肝祖細胞與肝再生的關系

王俊俊， 陸倫根， 蔡曉波

上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院 消化科， 上海 200080

肝臟的再生能力極強，然而在正常情況下99%的肝細胞處于G0期。當急性肝損傷或肝大部分切除后(partial hepatectomy, PH)，殘存的肝細胞迅速進入復制狀態(tài)[1]。由肝細胞增殖介導的肝再生迅速而有效且通常在殘存肝細胞相對健康的條件下發(fā)生，其被稱為肝損傷的首要防線或生理性再生。當重癥肝病時大量肝細胞死亡或慢性肝病時肝細胞衰老或復制受到抑制時，肝祖細胞(liver progenitor cell, LPC)介導的肝細胞再生稱為肝臟代償?shù)闹黧w，也稱為肝臟再生的次要機制或病理性再生。盡管目前也有研究[2]顯示，膽管細胞能在慢性肝損傷時分化為成熟肝細胞而起到肝再生作用。較多研究[3-4]均證實LPC在肝臟發(fā)育和肝損傷中存在，并可參與肝再生。本文主要闡述LPC的起源與激活，和在不同類型肝損傷中介導肝再生的作用及其調(diào)控機制。

1 LPC的起源

LPC是一種卵圓形、高核質(zhì)比的細胞，位于肝實質(zhì)細胞與匯管區(qū)交界的Hering’s管，從形態(tài)和體積上類似于膽管上皮細胞，被認為具有肝細胞、膽管細胞雙向分化潛能，并具有以下特征：(1)具有高增殖潛力的克隆形成能力；(2)具有在培養(yǎng)條件下分化為肝細胞和膽管細胞的能力；(3)具有移植后的肝臟再增殖能力[5]。Farber[6]在1956年描述了第一個被鑒定為卵圓形細胞的LPC。此后在大鼠PH聯(lián)合2-乙酰氨基芴介導急性肝損傷模型中證實了卵圓細胞可以分化為肝細胞[7]。其中3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihidro-collidine(DDC)或膽堿缺乏、乙硫氨酸補充(choline-deficient ethionine-supplemmented diet, CDE)模型是使用最廣泛的研究卵圓細胞的小鼠肝損傷模型[5]。LPC不僅表達干細胞標志物EPCAM、Sca-1、CD133、CD24、A6、Trop2、Lgr5、Mic1-1c3，也同時表達膽管細胞標志物SOX9、CK19及肝細胞標志物HNF4a、CK8[8]，因此被認為是雙能干/祖細胞群。

然而較多文獻討論了LPC可能來自轉(zhuǎn)分化的膽管細胞或肝細胞。Raven等[2]通過阻斷已有肝細胞的增殖證實膽管細胞可再生肝細胞，其研究是基于Sox9表達，提出膽管細胞在肝再生過程中作為CK19+兼性干細胞，但是Sox9在膽管細胞中也表達，不能將膽管細胞與LPC區(qū)分開。同樣Yimlamai等[9]研究顯示在成熟的肝細胞中異位表達的YAP(Hippo途徑的成員)激活了祖細胞程序，并將這些細胞轉(zhuǎn)化為能夠分化的祖細胞，體現(xiàn)肝細胞的可塑性。Wang等[10]在中心靜脈附近發(fā)現(xiàn)了具有自我更新能力表達Axin2+的二倍體肝細胞，被認為是肝干細胞，但近期Sun等[11]研究數(shù)據(jù)反對Axin2+肝細胞是肝干細胞，并且表明整個肝臟中的肝細胞都有助于肝臟的穩(wěn)態(tài)和再生。此外，最近一項研究[12]發(fā)現(xiàn)了表達高水平端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的肝細胞子集，其在體內(nèi)平衡過程中和損傷后有助于肝再生，并且利用譜系追蹤證實了端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶高水平的肝細胞相對稀少，隨機分布在整個肝小葉中，具有祖細胞特征。除了肝細胞、膽管細胞外，有研究[13]提出肝星狀細胞也能成為LPC的來源。在膽管結扎和CDE誘導的肝損傷小鼠模型中，體內(nèi)譜系追蹤顯示肝星狀細胞轉(zhuǎn)化為LPC參與肝再生。總之，LPC是在肝損傷過程中被激活以再生肝實質(zhì)的細胞，而肝臟細胞的高度可塑性，為LPC來源提供更多可能性。

