研究在手足口病標本檢測中不同分子生物學方法的應用效果

王鯤

北大醫療魯中醫院檢驗科，山東淄博 255400

手足口病多發生在5 歲以下的兒童中， 導致患兒發生此病的主要因素為多種腸道病毒，患兒發病后，出現手、足、口腔等部位的皮疹問題，同時伴隨發熱癥狀，嚴重時患兒會出現無菌性腦膜腦炎， 肺水腫和心肌炎等問題，對患兒的生命健康造成嚴重威脅。 在臨床發展中，隨著醫療技術的不斷發展推進，其已經明確導致患兒發病的主要病原體為柯薩奇病毒A16 型和腸道病毒71 型，在此基礎上，對患兒進行診斷，將分子生物學檢測方法進行應用，可實現對手足口病標本的有效檢測，保證對患兒病情進行判斷，給予患兒及時治療，避免病情加重[1]。 但是不同分子生物學的檢測方法對應的檢測結果不同， 該研究方便選取該院2019 年12 月—2020年12 月期間接受檢測的150 例患者進行研究，將3 種檢測方法進行應用，探究其檢出結果，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

為探究不同生物學標本在手足口病患者中的應用效果，該研究采用對照法，方便選取150 例手足口病患兒，根據患兒病情嚴重程度將其分為3 組，分別為重死患兒組、輕癥患兒組和住院患兒組，將其命名為甲組，乙組和丙組， 均為50 例。 甲組患兒中男24 例， 女26例；年齡1～5 歲，平均年齡為（2.56±1.03）歲。 乙組患兒中男23 例，女27 例；年齡1～6 歲，平均（2.74±1.22）歲。丙組患兒中男25 例，女25 例；年齡1～5 歲，平均（2.13±1.28）歲。 3 組患兒的一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 具有可比性。

納入標準：患兒均被確診為手足口病，與相關疾病診斷標準相符合； 患兒存在不同程度的發熱和手足皮疹，口腔潰瘍等癥狀；患兒伴隨一定程度的中樞神經系統癥狀；患兒家屬均知情并愿意參與研究；該研究均通過醫院倫理委員會批準。

排除標準：患兒具有精神病史；患兒存在其他重大疾病；患兒依從性較差。

1.2 方法

應用無菌操作方法，采集手足口病患兒標本，主要采集發病后3～7 d 內的患兒標本，以糞便為主，采集重量為1～2 g，將采集到的標本放置在密封的大便盒中進行保存。 同時應用專用的棉簽，對患兒的咽兩側扁桃體部位和咽喉壁進行擦拭，保證力度適中，注意避免與喉部造成接觸， 在完成擦拭后， 可將棉簽插入到采樣管中，其采樣管型號為Hank，為3 mL，隨后將試管進行密封。 將該研究所采集的標本放入到冰箱中， 溫度控制在-80℃，以便于有效檢測。隨后，應用不同檢測方法，分別為實時RT-PCRZ 法，一步法RT--PCRZ 和巢式PCR法，在檢測過程中，主要應用Promega 公司的PCR 法擴增儀和試劑盒，應用相關軟件排列EV71 和CA16 引物序列， 并對檢測條件進行有效選擇， 實現對標本的檢測。 并對其反應條件進行有效控制，主要控制在45℃，對其進行逆轉錄，時間為45 min。 在溫度為94℃時，給予其退火干預，時間為25 s，在其71℃的環境中對其進行延伸處理，時間控制在30 s，共進行36 個循環。最后，應用熒光PCR 儀，型號為ABI7500，對實時RT-PCRZ法的檢測結果進行分析。 對一步法RT--PCRZ 和巢式PCR 法的結果進行檢測， 主要將濃度為1.5%的制糖凝膠電泳進行應用分析， 隨后對3 組的檢測結果進行分析比較。

1.3 觀察指標

對3 組檢出標本EV71 和CA16 病原陽性率進行計數。

1.4 統計方法

采用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，組間差異比較以t 檢驗；計數資料以頻數及百分比（%）表示，組間差異比較以χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

