線粒體障礙在非酒精性脂肪性肝炎中的作用機制

蔡恬瑩， 黃美州， 陳 浩， 錢保林， 付文廣

西南醫科大學附屬醫院 肝膽外科， 四川 瀘州 646000

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的發生發展與線粒體障礙密切相關，本文以NASH脂肪變性、肝炎和肝纖維化為線索，探究線粒體功能障礙、結構異常與自噬受損在NASH發生發展中的主要作用和相互關系，并就目前通過改善線粒體障礙治療NASH的相關研究進展以及治療靶點作一總結。

1 線粒體障礙與NASH脂肪代謝

1.1 脂質代謝與線粒體功能障礙 脂肪變性是NASH的病理特點之一[1]，脂質代謝主要途徑脂肪酸β氧化的異常是導致NASH中線粒體障礙的基礎。脂肪堆積誘導過氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR)激活，PPAR作為核激素受體家族中的配體激活受體，與相應配體結合后調控細胞內多種代謝活動，目前發現其亞型PPARα主要調控脂肪酸β氧化，PPARα介導下游靶基因肉堿棕櫚酰轉移酶Ⅰ和脂酰CoA脫氫酶表達增加，使β氧化代償性增強[2]，PPARα還可激活線粒體細胞色素P450酶2E1(cytochrome P450 2E1，CYP2E1)，當線粒體電子傳遞能力飽和時，CYP2E1通過黃素蛋白將β氧化產生的過量電子向分子氧傳遞，產生大量活性氧(ROS)[3]，即出現線粒體功能障礙。在NASH中，各類脂質是線粒體ROS的主要來源之一，也是ROS攻擊的對象。脂質成分與ROS反應產生的氧固醇、氧化磷脂等脂質過氧化產物可激活還原型輔酶Ⅱ氧化酶(NADPH oxidase，NOX)、降低抗氧化酶錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)活性來加劇氧化應激；氧固醇堆積于以膽固醇為主要成分的細胞膜上可導致細胞膜通透性增加；從破裂的肝細胞中釋放出的氧固醇氧化磷脂可介導單核巨噬細胞釋放炎癥因子產生炎癥，或刺激肝星狀細胞(HSC)活化促進肝纖維化[4-5]，且NASH的嚴重程度和脂質過氧化產物含量呈正相關[6]，這些脂毒性作用是線粒體障礙與NASH發展存在相互作用的有力證據。

1.2 脂質代謝與線粒體結構損傷 NASH初期脂質代謝異常誘導氧化應激狀態形成，線粒體結構損傷也是氧化應激狀態的重要組成部分。線粒體結構損傷包括線粒體呼吸鏈復合物的損傷，其引發原因并不單一，其中最重要的是線粒體DNA(mtDNA)受損，mtDNA含量在脂質積累初期代償性增加，但轉錄表達相對不足甚至下降，被稱為mtDNA適應不良[7]，各種脂質過氧化產物還可直接攻擊mtDNA造成基因損傷，導致其編碼的線粒體復合物和ATP合酶合成減少，直接影響線粒體功能。而NASH中其他損傷信號，例如脂肪變性誘導細胞表面凋亡信號Fas的過度表達也表現出對于各線粒體復合物的損傷作用[8]。NASH中脂肪積累同時誘導解偶聯蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)表達增加[9]，UCP2在線粒體膜上形成質子回流通道，減少質子與ATP合酶偶聯，導致氧化磷酸化受損，ATP合成能量代謝異常，共同誘導氧化應激狀態。上述研究再次印證了脂質代謝異常與線粒體障礙之間的密切關系。

1.3 脂質代謝與線粒體自噬異常 線粒體自噬缺陷可能是促進NASH進展的重要因素[10]。在生理狀態下，自噬清除功能受損的線粒體是維持細胞氧化平衡的主要方式，而NASH進展階段，線粒體自噬缺陷導致對損傷線粒體的清除作用不足，大量變形、腫脹及破裂的線粒體在肝細胞內積聚，成為ROS的主要來源[10]。在脂肪變性階段自噬缺陷亦可促進脂質積累，這是由于自噬依賴性的脂肪代謝機制在起作用，自噬相關蛋白如硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)不僅可促使自噬相關基因表達，還可誘導PPARα表達，減輕脂質積累[11]，提示了線粒體自噬在NASH中的積極作用。

