MicroRNA-219a-5p和AFAP1L2對胰腺癌細胞的作用研究*

劉博，戚誠，趙爽，常曉靜，趙曉東，張立超，劉學臣，劉斌

（1.河北醫科大學第二醫院 普外四科，河北 石家莊050052；2.河北醫科大學第三醫院麻醉科，河北 石家莊050051；3.河北醫科大學第二醫院 放療科，河北 石家莊050052；4.河北醫科大學第二醫院 普外九科，河北 石家莊050052；5.河北醫科大學第二醫院消化內科，河北 石家莊050052；6.河北大學附屬醫院 科研處，河北 保定071030）

胰腺癌在消化系統惡性腫瘤中預后是最差的，生存期短，5年生存率< 5%[1]。盡管放療、化療、靶向、手術等多模式治療有所進展，近10年胰腺癌的5年生存率仍無明顯提高，胰腺癌細胞的惡性增殖、過早發生轉移及浸潤是其生存期不能提高的主要原因之一[2-3]。轉移性結直腸癌、肺癌、食管癌等伴隨著靶向治療的發展，5年生存率均得到一定程度的提高，而胰腺癌生存期卻沒有明顯改善[4]。對胰腺癌早期篩查指標的探索，對進展期胰腺癌治療靶點的發現，仍然是提高胰腺癌存活率的主要研究方向[5]。肌動蛋白絲相關蛋白1 相似蛋白2（AFAP1L2）是接頭蛋白的一種,在惡性腫瘤（胃癌、食管癌、肺癌等）中高表達。本研究前期實驗發現，AFAP1L2 與胰腺癌的轉移、侵襲等惡性行為具有相關性，在胰腺癌中是促癌基因[6]，對胰腺癌細胞侵襲及轉移具有促進作用[7]。miRNA 是一種內源性小非編碼RNA，在轉錄后參與細胞增殖、分化、生長等生物學行為，大部分負向調控下游基因[8]。胰腺癌miR-219 對胰腺癌細胞的惡性行為具有負向調控作用，但其機制并不清楚。本研究前期通過生物信息學預測顯示，microRNA-219a-5p（miR-219a-5p）與AFAP1L2 3'-UTR 具有堿基互補配對，兩者可能具有靶向調控關系。本研究檢測miR-219a-5p 與AFAP1L2 3'-UTR 在胰腺癌細胞株中的表達，并觀察兩者對胰腺癌細胞增殖的作用，對兩者可能具有的靶向調控關系進行驗證，為胰腺癌預測基因的發現及治療靶點的預測提供離體實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

正常胰腺導管上皮細胞（HPDE）及人胰腺癌細胞株（PANC-1、BXPC-3、SW1990、Capan-1）由中國科學院上海細胞庫提供，由河北醫科大學第二醫院中心實驗室培養及傳代。AFAP1L2 山羊多克隆抗體及流式細胞周期和凋亡檢測試劑盒購自美國Santa Cruz 公司。BCA 定量試劑盒、ECL 發光試劑盒、DAB 顯色試劑盒、CCK-8 檢測試劑盒購自大連寶生生物技術有限公司。miR-219a-5p mimics（擬似劑）及miR-219a-5p inhibitor（抑制劑）購自日本TakaRa 公司。逆轉錄及擴增試劑盒、miRNA 提取分離試劑盒、Lipofectamine 2000 及RPIM 1640 購自美國Sigma 公司。AFAP1L2 過表達質粒（pCMVEGFP-AFAP1L2 質粒）、空載EGFP-質粒、引物、野生型引物（wt）及突變型（mut）螢光素酶報告載體由北京生工生物工程有限公司設計合成。AFAP1L2 正向引物：5'-CCGGACGTAACGACGCATCCG-3'，反向引物：5'-GCCCAGTTCGUUGUGCCACG-3'；miR-219a-5p正向引物：5'-GTTCTTGACAATTAAGACCC-3′，反向引物：5'-CATGATAAGTTCTGCGCTC-3'；β-actin 正向引 物：5'-GCCGATCCGTAACGCTACGGCGC-3'，反 向引物：5'-CCGGACGTTCGACGGCTCCG-3'。

1.2 研究方法

1.2.1 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測mRNA 表達對各組細胞進行裂解，收集后依照Trizol 操作說明書提取RNA，合成cDNA，對RNA純度和完整性進行檢測。進行microRNA 逆轉錄，在70℃溫浴10 min 后立即給予冰浴，對逆轉錄引物及模板退火；PCR 反應體系的配置如下：qRT-PCR Master Mix 7.5 ml，2份SYBR Green，引物混合物0.6 ml，H2O 15 ml，cDNA 模板2 ml。進行循環，延伸反應條件如下：95℃溫浴2 min，94℃溫浴10 s，55℃溫浴15 s，72℃溫浴10 s，循環45 次；再次95℃溫浴1 min，60℃溫浴30 s，95℃溫浴30 s。擴增曲線以2-ΔΔCt法進行分析，實驗3次取平均值進行統計分析。

