2,4,6-三氯苯酚廢水處理過(guò)程對(duì)污泥性能和菌群結(jié)構(gòu)的影響*

李 玉，徐永貴，董 蓉，郭佳欣，金寶丹，趙建國(guó)**

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)，環(huán)境污染治理與生態(tài)修復(fù)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450001；2.河南省對(duì)外科技交流中心，河南鄭州 450001)

0 引言

氯酚類化合物作為前體或中間體被廣泛用于制藥、防腐和殺菌等工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程，在一些工業(yè)廢水中氯酚類污染物含量高達(dá)幾十甚至上百毫克，而在受這些工業(yè)廢水污染的市政水體中也檢測(cè)出含量為微克至毫克級(jí)別的的氯酚類污染物[1-3]。氯酚類化合物由于具有顯著的生態(tài)毒性和可持續(xù)性，會(huì)通過(guò)食物鏈富集，被認(rèn)定為優(yōu)先控制的污染物。我國(guó)也將多種氯酚類化合物列為常規(guī)水質(zhì)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目[3,4]。因此，如何有效處理氯酚廢水受到廣泛關(guān)注。

由于氯酚廢水中污染物成分和物理化學(xué)特性等較為復(fù)雜，物理和化學(xué)工藝通常難以充分去除該類污染物，且可能會(huì)產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物[5]。活性污泥工藝成本較低，耐受污染物沖擊，在廢水處理過(guò)程中起重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)氯酚類污染物馴化后，活性污泥中降解氯酚的優(yōu)勢(shì)菌屬富集；為避免氯酚類污染物對(duì)活性污泥的沖擊，可通過(guò)投加易降解碳源的方式實(shí)現(xiàn)廢水中氯酚的共代謝去除[3]。為抵抗氯酚類污染物對(duì)微生物的毒性作用，微生物代謝過(guò)程中分泌的胞外聚合物及蛋白質(zhì)含量顯著增加，而通過(guò)蛋白質(zhì)可實(shí)現(xiàn)廢水中污染物的降解[6]。微生物代謝過(guò)程中的脫氫酶(Dehydrogenase，DHA)活性可用于評(píng)估污染物的降解情況，過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)可清除自由基，避免其對(duì)微生物的損傷，故污泥性能可通過(guò)分析不同酶活性來(lái)評(píng)估[7]。但不同濃度的氯酚類污染物降解過(guò)程對(duì)污泥性能和菌群結(jié)構(gòu)的影響仍需深入分析。基于此，本研究以甲醇為共代謝碳源，利用序批式生物反應(yīng)器(Sequencing Batch Reactor，SBR)處理2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-TCP)模擬廢水，通過(guò)逐步提高2,4,6-TCP濃度的方式馴化活性污泥，探討2,4,6-TCP廢水處理過(guò)程對(duì)污泥性能和菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期為氯酚廢水的處理提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器

試劑：磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、重鉻酸鉀、硫酸汞、硫酸銀、硫酸亞鐵銨、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、試亞鐵靈、硫酸亞鐵、蒽酮、高錳酸鉀、氯化三苯基四氮唑、鹽酸、硫酸、過(guò)氧化氫、冰醋酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。2,4,6-TCP為Tokyo化工有限公司生產(chǎn)的分析純。甲醇(純度≥99.9%)為國(guó)產(chǎn)色譜純。

儀器：電子分析天平(FA1104N型，上海雙旭電子有限公司)、高速冷凍離心機(jī)(TGL-20bR型，上海安亭科學(xué)儀器廠)、數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9030MBE型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV1102型，上海天美科技有限公司)、超純水機(jī)(ELGA型，威立雅水處理技術(shù)上海有限公司)、高效液相色譜儀(LC-20ATVP型，日本島津公司)、恒溫振蕩器(SHZ-82型，金壇市城西天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠)、便攜式溶氧儀(YSI型，美國(guó)YSI公司)、超聲波處理器(FS-300型，上海生析超聲儀器有限公司)。