2 線粒體障礙與NASH炎癥發生

2.1 線粒體功能障礙與NASH炎癥 肝細胞炎癥是診斷NASH必不可少的基本病理標志。在肝脂肪變性晚期，mtDNA遭受ROS的攻擊導致相關基因合成受阻可能為線粒體障礙引起肝炎的根源之一。ATP合酶等基因的損傷使得ATP生成減少能量代謝異常[12]，是肝炎發生的重要推動因素。而線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ合成受阻導致電子傳遞異常、泄露增加，引起線粒體膜電位減弱，上述原因共同作用加劇氧化應激。在該狀態下，大量ROS釋放進入細胞質后通過多種方式介導炎癥發生，其中最重要的是與肝細胞內核苷酸結合寡聚域(NOD)樣受體(NOD-like receptor 3，NLRP3)結合活化炎性小體，炎性小體是一種多蛋白信號識別復合體，由NLRP3、前激活caspase-1和銜接分子凋亡相關斑點樣蛋白共同組成，在激活的caspase-1作用下，IL-1β產生增加[13]，從而引起組織炎癥反應。上述內容闡釋了線粒體功能障礙在誘導NASH炎癥中的作用。

2.2 線粒體結構異常與NASH炎癥 線粒體釋放ROS誘導炎癥的前提是線粒體的通透性增加，這是氧化應激狀態下線粒體通透性過渡孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)開放的結果。親環蛋白D(cyclophilin D，CypD)與ATP合酶參與mPTP的形成，線粒體內過量ROS可能通過氧化mPTP上的蛋白質硫醇刺激其開放[14]，導致線粒體通透性增加甚至破裂。CypD通過與ATP合酶側支上的寡霉素敏感蛋白結合調節mPTP的開放[15]，盡管ATP合酶轉化為mPTP以及CypD對其的具體調節機制仍不完全清楚，但CypD作為調節蛋白可被視為相應的治療靶點，改善NASH線粒體結構破壞。

受損的mtDNA從破裂的線粒體中釋出，以囊泡的形式被分泌出肝細胞，后進入Kupffer細胞或單核細胞中激活其內Toll樣受體(TLR)9，TLR9結合活化其接頭分子髓樣分化蛋白88，后者介導核因子κB(NF-κB)激活產生促炎作用。mtDNA還可在大量ROS的作用下被氧化為氧化mtDNA，釋放后的氧化mtDNA被胞吞入中性粒細胞，在其中與NLRP3結合激活炎性小體，介導炎癥發生[16]。與ROS引起肝細胞自身促炎因子分泌不同，mtDNA主要作用于各類炎性細胞。這些作用解釋了NASH中線粒體結構破壞與炎癥發生的關系。

2.3 線粒體自噬異常與NASH炎癥 NASH肝炎過程中NF-κB可刺激自噬受體p62的轉錄表達，使p62聚集于線粒體膜上，通過與Parkin蛋白的結合介導線粒體自噬，以清除炎癥損傷的肝細胞[17]。而NF-κB是最重要的促炎因子之一，其具有促炎和誘導自噬的雙重作用，因此不難推測肝炎中的線粒體自噬可能是一種自我保護機制。近期報道[18-19]發現肌醇多磷酸多激酶(inositol polyphosphate multikinase，IPMK)對于自噬至關重要，IPMK通過AMPK激活絲氨酸/蘇氨酸激酶來介導自噬溶酶體的組裝，并支持脫乙酰酶1(sirtuin 1，SIRT1)的表達，SIRT1與NK-κB存在級聯作用，引發該通路下的雙重效應，這為通過線粒體自噬作用改善肝炎提供了可能，也帶來了相應的限制與阻礙。