1.2.2 Western blotting 法檢測蛋白表達各組細胞用PBS 洗滌3 次，收集后離心，棄去上清液，對裂解后的各細胞株總蛋白進行抽提，常規BCA 法對蛋白濃度進行定量，然后對蛋白樣本上樣，120 V條件下以12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺進行電泳分離，20 min 后改為90 V 分離90 min，轉于PVDF膜，TBST 緩沖液（含5%脫脂奶粉）封閉1.5 h。加Ⅰ抗室溫孵育過夜，TBST 3 次洗膜加Ⅱ抗，37℃孵育1 h，凝膠顯像儀顯像（化學發光法）。β-actin 為內參，Quantity One 計量灰度值。

1.2.3 轉染胰腺癌細胞步驟收集對數生長期胰腺癌細胞進行消化，使其成為單細胞懸液，24 孔板內按20×104個細胞/孔進行接種，對融合度>70%胰腺癌細胞株以Lipofectamine 2000 操作說明書要求進行轉染，用含10%胎牛血清細胞培養基對轉染完成的細胞進行培養，48 h時后評價轉染效率，繼續完成下一步實驗。

1.2.4 CCK-8 法檢測細胞增殖收集空白對照組（NC 組）、pCMV-EGFP-AFAP1L2 組、siAFAP1L2 組對數生長期細胞，將濃度調至1×105個/ml，100 μl 細胞懸液/孔加入96 孔板，12 h 培養于孵育箱（條件：濕度5%，溫度37℃）。48 h 溫浴后加10 μl 的CCK-8液，繼續培養4 h，在酶標儀490 nm 波長處檢測光密度（OD）值，每孔進行3 次試驗，取平均值進行統計分析。

1.2.5 流式細胞術檢測胰腺癌細胞周期取胰腺癌細胞，轉至EP管，PBS 1 ml進行洗滌，然后加1 ml 70%的乙醇，以上均需預冷條件操作，于4℃進行24 h固定，1 200 r/min 離心4 min。棄上清，PBS 洗滌。然后用PBS 對各樣本進行重懸，加入30 μl 0.5% PI、15 μl Rnase A（10 mg/ml），4℃下避光溫浴40 min。流式細胞儀在波長488 nm 處行細胞周期檢測。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡取各組胰腺癌細胞，按照Annexin V-FITC/PI 試劑盒說明書進行細胞凋亡檢測，流式細胞儀設定條件：Alexa FITC 的最大發射波長509 nm，最大激發波長488 nm，PI-DNA復合物的最大激發波長535 nm，最大發射波長615 nm，采集細胞數10 000 個/樣本，以Cell Quest 軟件進行凋亡率分析。

1.2.7 螢光素酶法檢測堿基互補配對miR-219a-5p與AFAP1L2 可能具有靶向調控關系，并確定核苷酸47～53 為3'-UTR 的結合位點，構建商業化wt-AFAP1L2-Pmir-REPORT 及 mut-AFAP1L2-Pmir-REPORT 熒光素酶報告載體，將構建的載體報告以X-treme Gene 與miR-219a-5p mimics 共轉染到胰腺癌細胞，miR-219a-5p negative control（NC）組為對照。共轉染后在培養箱內以37℃、5% CO2條件下孵育培養48 h，以雙螢光素酶檢測試劑盒對熒光素酶活性進行檢測。 以wt/mut-AFAP1L2-Pmir-REPORT 與海腎熒光素酶表達載體活性比例為相對熒光素酶活性。

1.3 統計學方法

數據分析采用PASW Statistics 20.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析或t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-219a-5p、AFAP1L2 在胰腺癌細胞株及HPDE中R 表達

qRT-PCR 結果顯示，在胰腺癌細胞株PANC-1、BXPC-3、SW1990、Capan-1 及HPDE 中miR-219a-5p mRNA 的相對表達量分別為（0.26±0.07）、（0.28±0.08）、（0.58±0.28）、（0.46±0.25）和（1.32±0.57），差異有統計學意義（F=11.462，P=0.000），在胰腺癌細胞株中表達較低。BXPC-3，SW1990 及Capan-1 分別與PANC-1 比較，差異無統計學意義（P>0.05）；SW1990 及Capan-1 分別與BXPC-3 比較，差異無統計學意義（P>0.05）；SW1990 與Capan-1 比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1A。

qRT-PCR 及Western blotting 結果顯示，在胰腺癌 細 胞 株PANC-1、BXPC-3、SW1990、Capan-1 及HPDE中AFAP1L2 mRNA相對表達量為（1.19±0.24）、（0.92±0.29）、（0.97±0.07）、（0.99±0.45）、（0.57±0.16），差異有統計學意義（F=10.931，P=0.000）；AFAP1L2 蛋白相對表達量為（14.01±0.92）、（13.86±1.32）、（14.59±1.02）、（12.97±0.78）、（8.42±0.91），差異有統計學意義（F=9.401，P=0.000）。AFAP1L2 蛋白及mRNA 在胰腺癌細胞株和HPDE 細胞中表達比較，差異有統計學意義（P<0.05），胰腺癌細胞株中表達較高（P<0.05）；BXPC-3，SW1990 及Capan-1 分別與PANC-1 比較，差異無統計學意義（P>0.05）；SW1990 及Capan-1 分 別 與BXPC-3 比較，差異無統計學意義（P>0.05）；SW1990 與Capan-1 比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1B、C。

