蟬蛻水煎劑對妊娠晚期大鼠子宮運動節律及PGE2、COX－2水平的影響

王鋒，徐靜，童婷婷，崔利娜，付秀虹

（漯河市中心醫院，河南 漯河 462000）

分娩啟動是一個十分復雜的生理過程，是多種因素作用下的結果，其中子宮收縮活動與分娩啟動密切相關［1］。子宮收縮活動在妊娠期間處于被抑制狀態，妊娠早期表現為低強度子宮收縮，中期強度稍大，晚期明顯增大，且收縮頻率升高［2］。但部分孕婦因子宮收縮強度不足導致過期妊娠，增加了圍產兒的死亡風險。目前，臨床主要采用催產素進行引產，但在臨床應用中因個體劑量差異大難以掌握給藥劑量，常并發子宮破裂、軟產道損傷及宮縮過頻引起的胎兒窘迫等不良事件［3］。中醫藥在婦產科有重要地位，近年來關于中藥引產的報道有所增加，諸醫家遵照活血化瘀、行氣催產原則用藥，療效頗佳。蟬蛻為催產湯劑中常用的一味中藥材，王家興等［4］研究發現蟬蛻可促進大鼠離體子宮平滑肌運動，這可能對妊娠晚期孕婦催產有重要作用，但相關報道鮮見。故本實驗建立妊娠晚期大鼠模型，分析蟬蛻對妊娠晚期大鼠子宮運動節律的作用及其可能機制，為研發有經濟效益的催產新藥奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠，性成熟未交配，8 周齡。其中雌性大鼠100 只，體質量230～240 g，雄性大鼠50 只，體質量280～290 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019－0010。飼養溫度22～26 ℃，相對濕度40%～60%，自然光照，自由攝食飲水。本次實驗操作均符合一般動物實驗倫理學原則。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器

蟬蛻（云南省藥材公司），制備成1 g/mL 濃度的蟬蛻水煎劑，臨用時配制成實驗用藥濃度；催產素（上海禾豐制藥有限公司，規格10 U，國藥準字H31020850）；雌二醇（estradiol，E2）、孕酮（progesterone，P）ELISA 試劑盒（美國Abraxis 公司）；兔抗大鼠前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、環氧化酶－2（cyclooxygenase－2，COX－2）、GAPDH 一抗（北京西美杰科技有限公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（上海古朵生物科技有限公司）；DYB－2 電泳儀（上海博通化學科技有限公司）。

1.2 方法與觀測指標

1.2.1 造模、分組及干預

將大鼠按雌雄2∶1合籠，每日上午8時進行雌鼠陰道涂片檢查，發現精子當日為妊娠第1天。將100只妊娠大鼠隨機分為模型組、生理鹽水組（安慰組）、蟬蛻水煎劑低劑量組（中低組）、蟬蛻水煎劑高劑量組（中高組）、陽性對照組（陽性組），每組各20只。在大鼠妊娠第19 天開始灌胃給藥。中低組、中高組分別予以生藥含量0.375、0.75 g/mL的蟬蛻水煎劑，安慰組予以等體積生理鹽水，均灌胃1 mL；陽性組予以0.089 U/kg 的催產素尾靜脈注射給藥；模型組不予以任何干預。每組隨機取10 只大鼠觀察分娩啟動時間和產程時間，其余大鼠進行其他實驗并觀察檢測相應指標。

1.2.2 子宮收縮強度、頻率及子宮收縮力測定

給藥20 h 后，取10 只大鼠用戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉，仰臥位固定，在下腹部正中取切口，在一側子宮中段置入電極，連接肌肉張力換能器、二導生理記錄儀，靈敏度2 mV/cm，走紙速度1 mm/s。觀察大鼠子宮收縮情況，記錄宮縮幅度、頻率，計算宮縮力。

宮縮力=宮縮幅度×宮縮頻率

1.2.3 HE染色觀察子宮宮頸組織形態學

上述實驗完成后，脫頸處死大鼠，分離子宮頸，剔除宮頸外圍疏松組織，獲得宮頸組織，用4%多聚甲醛固定，制作5 μm 厚切片，進行HE 染色，光鏡下觀察各組大鼠宮頸形態學差異。