1.1.2 接種污泥與模擬廢水

實(shí)驗(yàn)所用污泥取自當(dāng)?shù)厥姓鬯幚韽S的好氧池污泥，用自來(lái)水清洗3次后接種到圓柱形SBR，SBR的有效體積為5 L，直徑和高度分別為20和25 cm。調(diào)整SBR的初始混合液懸浮固體(Mixed Liquor Suspended Solids,MLSS)為(2 500±200)mg/L。模擬廢水中的碳源由甲醇提供，進(jìn)水化學(xué)需氧量(Chemical Oxygen Demand，COD)調(diào)整為350 mg/L左右。另外，補(bǔ)充廢水中微生物代謝所需的氮、磷和微量元素，其具體成分及濃度詳見(jiàn)表1。進(jìn)水pH值通過(guò)NaHCO3和稀HCl調(diào)整為7.2±0.4。

表1 模擬廢水中補(bǔ)充的氮、磷和微量元素Table 1 Supplied nitrogen,phosphorus,and microelements in the simulated wastwater

1.2 方法

1.2.1 SBR的運(yùn)行

控制SBR的水力停留時(shí)間(Hydraulic Retention Time,HRT)為8 h，包括進(jìn)水0.15 h，運(yùn)行7.00 h，靜置0.70 h和排水0.15 h。SBR運(yùn)行期間采用間歇曝氣模式，曝氣與不曝氣時(shí)間比為2 h∶2 h，曝氣期間通過(guò)便攜式溶氧儀控制廢水中溶解氧(Dissolved oxygen，DO)為(1.5±0.5) mg/L，并通過(guò)攪拌將DO與污泥充分接觸，不曝氣期間停止攪拌。通過(guò)定時(shí)排泥的方式控制MLSS在(2 500±300) mg/L左右。

當(dāng)采用未補(bǔ)充2,4,6-TCP的模擬廢水馴化活性污泥，且出水COD低于50 mg/L時(shí)，該模擬廢水中補(bǔ)充濃度為10 mg/L的2,4,6-TCP (1-56 d)。當(dāng)SBR經(jīng)過(guò)一段時(shí)間馴化，且運(yùn)行結(jié)束后出水COD趨于穩(wěn)定、水相和泥相中檢測(cè)不到2,4,6-TCP時(shí)，依次將廢水中的2,4,6-TCP濃度提高至30和50 mg/L，其運(yùn)行時(shí)間分別為57-98 d和99-147 d，同時(shí)降低廢水中甲醇濃度以維持進(jìn)水COD濃度在350 mg/L左右。在整個(gè)SBR運(yùn)行過(guò)程中，定期檢測(cè)出水COD、水相和泥相中2,4,6-TCP濃度的變化，以及分析污泥中多糖和蛋白質(zhì)含量、不同酶活性和微生物多樣性的變化，并與未投加2,4,6-TCP時(shí)的污泥絮體作對(duì)比。

1.2.2 測(cè)定項(xiàng)目

COD、MLSS和2,4,6-TCP的測(cè)定：SBR運(yùn)行周期末，取上清液離心，采用酸性重鉻酸鉀法測(cè)定獲得的上清液中COD含量，即為出水COD；MLSS通過(guò)重量法測(cè)定，具體測(cè)定方法詳見(jiàn)《水與廢水監(jiān)測(cè)分析方法》(第四版)[8]；2,4,6-TCP采用高效液相色譜儀測(cè)定，水相中2,4,6-TCP通過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾后直接測(cè)定，泥相中2,4,6-TCP通過(guò)超聲萃取的方法提取，而后通過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾后測(cè)定。

多糖和蛋白質(zhì)的測(cè)定：當(dāng)SBR處理不同濃度2,4,6-TCP進(jìn)水且處于穩(wěn)定運(yùn)行階段末期時(shí)，取混合均勻的泥水混合液在4 000 r/min條件下離心5 min,棄上清液，用磷酸緩沖液重懸至原體積后置于冰水浴中超聲10 min (功率240 W，超聲4 s，停4 s)，在12 000 r/min和4℃條件下離心10 min后取上清液。上清液中的多糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定，蛋白質(zhì)含量采用Lowry法蛋白質(zhì)試劑盒測(cè)定，具體操作步驟按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