甲組患者中3 種檢測方法的EV71 檢出陽性率分別為80.00%、22.00%和80.00%， 乙組患者的EV71 檢出陽性率分別為46.00%、8.00%和16.00%，而丙組患者的EV71 陽性檢出率則分別為86.00%、26.00%和86.00%， 一步法RT--PCRZ 的檢出陽性率與實時RTPCRZ 法和巢式PCR 法的檢出率比較差異有統計學意義（P＜0.05），無論是在重死患兒，輕癥患兒還是住院患兒中，一步法RT--PCRZ 的陽性檢出率均相對較低，與其他兩種檢測方法比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 3 種檢測方法在手足口病陰性檢測結果中的應用[n(%)]

3 討論

就手足口病患者來說，其表現為出疹性疾病，導致患兒發病的病原體大多為人腸道病毒屬， 微小核糖核酸病毒科，具有20 多種類型，其中最為常見的是EV71和CA16 病原體[2]。 手足口病多發生在5 歲以下的兒童中，患兒發病后，出現手、足、口腔等部位的皮疹問題，同時伴隨發熱癥狀， 嚴重時患者會出現無菌性腦膜腦炎，肺水腫和心肌炎等問題，對患兒的生命健康造成嚴重威脅。手足口病是一種全球性傳染病，1957 年開始出現， 最早由Seddon 進行描述， 在隨后的發展中，1958年，意大利Robinson 從HFMD 患者中將CAV16 分離出來，在隨后的報道中，幾乎所有結果均顯示手足口病與CA16 相關。 發展到1974 年，美國學者則在腦炎患者中分離出EV71 腸道病毒，從此手足口病的醫學研究中加強了對EV71 感染問題的重視程度，此后，EV71 感染和CA16 感染交替發生，在手足口病患者中成為了主要病原體。 在近些年的發展中，我國手足口病的患兒發病率逐漸升高，臨床病死率增加，對患兒的生命健康造成了嚴重威脅。 患兒在患病后，會受到其年齡相對較少，自身發育不完全等因素的影響，導致其抵抗力相對低下，在一定的程度上增加了患兒的診斷和治療難度[3]。 因此，需要檢測手足口病標本病原體，保證及時發現患兒病情，從而進行針對性治療，減少患兒不良反應發生率[4]。從臨床目前的發展情況來看，對患兒進行診斷的分子生物學檢測方法較多，主要包括實時RT-PCRZ 法、一步法RT--PCRZ 和巢式PCR 法， 在實際使用過程中，不同方法所對應的檢測敏感性和特異性差異較大， 需要對其展開進一步分析，從而明確有效的診斷方法，提高臨床診斷準確性[5]。

相關研究人員在工作開展過程中， 主要將3 種診斷方法進行應用， 分別為實時RT-PCRZ 法、 一步法RT--PCRZ 和巢式PCR 法， 人員對200 例手足口病進行了標本檢測， 結果顯示3 種檢測方法對應的陽性率分別為160 例 （80.00%）、88 例 （44.00%） 和168 例（84.00%）， 表明實時RT-PCRZ 法和巢式PCR 法的臨床檢測敏感性更高[6]。 實時RT-PCRZ 法主要是指在一定的時間內，通過對病原體DNA 的增幅，實現對病原體陽性的檢測， 而一步法RT--PCRZ 則是通過進行DNA 鏈的逆轉錄，實現互補DNA 的生成，隨后將PCR進行應用，實現對新的DNA 鏈的有效復制，從而使其DNA 鏈得以有效擴增，并展開進一步的分析[7]。 而巢式PCR 法， 其在實際實施過程中， 主要是先與目標DNA模板中藍色的第一對引物進行結合， 從而保證將目的片段進行獲取，在此基礎上，將2 套引物進行擴增，從而經過PCR 擴增，在將擴增產物進行分析時，得出病原體數據[8]。

