISA結果表明，與sham組相比，OP組大鼠骨組織中IL-6和TNF-α的表達水平上調(P<0.01)；與OP組比較，OP+FAN-L組和OP+FAN-H組大鼠骨組織中IL-6和TNF-α的表達水平下調(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠骨組織中IL-6和TNF-α表達水平注：與sham組比較，**P<0.01；與OP組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.4 防己諾林堿對OP大鼠骨組織病理損傷的影響 HE染色結果表明，與sham組比較，OP組大鼠骨組織中骨小梁面積顯著減少(P<0.01)；與OP組比較，OP+FAN-L組和OP+FAN-H組大鼠骨組織中骨小梁面積有所增加(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠骨組織中骨小梁面積變化注：與sham組比較，**P<0.01；與OP組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.5 防己諾林堿對OP大鼠成骨細胞凋亡的影響 TUNEL染色結果表明，sham組TUNEL陽性細胞數量很少；與sham組相比，OP組TUNEL陽性細胞數量顯著增加(P<0.01)；與OP組相比，OP+FAN-L組和OP+FAN-H組TUNEL陽性細胞數量減少(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠TUNEL陽性細胞數量變化注：與sham組比較，**P<0.01；與OP組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.6 防己諾林堿對OP大鼠骨組織中Nrf2和NLRP3蛋白表達的影響 Western blot結果表明，與sham組相比，OP組大鼠骨組織中Nrf2蛋白表達水平顯著下調(P<0.01)，NLRP3蛋白表達水平顯著上調(P<0.01)；與OP組相比，OP+FAN-L組和OP+FAN-H組大鼠骨組織中Nrf2蛋白表達水平上調(P<0.05)，NLRP3蛋白表達水平下調(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組大鼠骨組織中Nrf2和NLRP3蛋白的表達水平注：與sham組比較，**P<0.01；與OP組比較，#P<0.05，##P<0.01

3 討論

骨質疏松癥全骨量和骨密度下降，并且骨組織微結構的退化導致骨強度降低和骨脆性增加，并伴有病理性骨折[14-16]。其發病機制復雜，涉及多種因素，如骨骼重塑障礙、抑制性免疫功能障礙、抑制骨分化、維生素D缺乏癥和激素調節。目前的研究表明，在骨重塑的生理過程中，成骨細胞和破骨細胞維持了骨吸收與骨形成之間的平衡[17-18]。成骨細胞移動到吸收位點并分泌骨基質，礦化并形成新的骨骼。破骨細胞可以在多個部位吸收和降解骨基質，而成骨細胞在吸收部位分化為新的骨組織。OP的發生是由于骨骼吸收大于骨骼形成。然而，在骨形成和骨吸收過程中特定的分子信號轉導途徑，涉及的基因，調控方式和其他生物學機制等尚不明確。

防己諾林堿是一種生物堿，具有抗氧化、抗炎和細胞毒性作用以及抗癌活性[19]。Jiang等[20]研究報道，防己諾林堿可抑制糖尿病大鼠的炎癥和氧化應激。本研究顯示，OP組大鼠血清ALP含量顯著升高，OC含量顯著降低，IL-6和TNF-α的含量也顯著升高，而防己諾林堿使ALP含量降低，OC含量升高，IL-6和TNF-α的含量也降低。上述結果表明，防己諾林堿可以通過影響血清ALP、OC和炎癥因子來治療OP。

綜上所述，防己諾林堿減少炎癥因子的表達和成骨細胞凋亡，增加骨組織中骨小梁面積和Nrf2的表達水平，抑制NLRP3的表達，從而治療OP。因此，可將防己諾林堿作為治療OP的可選藥物，為臨床上治療OP提供新的理論依據。