酶活性的測(cè)定：當(dāng)SBR處理不同濃度2,4,6-TCP進(jìn)水且處于穩(wěn)定運(yùn)行階段末期時(shí)，取混合均勻的泥水混合液在12 000 r/min和4℃條件下離心5 min，棄上清液，用磷酸緩沖液重復(fù)清洗3次后離心，所得污泥用于酶活性的測(cè)定。CAT活性通過(guò)高錳酸鉀滴定法測(cè)定[7]；DHA活性通過(guò)加入氯化三苯基四氮唑的方法測(cè)定[7]；SOD活性利用購(gòu)自南京建成科技有限公司的試劑盒測(cè)定。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.3 微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

（4）重砂異常標(biāo)志：礦區(qū)主要的鈮鉭礦脈與鈮鉭鈹重砂異常暈圈長(zhǎng)軸方向基本吻合, 鈮鉭鈹?shù)认∮薪饘僦厣爱惓？梢宰鳛橹匾恼业V標(biāo)志。

當(dāng)處理不同濃度2,4,6-TCP進(jìn)水的SBR處于不同運(yùn)行條件時(shí)，利用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取污泥中基因組DNA。細(xì)菌16s RNA擴(kuò)增上游引物(357-F)和下游引物(518r)序列(5′→3′)為357F：CCTACGGGAGGCAGCAG；518r：ATTACCGCGGCTGCTGG。依據(jù)BioLinker公司提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)40%-60%的變形梯度凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后對(duì)凝膠染色，拍照。采用Quantity-One軟件對(duì)膠圖進(jìn)行分析，通過(guò)香農(nóng)指數(shù)和戴斯系數(shù)分別評(píng)估不同污泥樣品的微生物多樣性和相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 出水COD和2,4,6-TCP濃度的變化

運(yùn)行初期，10 mg/L的進(jìn)水2,4,6-TCP嚴(yán)重抑制污泥活性，出水COD急劇升高，在第13天時(shí)達(dá)到194.7 mg/L(圖1a)，前20 d的進(jìn)水2,4,6-TCP去除較慢，水相和泥相中殘留高濃度的2,4,6-TCP(圖1b)，這說(shuō)明2,4,6-TCP的毒性作用顯著抑制微生物活性，降解2,4,6-TCP的功能菌屬未能充分富集。隨著運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng)，降解2,4,6-TCP的功能菌屬富集，污泥活性逐漸恢復(fù)，出水COD降低，在40-55 d趨于穩(wěn)定，平均為45 mg/L。進(jìn)水2,4,6-TCP也逐漸被降解去除，40 d后水相和泥相中基本無(wú)2,4,6-TCP的殘留。

圖1 出水COD及水相和泥相中2,4,6-TCP隨運(yùn)行時(shí)間的變化Fig.1 Variation of effluent COD and 2,4,6-TCP both in aqueous and sludge phases with operation time

此后，提高進(jìn)水2,4,6-TCP濃度為30和50 mg/L時(shí)，出水COD均在運(yùn)行初期有短暫的升高(51-78 d和99-110 d)，其濃度最高達(dá)到124 mg/L (71 d)，而后快速降低并趨于穩(wěn)定，在81-98 d和113-147 d的平均濃度分別為62和56 mg/L。相應(yīng)地，進(jìn)水2,4,6-TCP也被快速降解去除，水相和泥相中殘留的2,4,6-TCP隨運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低。推斷低濃度的進(jìn)水2,4,6-TCP (10 mg/L)誘導(dǎo)降解2,4,6-TCP的功能菌屬富集，活性污泥耐受污染物沖擊的能力提高，故逐步提高進(jìn)水2,4,6-TCP濃度對(duì)污泥活性影響較小。已有的研究也證實(shí)，低濃度4-氯苯酚馴化的活性污泥耐受高濃度氯酚類污染物沖擊的能力更強(qiáng)[9]。因此，通過(guò)逐步提高進(jìn)水2,4,6-TCP濃度的方式馴化污泥可有效去除廢水中的2,4,6-TCP。