3 線粒體障礙與肝纖維化

3.1 線粒體功能障礙與NASH肝纖維化 肝纖維化是NASH晚期病理表現之一。脂質蓄積、氧化應激和促炎因子等條件均可間接或直接激活HSC，介導肝纖維化[20]。高脂誘導肝細胞線粒體生物發生減少，裂變融合失調，糖酵解速率增加等線粒體物質代謝障礙，這些事件在纖維化進程中起重要影響[21]，而其中最關鍵的是氧化應激狀態下大量ROS對TGFβ的激活作用，TGFβ是誘發肝纖維化最重要的細胞因子，其在未激活時與潛伏期相關肽(latency-associated peptide，LAP)結合形成穩定的二聚體蛋白，有時還存在潛伏TGFβ結合蛋白形成三聚體[22]。ROS可直接氧化LAP使其與TGFβ分離，或通過NF-κB誘導基質金屬蛋白酶活化切割LAP，促使成熟TGFβ的釋放[23]。且最近研究[24]表明，TGFβ和細胞外ROS對HSC的雙重刺激可誘導HSC內形成Sma和Mad相關蛋白2/3(Sma- and Mad-related protein，SMAD2/3)復合物，SMAD2抑制抗氧化成分細胞球蛋白(cytoglobin，CYGB)表達，使HSC中NOX活性增加，ROS產生增多，同時SMAD3介導HSC中膠原生成，TGFβ1的自分泌，提示HSC自身氧化應激正反饋的形成，借此維持其激活狀態，該正反饋通路的發現為未來NASH肝纖維化的治療提供了新的方向。

3.2 線粒體結構異常與NASH肝纖維化 肝細胞線粒體損傷后，大量mtDNA釋放可直接活化HSC，這種作用與線粒體損傷釋放mtDNA誘導炎癥一樣，被稱為線粒體衍生的損傷相關分子模式[25]。但細胞間質內的mtDNA通過何種受體介導與HSC的識別融入，或通過何種通路激活HSC仍需要更多更深入的研究，但已有的結果仍可表明肝細胞中的線粒體損傷與肝纖維化有直接關系，對線粒體損傷分泌的mtDNA的研究，亦可作為探究HSC活化與肝纖維化發生機制的線索。

HSC中ROS的積累暗示了該細胞中可能存在與NASH相關的線粒體障礙。ROS在HSC線粒體內產生，同樣經由mPTP的開放釋放入胞質，提示HSC中存在的線粒體結構異常，但更多的作用線索有待進一步發掘。

3.3 線粒體自噬異常與NASH肝纖維化 線粒體自噬對于肝纖維化的作用同樣具有雙面性，一般認為線粒體自噬清除活化的HSC是改善肝纖維化的重要手段。與肝炎下的自噬相同，HSC中也存在誘導活化與自噬雙重作用的物質——血小板衍生生長因子受體α(platelet derived growth factor receptor α，PDGFRα)，Marcelin等[26]研究發現，在高脂飲食誘導的小鼠中下調PDGFRα抑制自噬的同時顯示出肝纖維化的減弱，這與誘導自噬以達到改善纖維化的目的相違背。由此可見，自噬的作用具有雙面性，如何利用自噬誘導達到理想的治療效果仍需更多的研究探索。

4 NASH與線粒體異常相關的治療

4.1 維持線粒體穩態預防NASH進展 改善脂質β氧化是保護線粒體功能的首要任務，McCommis等[27]通過抑制線粒體葡萄糖氧化通路，使線粒體為脂肪β氧化留存了更多空間，研究結果提示代謝作用的重新分配可以作為治療NASH的新思路。

而在維持線粒體氧化平衡中，脫乙酰酶SIRT家族的作用占據十分重要的地位。正常情況下， SIRT3誘導SOD2的去乙酰化激活，并維持谷胱甘肽(glutathione，GSH)生成調節因子核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2)的表達從而促進GSH的生成[28]。GSH在細胞質內合成，轉運入線粒體被稱為線粒體GSH(mGSH)，線粒體內MnSOD2清除多余的ROS成為過氧化氫，再由mGSH分解為水以維持氧化平衡[29]，但NASH中高脂誘導SIRT3表達降低，抗氧化作用減弱導致了氧化平衡失調，出現氧化應激。Zeng等[30]研究發現，上調SIRT3活性可抑制線粒體氧化應激，預防NASH進展。最近的實驗[21-22]也證實，SIRT6、SIRT1分別在恢復脂肪β氧化與肝臟炎癥發生中起調控作用，是治療NASH的重要靶標。