1.2.4 ELISA 法檢測大鼠血清雌二醇（E2）、孕酮（P）水平變化

處死大鼠后，腹主動脈采血，3 000 r/min 離心15 min，離心半徑10 cm，取上清置于－25 ℃冰箱內保存。參考E2、P 的ELISA 試劑盒說明書進行檢測，用酶標儀在波長450 nm 處測定吸光度值，計算大鼠血清E2、P濃度。

1.2.5 qRT－PCR 法檢測大鼠子宮組織中PGE2和COX－2的mRNA表達

取子宮肌條剪碎，Trizol裂解組織，提取總RNA，反轉錄合成cDNA后進行PCR擴增，擴增引物由本實驗室參考美國國立圖書館Pubmed基因庫中電腦軟件Primer5.0設計。PGE2：上游5'－AGAAGCTGATAATCGGGT－3'，下游5'－CCTAGTGAAGGATCC－3'，產物大小415 bp；COX－2：上 游5' －ACGGACTTGCTCACTTTG－3' ，下 游5' －AGGAGAACAGATGGGATT－3' ，產物大小377 bp；β－actin：上游5'－CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC－3'，下游5'－CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG－3'，產物大小690 bp。PCR 反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性40 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 個循環，最后72 ℃7 min 終止反應。采用2－△△Ct法計算PGE2、COX－2 mRNA表達。

1.2.6 Western Blot 法檢測大鼠子宮組織中PGE2和COX－2的蛋白表達

取子宮肌條剪碎，加裂解緩沖液溶解，超聲勻漿，15 000 r/min，離心半徑10 cm，取上清。用Brad－Fold法檢測蛋白質濃度，進行SDS－PAGE 凝膠電泳，取10 μg 蛋白加5 × 加樣緩沖液，沸水浴變性后，電轉PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉24 h。加兔抗大鼠PGE2、COX－2、GAPDH 一抗（1∶1 000 稀釋）孵育過夜，次日加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（1∶2 000 稀釋）孵育2 h。ECL 顯影，用Image 圖像分析軟件計算目標條帶的灰度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計軟件分析本次實驗數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，統計學方法采用單因素方差分析與LSD－t比較。以P＜0.05 代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠分娩啟動時間和產程時間比較

與模型組比較，中低組、中高組、陽性組大鼠分娩啟動時間與總產程時間較短（P＜0.05）；中低組、中高組、陽性組分娩啟動時間與總產程時間依次縮短，經組間比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；模型組與安慰組分娩啟動時間與總產程時間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠分娩啟動時間和總產程時間比較（±s）

表1 各組大鼠分娩啟動時間和總產程時間比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與中低組比較，#P ＜0.05；與中高組比較，&P ＜0.05。

組別模型組安慰組中低組中高組陽性組F值P值n 10 10 10 10 10分娩啟動時間（h）27.42±3.15 27.39±3.02 22.79±1.47*20.01±1.25*#17.22±1.82*#&38.918＜0.001總產程時間（min）118.33±10.75 117.45±9.39 106.52±5.38*95.06±4.43*#80.48±3.11*#&48.897＜0.001

2.2 各組大鼠宮縮強度、頻率及宮縮力比較

與模型組比較，中低組、中高組、陽性組大鼠宮縮頻率較高，宮縮強度及宮縮力較大（P＜0.05）；中低組、中高組、陽性組大鼠宮縮頻率依次增高，宮縮強度及宮縮力依次增大，經組間比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；模型組與安慰組大鼠宮縮強度、頻率及宮縮力比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠宮縮強度、頻率及宮縮力比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠宮縮強度、頻率及宮縮力比較（n=10，±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與中低組比較，#P ＜0.05；與中高組比較，&P ＜0.05。

