產氣莢膜梭菌C58-1株β毒素的克隆與表達

姚春陽，曹雨欣，徐文豪，馬先強

（1. 山東省濱州畜牧獸醫研究院 256600；2. 濱州醫學院藥學院 264000；

3. 濱州市濱城區農業農村綜合服務中心 256600；4. 惠民縣農業農村服務中心 251700）

產氣莢膜梭菌又稱魏氏梭菌，是一種人獸共患的病原體，魏氏梭菌按照分泌毒素類型主要分為A、B、C、D、E五種類型[1，2]，A型菌引起人畜氣性壞疽，還可以引起馬匹的壞死性腸炎，B型產氣莢膜梭菌可引起羊羔痢疾、腸毒血癥，特別是一周內的羊羔極易感染，臨床表現為腹瀉、食欲不振等，且一經出現，致死快，救治困難，C型產氣莢膜梭菌是奶牛、犢牛及羊腸毒血癥、仔豬紅痢和雞的壞死性腸炎的主要病原菌，D型可引起羔羊、綿羊、山羊、牛及灰鼠腸毒血癥。E型偶爾引起犢牛和羔羊腸毒血癥[3-6]。魏氏梭菌為條件性致病菌，當天氣、飼養條件驟變時往往導致牛、羊、雞、家兔等動物發病，造成養殖戶的重大損失[7，8]。

B型產氣莢膜梭菌可產生α、β、ε3種致死性毒素，β毒素是該菌主要致病因子之一，具有細胞毒性，β毒素可特異性地結合在內皮細胞上，引起血管壞死、出血和繼發的缺氧組織壞死，β毒素也能損害神經系統，從而使動物表現嚴重的精神沉郁[9]。β毒素基因可編碼 336個氨基酸分子量大小約為35 ku，本研究將β毒素基因進行了克隆、測序及截短表達，研究如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

B魏氏梭菌 C58- 1、pET32a（+） 和Ecoli. BL21感受態細胞均為本實驗室保存和制備。

LB培養基為青島海博生物技術有限公司產品；pMD 18-T、限制性核酸內切酶快切酶 BamHⅠ和SalⅠ、Premix Taq、T4DNA連接酶為TaKaRa 試劑公司所售，細菌基因組提取試劑盒和膠回收試劑盒為Omega公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細菌基因組提取 根據Omega公司產品相關產品說明書進行細菌基因組提取。

1.2.2 引物設計

參考GenBank: KP064405.1魏氏梭菌β毒素基因，設計合成一對引物，如表1:

表1 引物序列及長度

1.2.3 β毒素基因克隆

使用PCR技術擴增β756片段，反應參數: 94℃ 3min，94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，共32個循環，72℃延伸10min。PCR產物回收，連接PMD 18-T載體后送生工上海測序公司測序。

1.2.4 PETβ-756重組載體的構建和初步鑒定

雙酶切所用酶為Qcut BamH Ⅰ和Q cutSal Ⅰ，表達質粒和回收的β756基因同時用這兩個酶進行鑒定，重組載體命名為PETβ-756。

1.2.5 β毒素基因的表達

將PETβ-756轉化至BL21感受態，涂板于氨芐霉素抗性平板上，過夜培養，挑取陽性單菌落，按照1∶100的比例轉接入氨芐霉素抗性LB液體培養基中，同時設置空白對照組，37℃搖床180轉搖菌到OD600=0.6，加入IPTG 至終濃度 1mmol /L，37℃，180轉誘導培養5h后。

1.2.6 β756基因的蛋白質電泳檢測

取4.5mL誘導后的重組表達菌，離心收集沉淀后用0.35mL的PH為7.4的無菌PBS重懸菌液，超聲破碎重組菌，離心后取沉淀并用0.35mL 8M的尿素進行溶解，將誘導前樣本及誘導后樣本及沉淀用相關試劑進行處理后，85℃水浴5min，使用12%的蛋白質電泳膠進行蛋白質電泳分析，跑完蛋白膠后，用市售的即用型考馬斯亮藍快速染色液進行染色，染色后用脫色液對染色膠進行脫色，次日用蒸餾水沖洗兩次，用蛋白膠照相儀對其觀察結果。

2 結果

2.1 β毒素DNA的PCR擴增及回收

β毒素DNA經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后，在組外光下可見約678bp的基因條帶（圖1），與計劃中結果相符。

圖1 PEDV PCR擴增β基因

2.2 表達載體的構建

重組載體PETβ-756經過1.2.4中所用酶切鑒定后，在紫外光下756bp大小處可見相關β毒素基因片段，測序結果經軟件分析后未發現任何一個DNA堿基發生突變，這表明重組載體PETβ-756成功構建。

2.3 β毒素基因的表達

經12%SDS-PAGE電泳后，在約45KD大小處有可見目的條帶，其大小與預期蛋白質分子質量相符，經BandScan5.0軟件分析表達的β毒素融合蛋白量約占胞內總體蛋白量含量的20%（圖2）主要以不可溶形式存在。

圖2 β基因的SDSPAGE分析

3 討論

魏氏梭菌產生的毒素眾多，其中致死性毒素至少有12種，B型魏氏梭菌起主要致病作用的毒素有3種（α、β1、ε），β毒素蛋白序列與目前公布的所有產氣莢膜梭菌B型和C型同源性均在99.4%以上，β毒素作為產氣莢膜梭菌B型和C型重要毒素蛋白，具有良好的抗原性。本試驗克隆了B型魏氏梭菌C58-1β毒素的主要抗原區域，并成功對克隆基因進行了載體構建及測序分析，而且本試驗所構建的含有β毒素截短基因的重組質粒在大腸桿菌中的表達效率較高，表達量約菌體蛋白的20%。該蛋白的成功表達為今后魏氏梭菌亞單位疫苗的研發提供了一定的理論依據。