2 LPC的激活

LPC在肝臟的增殖不是獨立存在的，往往與Kupffer細胞、星狀細胞、血管內(nèi)皮細胞以及細胞外基質(zhì)形成類似小室(niche)復合體。正因為復合體的存在，LPC與肝纖維化關系密切，LPC可以產(chǎn)生促纖維化細胞因子而促進纖維化，而纖維化的存在也能促進LPC的增殖[14]。在多種類型的肝損傷中，表達膽管細胞標志物的細胞會從門靜脈周圍區(qū)域擴展到周圍的薄壁組織中，這種現(xiàn)象稱為膽管反應(ductular reaction, DR)。根據(jù)細胞來源，DR通常分為3類：(1)先前存在的肝內(nèi)膽管細胞的增殖，通常見于膽道疾病，如原發(fā)性膽汁性肝硬化；(2)肝細胞的膽管樣化生；(3)LPC[15]。由于慢性肝病中通常存在肝細胞的慢性損傷，因此LPC是DR的主要來源，且有研究證明LPC的激活與DR呈正相關[16]。Zhou等[17]使用NCAM、CK19、HepPar1對DR細胞染色，發(fā)現(xiàn)DR具有明顯的雙極性，即具有膽管細胞和肝細胞兩個分化方向，還可不斷產(chǎn)生多種分化狀態(tài)的中間肝膽細胞，進一步說明DR是LPC的增殖形式。

3 LPC在肝損傷中的作用

3.1 急性肝損傷 Katoonizadeh等[18]研究顯示, 當肝臟出現(xiàn)大規(guī)模壞死導致急性肝衰竭時，LPC廣泛活化及DR明顯出現(xiàn)，且肝細胞損失50%是LPC廣泛活化的閾值，DR的激活是由肝損傷期間肝臟上皮細胞的再生能力受損引起的，這種激活與疾病嚴重程度相關，并在疾病早期(1周內(nèi))發(fā)生，但LPC需要大約1周的時間才能分化為肝細胞和膽管細胞 。根據(jù)這一理論，Weng等[19]認為大面積肝壞死患者大量肝細胞壞死的同時伴隨著LPC介導的肝再生的發(fā)生，即使在急性肝衰竭情況下，患者的命運取決于LPC是否可以在短時間內(nèi)再生足夠的功能性肝細胞以恢復肝臟質(zhì)量和功能。

3.2 慢性肝損傷 慢性肝病時肝細胞P21蛋白表達明顯增加，表明肝細胞的增殖被抑制。同時，對丙型肝炎患者的研究[20]顯示，LPC的增殖與患者年齡相關。因此，肝細胞的再生抑制和衰老可能是LPC成為慢性肝病肝臟再生的主要機制。在慢性肝損傷中，LPC的活化程度與炎癥和纖維化程度有關[16]。最近來自小鼠模型的研究[21]顯示，LPC是實質(zhì)再生的重要來源，并且證明LPC在CDE肝損傷模型中對肝細胞的貢獻將近30%。臨床研究[22]顯示，在非酒精性脂肪性肝炎患者中，LPC增殖和DR的程度與肝細胞復制阻滯、纖維化階段和門靜脈炎癥嚴重程度密切相關。在酒精性肝炎患者中，DR增殖與疾病嚴重程度相關，并且DR細胞表達趨化因子和炎性介質(zhì)，促進了中性粒細胞在門靜脈周圍區(qū)域的浸潤[23]。此外一項對丙型肝炎患者的回顧性隊列研究[24]顯示，在疾病進展期以及原位肝移植后丙型肝炎復發(fā)期間，LPC及DR程度與肝臟炎癥、纖維化顯著正相關。