組別模型組安慰組中低組中高組陽性組F值P值宮縮幅度（mV）1.78±0.10 1.81±0.12 2.03±0.14*2.25±0.11*#2.42±0.12*#&54.518＜0.001宮縮頻率（次/min）2.50±0.12 2.51±0.13 2.86±0.11*3.01±0.14*#3.39±0.13*#&86.877＜0.001宮縮力（mV/min）4.45±0.16 4.47±0.15 5.76±0.13*6.77±0.16*#8.20±0.24*#&861.117＜0.001

2.3 各組大鼠子宮組織形態學比較

模型組、安慰組大鼠宮頸結締組織與膠原纖維排列有序，間質略水腫；與模型組比較，中低組、中高組、陽性組宮頸結締組織與膠原纖維排列紊亂、疏松，間質水腫明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠子宮組織形態比較（HE，×400）

2.4 各組大鼠血清E2和P水平比較

與模型組比較，中低組、中高組、陽性組大鼠血清E2水平較高，P 水平較低（P＜0.05）；中低組、中高組、陽性組大鼠血清E2水平依次遞增，P 水平依次遞減，經組間比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；模型組與安慰組大鼠血清E2和P 水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清E2和P水平比較（±s，mg/mL）

表3 各組大鼠血清E2和P水平比較（±s，mg/mL）

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與中低組比較，#P ＜0.05；與中高組比較，&P ＜0.05。

組別模型組安慰組中低組中高組陽性組F值P值n 10 10 10 10 10 E2 11.56±0.75 11.63±0.86 26.48±2.18*30.47±2.45*#34.99±2.77*#&298.924＜0.001 P 85.32±7.45 85.57±7.66 46.69±5.15*41.86±4.23*#34.63±3.54*#&178.068＜0.001

2.5 各組大鼠子宮組織中COX－2 和PGE2的mRNA表達比較

與模型組比較，中低組、中高組大鼠子宮組織中COX－2、PGE2的mRNA 表達水平較高（P＜0.05）；中低組、中高組大鼠子宮組織中COX－2、PGE2的mRNA表達水平依次遞增，經組間比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；模型組與安慰組大鼠子宮組織中COX－2和PGE2的mRNA 表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠子宮組織中COX－2和PGE2的mRNA表達情況比較（±s）

表4 各組大鼠子宮組織中COX－2和PGE2的mRNA表達情況比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與中低組比較，#P ＜0.05。

組別模型組安慰組中低組中高組F值P值n 10 10 10 10 COX－2 0.11±0.01 0.16±0.02 0.62±0.03*0.79±0.08*#610.658＜0.001 PGE2 0.13±0.01 0.14±0.02 0.55±0.04*0.72±0.08*#501.033＜0.001

2.6 各組大鼠子宮組織中COX－2 和PGE2 的蛋白表達

與模型組比較，中低組、中高組大鼠子宮組織中COX－2和PGE2的蛋白表達水平較高（P＜0.05）；中低組、中高組大鼠子宮組織中COX－2 和PGE2的蛋白表達水平依次遞增，經組間比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；模型組與安慰組大鼠子宮組織中COX－2和PGE2的蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5、圖2。

表5 各組大鼠子宮組織中COX－2、PGE2蛋白表達情況比較（±s）

表5 各組大鼠子宮組織中COX－2、PGE2蛋白表達情況比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與中低組比較，#P ＜0.05。

組別模型組安慰組中低組中高組F值P值n 10 10 10 10 COX－2 0.08±0.01 0.09±0.01 0.37±0.03*0.69±0.04*#1 144.519＜0.001 PGE2 0.09±0.01 0.08±0.01 0.44±0.05*0.68±0.07*#505.000＜0.001