4.2 保護線粒體結構改善NASH肝炎 線粒體破裂介導的細胞凋亡是NASH受損細胞死亡的主要途徑。內源性細胞凋亡途徑與線粒體B細胞淋巴瘤/白血病-2家族蛋白作用有關，大量ROS介導絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的磷酸化激活，活化的JNK誘導促凋亡基因表達，激活促凋亡蛋白[31]，激活的tBID募集于線粒體膜上介導促凋亡因子Bax和Bak形成孔道，導致線粒體外膜通透，細胞色素C經Bax孔道被釋放入胞質，結合凋亡蛋白酶激活因子，募集起始半胱天冬氨酸caspase-9加入并使其激活，組成完整的凋亡小體，激活效應半胱天冬氨酸caspase -3、7切割細胞蛋白質協助凋亡，最終被巨噬細胞識別吞噬[32]。CXC趨化因子受體3(CXC receptor 3，CXCR3)主要存在于各類炎癥細胞上，通過介導MAPK亞型凋亡信號調節激酶1/JNK信號通路的激活誘導炎癥，因JNK信號在線粒體裂變凋亡中起到的重要作用，Du等[33]通過實驗證實了CXCR3缺陷可抑制凋亡，減輕NASH炎癥，是治療NASH的有效位點。

4.3 抑制線粒體通透性改善NASH纖維化 HSC中存在的氧化應激正反饋提供了NASH纖維化治療的新思路。HSC中NOX1、2、4、5等各種NOX亞型均被證實與肝纖維化進展有關[34]，包括NOX的上游調節蛋白CYGB等均可作為切入點進行抗氧化治療的研究。在對線粒體結構的研究中，Zhao等[35]發現在NASH患者活化的HSC內可調控mPTP的環狀RNA——SCAR(steatohepatitis-associated circRNA ATP5B regulator)表達下降。SCAR作為ATP5B 調節劑，通過與ATP酶F1亞基上的ATP5B蛋白結合，阻礙ATP酶與CypD的相互作用從而抑制mPTP開放。但在NASH患者中，SCAR表達抑制使mPTP開放并釋放大量ROS，提示SCAR可作為相應治療靶點。Lv等[36]認為HSC的激活與ROS的累積實際是靜止期的細胞進入細胞周期的過程，并通過實驗證實細胞周期調控因子p16、38的表達與ROS的產生有關，為清除HSC內ROS改善NASH肝纖維化提供了可行的治療靶點。

4.4 線粒體自噬改善與NASH治療 針對線粒體自噬的相關治療改善肝疾病是近年來的熱門話題。Wu等[37]發現高脂飲食誘導擬激酶混合譜系激酶域樣蛋白(pseudokinase mixed lineage kinase domain-like，MLKL)表達增加，MLKL可與肝線粒體結合刺激ROS產生，并轉移至自噬體膜上抑制損傷細胞的自噬，加劇肝損傷。MLKL敲除模型可改善損傷肝細胞的自噬缺陷，緩解NASH進展。Park等[11]也證實自噬相關蛋白TXNIP通過改善脂肪酸氧化并誘導自噬達到減輕NASH的作用，提示誘導自噬治療NASH的可行性及相關靶點的應用。但過度的自噬誘導也可能加重肝損傷，故維持其間的平衡是治療NASH的關鍵，這為通過自噬尋找新的NASH治療方式提供了機會與挑戰。

NASH從脂肪變性至逐步出現炎癥、肝纖維化等一系列病理損傷的過程中存在伴隨和遞進關系。期間可觀察到上文所述線粒體障礙在其中的作用，被證實是疾病進展的關鍵因素，但NASH中肝細胞線粒體障礙不能被完全確認是NASH進展的起因還是肝臟病變的結果[12]。總結當前研究結論不難發現NASH中線粒體障礙與各級病變相互作用，互為刺激因素。NASH的治療也需與改善線粒體功能方面綜合考慮，線粒體障礙尤其是氧化應激在NASH發展中占據最為主要的地位，但其中的具體機制仍有待進一步探究，保護線粒體功能和NASH治療的相互關系可以作為未來進一步研究的方向及思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：蔡恬瑩負責課題設計，資料分析和撰寫論文；黃美州、陳浩、錢保林參與收集數據，修改論文；付文廣負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。