3.3 肝硬化 在肝硬化的實質(zhì)消失區(qū)或纖維間隔中，常觀察到成簇肝細胞和增殖管組成的小結節(jié)，其被認為是實質(zhì)病變中的再生過程。Lin等[25]使用線粒體DNA突變作為克隆擴增的標志物，顯示肝硬化中肝實質(zhì)的再生結節(jié)與LPC具有相同的細胞起源，提示LPC參與肝再生。肝硬化患者中往往能觀察到膽道標志物EpCAM+的肝細胞，這種中間肝膽細胞的出現(xiàn)可以從兩種相反的角度解釋：慢性損傷的肝細胞可能會獲得膽管標志物的異常表達，代表了它們正在經(jīng)歷去分化，或者可能來自干/祖細胞分化的新生肝細胞。通過對慢性乙型和丙型肝炎患者肝臟的研究發(fā)現(xiàn)，EpCAM+肝細胞的程度與疾病的嚴重程度密切相關，并且與CK19+DR細胞相鄰。此外，肝硬化EpCAM+肝細胞的端粒長度介于EpCAM-肝細胞和增生的DR細胞之間，這更支持了肝硬化時LPC向肝細胞分化的理論[26]。Stueck和Wanless[4]的研究也支持了干/祖細胞再生是肝硬化時肝臟再生的主要機制。

3.4 肝癌 LPC在肝癌發(fā)生中的作用存在長期爭論，LPC被認為與肝細胞癌、肝內(nèi)膽管細胞癌密切相關。對于肝細胞癌的基因芯片分析顯示約20%的肝細胞癌存在膽道標志物的表達，這部分肝細胞癌被認為起源于LPC，其預后更差[27]。同時存在肝細胞癌和膽管細胞癌特征的肝細胞癌合并肝內(nèi)膽管細胞癌，其癌旁LPC的增殖與預后有關。具有DR特征的細膽管癌，也被認為來源于LPC。無論對于肝細胞癌或肝內(nèi)膽管細胞癌，癌旁DR均與周圍組織炎癥、纖維化相關，并且發(fā)現(xiàn)DR的增加與肝細胞癌中β-catenin核轉(zhuǎn)位有關，為DR增加和肝癌預后不良之間的關系提供了解釋[28]。此外有研究[29]顯示在慢性肝損傷模型中抑制LPC增殖可減少腫瘤的進展。

4 LPC分化調(diào)控相關的信號通路

4.1 Wnt/β-catenin信號 Wnt/β-catenin信號與LPC分化為肝細胞有關。在接受2-乙酰氨基芴聯(lián)合PH處理的大鼠中，LPC增殖階段β-catenin活性顯著增加，而在β-catenin 缺乏情況下，LPC數(shù)量急劇減少，表明Wnt/β-catenin在LPC正常活化和增殖中起關鍵作用[30]。Boulter等[31]研究顯示，巨噬細胞吞噬肝細胞碎片誘導Wnt3a表達，激活鄰近LPC中的經(jīng)典Wnt/β-catenin信號，促進了LPC向肝細胞的分化。

4.2 Notch信號 Notch信號是膽管分化重要的調(diào)節(jié)分子，Alagille綜合征是由先天性的Notch信號缺乏引起膽道缺失而導致膽汁淤積。在膽道再生過程中肌成纖維細胞表達Jagged1，促進了LPC中 Notch信號傳遞，促進了LPC分化為膽管細胞[31]。譜系追蹤技術證實了Notch-RBPJ信號在膽管再生中起關鍵作用，還可促進體外LPC向膽管細胞分化[32]，說明Notch信號在LPC向膽管細胞分化的過程中起著核心作用。