該研究工作在實際開展過程中， 分別為實時RTPCRZ 法， 一步法RT--PCRZ 和巢式PCR 法進行了應用， 在150 例手足口病的標本檢測結果中， 分必有50例重死患兒，50 例輕癥患兒和50 例住院患兒， 對其進行標本檢測， 結果顯示： 甲組患者中3 種檢測方法的EV71 檢出陽性率分別為80.00%、22.00%和80.00%，乙組患者的檢出陽性率分別為46.00%、8.00%和16.00%，而丙組患者的EV71 陽性檢出率則分別為86.00%、26.00%和86.00%，一步法RT--PCRZ 的檢出陽性率與實時RT-PCRZ 法和巢式PCR 法的檢出率存在顯著差異，無論是在重死患兒，輕癥患兒還是住院患兒中，一步法RT--PCRZ 的陽性檢出率均相對較低， 與其他兩種檢測方法比較差異有統計學意義（P＜0.05），與其他研究成果相一致，表示實時RT-PCRZ 法和巢式PCR 法的檢出率更高，臨床應用意義更為顯著。 與此同時，在對不同檢測方法的檢測結果進行分析時， 還可以看出EV71 達到發生在重死患兒和住院患兒中， 而CA16 則在輕癥患兒中占有較大比例[9]。

一步法RT--PCRZ 主要是指將一條DNA 鏈進行逆轉錄，在此過程中，促進互補DNA 的生成，隨后再以新形成的DNA 鏈通過PCR 進行復制， 從而促進有效擴增，實現工作目的。 實時RT--PCRZ 則是促進基因在一段時間內通過DNA 進行增幅，進而展開進一步的定量分析[10-11]。

臨床發展現狀中，還有巢式PCR 法的應用，此技術在近些年發展起來，并在臨床中得到了廣泛應用。 此技術在實際使用過程中，主要分為兩步實施，第一步是促進DNA 模板藍色的第一對引物相集合，同時獲得目的片段，第二步則是將第二套引物進行應用，將其第一步中經過PCR 擴增的產物進行第二次擴張， 在其技術的實際使用過程中， 受到其第一套引物在CPR 的內部因素影響，這一段過程并非是目的片段，在一般情況下，不會同時包含兩套引物， 在進行第二步擴增工作的過程中，其并不存在非目的片段的擴增情況[12-14]。 因此，在將這一技術方法進行應用的過程中， 非特異性擴增問題的發生頻率較低， 因此問題而導致的感染問題發生率也相對較低，在一定程度上增加了其應用特異性，是目前發展過程中，促進質量增加的主要方法，而且其所對應的監測效果較好。 因此，臨床在針對手足口病患兒進行標本采集時，需要根據患兒的實際情況，選擇合適的方法，保證符合臨床發展需求，為手足口病患兒的診斷提供有效依據，保證診斷有效性，從而促進臨床治療方法的實施，提高臨床治療有效率，其對提高患兒家屬滿意度，促進醫院發展均具有重要的積極意義[15]。

此外，在將一步法RT--PCRZ 和巢式PCR 法進行應用時，還需要采用電泳輔助檢查，在其實際使用過程中，很容易導致標本受到污染，在具體操作時，過程較為復雜，需要較長的檢測時間，對檢測效果的影響較大，容易降低檢測準確率[16]。而實時RT-PCRZ 法的應用，不僅操作過程較為簡便，易于上手，而且對于污染物的控制效果相對較好，可對結果進行直觀分析，很少會出現假陽性問題， 在一定程度上提高了相關檢測方法的診斷有效率，因此其在臨床中的應用范圍更為廣泛[17-18]。

綜上所述，在對手足口病患兒的標本進行檢測時，不同檢測方法對應的檢測效果不同， 可將實時RTPCRZ 法和巢式PCR 法進行應用，其效果顯著，檢出率更高，可保證對患兒病情的有效診斷，保證早診斷、早治療，減少患兒不良反應發生率，促進患兒生命健康，可在臨床推廣使用。