2.2 2,4,6-TCP對(duì)污泥中多糖和蛋白質(zhì)的影響

當(dāng)進(jìn)水2,4,6-TCP濃度為0，10，30和50 mg/L時(shí)，污泥中多糖含量分別為(23.3±1.82)，(34.2±1.34)，(31.5±3.15)和(42.9±0.54)mg/g(以污泥干重計(jì)，圖2)；蛋白質(zhì)含量分別為(47.2±1.6)，(67.8±0.97)，(100.4±1.27)和(104.4±2.43) mg/g (以污泥干重計(jì),圖2)，即進(jìn)水中2,4,6-TCP濃度的提高致使污泥中多糖和蛋白質(zhì)含量增加，且蛋白質(zhì)含量顯著高于多糖，兩者的比值為1.98-3.19。這是因?yàn)槲⑸锎x過(guò)程中會(huì)分泌大量的多糖物質(zhì)包裹在污泥絮體表面，以抵抗2,4,6-TCP的毒性作用，蛋白質(zhì)在降解2,4,6-TCP和維持微生物活性方面等起到非常重要的作用[6]。下一步可考慮采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)深入分析廢水中不同濃度的2,4,6-TCP對(duì)污泥絮體中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和豐度的影響，以及不同類型蛋白質(zhì)在降解2,4,6-TCP過(guò)程中的功能。

圖2 不同進(jìn)水2,4,6-TCP濃度下的污泥絮體中多糖和蛋白質(zhì)含量Fig.2 Contents of polysaccharides and proteins in sludge flocs under different concentrations of influent 2,4,6-TCP

2.3 2.4.6-TCP對(duì)酶活性的影響

當(dāng)進(jìn)水2,4,6-TCP濃度為10，30和50 mg/L時(shí)，污泥中CAT的活性分別是未投加2,4,6-TCP時(shí)的1.58,1.87和2.50倍，DHA和SOD的活性則分別是未投加2,4,6-TCP時(shí)的1.32，1.71，1.82倍和1.16，1.37，1.75倍(圖3)，即進(jìn)水2,4,6-TCP濃度的提高誘導(dǎo)這3種酶的活性顯著提高。這是因?yàn)镈HA活性的升高有助于降解去除2,4,6-TCP，而微生物在降解毒性有機(jī)物過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基，CAT和SOD活性的升高則可清除自由基以達(dá)到維持微生物活性的作用[10]。已有的研究證實(shí)，CAT、SOD、過(guò)氧化物酶和還原型谷胱甘肽等共同構(gòu)成了生物體的保護(hù)酶系統(tǒng)，可避免廢水中有毒污染物引起生物體的蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA損傷和質(zhì)膜系統(tǒng)破壞等現(xiàn)象的發(fā)生[10]。

圖3 不同進(jìn)水2,4,6-TCP濃度對(duì)酶活性的影響Fig.3 Effects of different concentrations of influent 2,4,6-TCP on enzyme activities

2.4 2,4,6-TCP對(duì)污泥中菌群結(jié)構(gòu)的影響

不同污泥中存在豐富的微生物菌屬，但菌群結(jié)構(gòu)和豐度顯著受到進(jìn)水2,4,6-TCP濃度的影響。當(dāng)活性污泥經(jīng)10 mg/L進(jìn)水2,4,6-TCP馴化且處于穩(wěn)定運(yùn)行階段末期時(shí)，部分菌屬顯著富集，即使進(jìn)水2,4,6-TCP濃度由10 mg/L提高至30和50 mg/L，優(yōu)勢(shì)菌屬的豐度無(wú)顯著降低(圖4)，這也再次證實(shí)經(jīng)低濃度進(jìn)水2,4,6-TCP馴化的活性污泥中降解2,4,6-TCP的功能菌屬顯著富集，2,4,6-TCP濃度的逐漸升高對(duì)菌群結(jié)構(gòu)影響較小，進(jìn)水2,4,6-TCP及其他有機(jī)物被快速降解去除(圖1)。