4.3 Hippo/YAP信號 Hippo-YAP信號通路也可能參與LPC分化調(diào)控，成熟肝細胞中的YAP異位表達可將肝細胞去分化為LPC，這些LPC能增殖并分化為膽管細胞和肝細胞[9]。同樣有研究[33]通過單細胞測序顯示在DDC損傷模型中，膽管細胞中YAP表達具有明顯異質(zhì)性，并且YAP是維持膽管反應所必須的，此外還發(fā)現(xiàn)YAP激活受膽汁酸調(diào)節(jié)。

4.4 Hedgehog信號 PH可誘導小鼠肝臟Hedgehog配體的產(chǎn)生，激活Hedgehog信號，并伴隨著LPC的增加和PH后纖維化的修復，而使用Hedgehog通路抑制劑會減弱PH后LPC的反應和恢復[34]。此外Hedgehog配體也直接或間接地在招募巨噬細胞中發(fā)揮關鍵作用，這些巨噬細胞可調(diào)節(jié)LPC向肝細胞分化[35]。

4.5 HGF/c-Met信號 肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)在誘導LPC轉(zhuǎn)化為肝細胞中至關重要。HGF激活c-Met受體，從而進一步上調(diào)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Erk1/2)、蛋白激酶B(AKT)和信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)的表達，從而驅(qū)動LPC分化，缺乏c-Met受體，會減弱LPC增殖、分化和遷移能力[36]。且Kitade等[37]研究顯示，HGF/c-Met信號能夠有效激活Akt和STAT3信號通路，這是LPC向肝細胞分化所必需的，c-Met缺失導致LPC向肝細胞分化能力喪失。

4.6 TWEAK/Fn14信號 TNF類細胞凋亡誘導劑(TWEAK)是TNF超家族的成員，而成纖維細胞生長因子誘導劑14(Fn14)是TWEAK的受體，在健康肝臟中很少檢測到，但在受損和再生的嚙齒類動物肝臟模型中可顯著誘導Fn14的表達。Jakubowski等[38]首次報道TWEAK的誘導會引起健康肝臟中LPC的激活，而TWEAK的敲減會顯著降低肝損傷模型中LPC的擴增。

5 LPC移植重建肝實質(zhì)

使用譜系追蹤技術觀察肝損傷模型中移植LPC的研究[39]顯示，LPC可再生為肝細胞和膽管細胞以重建肝實質(zhì)，參與肝再生。臨床研究[40]將分離出EPCAM+細胞移植到終末期肝病患者，顯示EPCAM+細胞的成功移植以及肝硬化嚴重程度的顯著降低，表明了LPC在細胞治療方法中具有巨大潛力。筆者的前期研究也同樣顯示脾臟注射LPC能有效緩解四氯化碳誘導的急慢性肝病中肝臟炎癥、纖維化。LPC作為移植來源細胞其優(yōu)勢在于細胞體積小、耐受不良微環(huán)境、定向分化和增殖能力強等；然而，正常肝臟LPC數(shù)量少，關于如何促進其體外擴增、處理宿主相關免疫抑制以及LPC移植是否增加腫瘤發(fā)生風險等問題還需進一步研究。

6 小結

總之，在慢性或嚴重肝損傷時，LPC增殖分化為肝細胞或膽管細胞參與再生，并且在損傷過程中激活不同的信號通路調(diào)控LPC的增殖與分化。此外較多研究均證實LPC移植可改善肝臟炎癥及纖維化，這將為終末期肝病患者的臨床治療提供科學依據(jù)。目前對于LPC激活、增殖及分化調(diào)控機制還缺乏充分認識，未來可深入研究LPC在不同類型肝損傷中激活、增殖及其分化條件，以及準確有效的LPC分子標志，為各種類型肝病的治療提供新的思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：王俊俊負責文章結構設計，撰寫文章；陸倫根負責收集、篩選文獻，修改文章；蔡曉波負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。