圖2 大鼠子宮組織中PGE2、COX－2蛋白表達電泳圖

3 討論

分娩為正常生理現象，古人提倡“瓜熟蒂落”，但往往會有某些原因引起“瓜熟蒂不落”，妊娠時間過長，導致胎兒宮內窒息，出現不良母嬰結局［5］。妊娠晚期孕婦的子宮運動節律與分娩發動、引產成敗、產程長短均密切相關，故探索一種可調節子宮運動節律的方法是產科亟待解決的重大課題。蟬蛻有很長的臨床應用歷史，其性寒味甘，為辛涼解表藥，入肺、肝經，有解痙、散風、除熱之功效。《珍珠囊藥性賦》記載，蟬蛻為妊娠禁藥，現代藥理學證明其有免疫抑制、抗驚厥、鎮痛、鎮靜、解熱等作用［6］，其所含甲殼質被用于避孕殺精藥，但鄭梅等［7］在探討蟬蛻抗生育作用機制中發現，蟬蛻對離體動物子宮平滑肌有促興奮作用。子宮平滑肌興奮性與子宮收縮節律密切相關，維持穩定的子宮收縮節律，增強子宮收縮力是正常分娩、加快產程的關鍵。故本研究嘗試探討蟬蛻作為妊娠晚期大鼠催產藥的作用及其機制，以期為中藥催產研究提供實驗依據。

子宮收縮力是臨產時產力的主要力量，也是分娩的主體推動力［8］。本研究結果顯示，與模型組比較，中低組、中高組大鼠宮縮頻率較高，宮縮強度及宮縮力較大，分娩啟動時間與總產程時間較短，提示蟬蛻水煎劑用于妊娠晚期大鼠催產，可增強宮縮力，誘發分娩啟動，并縮短產程。現代醫學證明［9］，宮頸結締組織的主要構成成分是膠原纖維，在促進宮頸成熟、增強宮縮中起突出作用的是宮頸膠原纖維降解和重新排列。在本研究中，HE 染色觀察子宮組織形態發現，與模型組比較，中低組、中高組宮頸結締組織與膠原纖維排列紊亂、疏松，間質水腫明顯，這些生理性能變化是宮頸成熟的結果，提示蟬蛻水煎劑可改變子宮組織形態，促進宮頸成熟。KARAKO 等［10］報道E2、P 與宮頸成熟密切相關。E2可誘導肌細胞縫隙連接的形成，并提高子宮肌層興奮性，促進前列腺素合成，從而促使宮頸成熟。孕期E2、P 由胎盤、胎膜合成與代謝，局部子宮內E2濃度升高，當E2與P 比值升高到超出P 抑制作用的程度時，即可促進宮頸成熟，使分娩發動。本研究結果顯示，與模型組比較，中低組、中高組大鼠血清E2水平較高，P 水平較低，提示蟬蛻水煎劑可調節妊娠晚期大鼠血清E2與P 濃度，對宮頸成熟、分娩發動有積極作用。

關于分娩發動的機制至今仍未闡明，但PGE2是與分娩發動關系研究中最受關注的細胞因子，其作用已經在臨床上得到證實［11］。CHOWDHARY 等［12］研究發現，人胎膜局部釋放PGE2可誘導子宮平滑肌收縮以及宮頸成熟。PGE2在分娩啟動前無變化，妊娠晚期時宮內組織胎盤、羊膜、子宮肌等組織均可產生PGE2，并作用于局部誘導子宮收縮，還可促進子宮縫隙連接形成，為分娩發動奠定基礎。SLATER 等［13］報道，COX－1、COX－2 為中樞前列腺素合成酶，COX－1 mRNA 在羊膜與絨毛膜蛻膜中呈低表達，且不隨胎齡增長而變化，僅COX－2 mRNA 表達隨胎齡增加，在妊娠晚期及分娩時，COX－2 mRNA 表達異常升高，導致前列腺素合成酶活性升高，從而誘導羊水PGE2濃度升高。本研究中，與模型組比較，中低組、中高組COX－2 和PGE2的mRNA 與蛋白表達均上調，提示蟬蛻水煎劑可上調子宮組織COX－2 和PGE2表達，這可能是其促進子宮收縮的機制之一。

綜上所述，蟬蛻水煎劑可調節妊娠晚期大鼠子宮運動節律，上調子宮組織PGE2、COX－2 表達，但本研究仍無足夠證據證明蟬蛻水煎劑的催產作用機制與子宮組織PGE2、COX－2 表達上調相關，這將是未來的研究方向。