香農(nóng)指數(shù)可表征不同污泥中的微生物多樣性，香農(nóng)指數(shù)越大，其微生物多樣性越豐富[11]。條帶1-5的香農(nóng)指數(shù)分別為3.40，3.18，2.96，3.20和3.05。接種污泥取自市政廢水處理廠，污染物成分復(fù)雜，故污泥中不同類型微生物最豐富(條帶1)，而模擬廢水中污染物成分相對(duì)簡(jiǎn)單，微生物多樣性出現(xiàn)明顯下降的現(xiàn)象(條帶2-4)。當(dāng)進(jìn)水2,4,6-TCP濃度由10 mg/L提高至30 mg/L且運(yùn)行至第4天時(shí)(條帶3)，微生物多樣性最低，推斷此階段耐受2,4,6-TCP毒性能力較差的菌屬死亡，而其他類型的功能菌屬還未充分富集所引起的。然而，當(dāng)處理進(jìn)水濃度為30 mg/L 2,4,6-TCP的SBR處于穩(wěn)定運(yùn)行階段末期時(shí)(條帶4)，其微生物多樣性比條帶3有明顯的升高。推斷進(jìn)水2,4,6-TCP誘使微生物分泌豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，且2,4,6-TCP降解過(guò)程中產(chǎn)生多種代謝中間產(chǎn)物，此過(guò)程中降解次級(jí)代謝產(chǎn)物和氯酚類中間產(chǎn)物的菌屬富集，故微生物多樣性增加。當(dāng)進(jìn)水2,4,6-TCP濃度提高至50 mg/L且處于穩(wěn)定運(yùn)行階段末期時(shí)，微生物多樣性又出現(xiàn)下降(條帶5)，由圖4可以看出降解2,4,6-TCP的功能菌屬富集，所占的比例增加，而其他類型的菌屬豐度則因2,4,6-TCP的毒性作用降低直至消失。

條帶1：濃度10 mg/L，運(yùn)行4 d；條帶2：濃度10 mg/L，穩(wěn)定運(yùn)行階段末期；條帶3：濃度30 mg/L，運(yùn)行4 d；條帶4：濃度30 mg/L，穩(wěn)定運(yùn)行階段末期；條帶5：濃度50 mg/L，穩(wěn)定運(yùn)行階段末期Line 1:Concentration 10 mg/L,at the 4th d;line 2:Concentration 10 mg/L,at the end of stable operation;line 3:Concentration 30 mg/L,at the 4th d; line 4:Concentration 30 mg/L,at the end of stable operation; line 5:Concentration 50 mg/L,at the end of stable operation圖4 不同進(jìn)水2,4,6-TCP濃度下污泥中的菌群結(jié)構(gòu)變化Fig.4 Changes of microbial communities in sludge under different concentrations of influent 2,4,6-TCP

表2 不同進(jìn)水2,4,6-TCP濃度下的污泥戴斯相似性Table 2 Dice similarity of sludge under different concentrations of influent 2,4,6-TCP

3 結(jié)論

利用SBR工藝處理2,4,6-TCP濃度逐步提高的模擬廢水，探討2,4,6-TCP廢水處理過(guò)程對(duì)污泥性能和菌群結(jié)構(gòu)的影響，主要得到以下結(jié)論：

經(jīng)10 mg/L進(jìn)水2,4,6-TCP馴化的活性污泥能夠有效降解進(jìn)水COD和2,4,6-TCP。提高進(jìn)水2,4,6-TCP濃度為30和50 mg/L時(shí)，出水COD和2,4,6-TCP僅在SBR運(yùn)行初期有適當(dāng)提高，而后被快速降解，污泥性能基本不受影響。當(dāng)處理進(jìn)水濃度為10，30和50 mg/L 2,4,6-TCP的SBR處于穩(wěn)定運(yùn)行階段末期時(shí)，污泥絮體中的多糖和蛋白質(zhì)含量基本隨2,4,6-TCP濃度的增加而升高，蛋白質(zhì)含量顯著高于多糖。污泥中的酶活性(DHA、CAT和SOD)同樣隨2,4,6-TCP濃度的增加而升高。經(jīng)2,4,6-TCP馴化的活性污泥中降解2,4,6-TCP的功能菌屬顯著富集，雖然不同濃度的進(jìn)水2,4,6-TCP和不同的SBR運(yùn)行階段影響微生物多樣性，但不同污泥中的微生物菌屬均有一定的相似性。