圖1 miR-219a-5p、AFAP1L2在胰腺癌細胞株與HPDE中的表達

2.2 AFAP1L2表達影響胰腺癌細胞增殖

CCK-8 法結果顯示，Capan-1 細胞培養48 h，空白 對 照 組（NC 組）、pCMV-EGFP-AFAP1L2 組、siAFAP1L2 組OD 值分別為（0.387±0.007）、（0.749±0.302）和（0.146±0.081），差異有統計學意義（F=4.724，P=0.007）。pCMV-EGFP-AFAP1L2 組OD 值高于NC 組和siAFAP1L2 組（P<0.05），NC 組OD 值高于siAFAP1L2 組（P<0.05）。見圖2A。

SW1990 細胞培養48 h，NC 組、pCMV-EGFPAFAP1L2 組、siAFAP1L2 組OD 值分別為（0.410±0.082）、（0.673±0.128）和（0.213±0.103），差異有統計學意義（F=7.159，P=0.000）。pCMV-EGFP-AFAP1L2組OD 值高于NC 組和siAFAP1L2 組（P<0.05），NC 組OD值高于siAFAP1L2組（P<0.05）。見圖2B。

圖2 AFAP1L2對Capan-1及SW1990細胞增殖的影響

2.3 miR-219a-5p影響胰腺癌細胞增殖

CCK-8 法結果顯示，Capan-1細胞培養48 h，miR-NC 組、miR-219a-5p mimics 組、miR-219a-5p inhibitor 組OD 值分別為（0.272±0.031）、（0.105±0.022）和（0.569±0.068），差異有統計學意義（F=4.017，P=0.009）。miR-219a-5p mimics 組OD 值低于miR-NC 組，miR-219a-5p inhibitor 組高于miR-NC 組（P<0.05）。見圖3A。

SW1990 細胞培養48 h，miR-NC 組、miR-219a-5p mimics 組、miR-219a-5p inhibitor 組OD值分別為（0.405±0.035）、（0.255±0.062）和（0.667±0.074），差異有統計學意義（F=3.363，P=0.012）。miR-219a-5p mimics 組OD 值低于miR-NC 組，miR-219a-5pinhibitor組OD 值高于miR-NC 組。見圖3B。

圖3 miR-219a-5p對Capan-1及SW1990細胞增殖的影響

2.4 各組細胞周期比較

流式細胞術檢測細胞周期結果顯示，miR-NC組、miR-219a-5p mimics 組、miR-219a-5p inhibitor 組在G1 期、G2 期及S 期的比例比較，差異有統計學意義（P<0.05）。miR-219a-5p mimics 組在G1 期、G2 期及S期的比例分別與miR-NC組比較，差異有統計學意義（P<0.05），miR-219a-5p mimics 組G1 期、G2期比例較miR-NC組減少，S 期比例較miR-NC組升高。miR-219a-5p inhibitor 組在G1 期及G2 期比例較miR-219a-5p mimics 組升高，在S 期比例降低。見表1。

表1 各組細胞周期比較 （%，±s）

注：①與miR-NC 組比較，P<0.05；②與miR-219a-5p inhibitor組，P<0.05。

組別miR-NC組miR-219a-5p mimics組miR-219a-5p inhibitor組F 值P 值G1期80.15±0.94 68.75±1.35①②83.29±0.82 3.340 0.005 G2期9.57±1.29 4.93±1.48①②8.58±0.97 2.920 0.007 S期11.52±1.76 29.28±1.79①②9.47±0.89 11.530 0.001

2.5 各組細胞凋亡率比較

細胞凋亡結果顯示，miR-NC 組、miR-219a-5p mimics 組、miR-219a-5p inhibitor組凋亡率分別為（31.02±4.87）%、（16.52±3.19）%、（52.75±6.92）%，3 組比較，差異有統計學意義（F=3.972，P=0.016）。miR-219a-5p mimics 組凋亡率低于miR-NC 組（P<0.05），miR-219a-5p inhibitor 組凋亡率高于miR-NC組（P<0.05）。miR-219a-5p mimics 組凋亡率低于miR-219a-5p inhibitor 組（P<0.05）。

2.6 miR-219a-5p與AFAP1L2 3'-UTR具有堿基互補配對

通過生物信息學軟件進行預測分析，確定miR-219a-5p 與AFAP1L2 可能具有靶向調控關系，并確定核苷酸47～53 為3'-UTR 的結合位點。見圖4。

圖4 miR-219a-5p與AFAP1L2 3'-UTR堿基互補配對

2.7 miR-219a-5p對AFAP1L2具有調控作用

miR-219a-5p mimics 轉 染Capan-1 細胞，與miR-NC 組比較，miR-219a-5p mimics 組AFAP1L2 mRNA 及蛋白表達均下降（P<0.05）（見圖5B、圖6）。給予iR-219a-5p inhibitor 轉染Capan-1 細胞，與miR-NC組比較，miR-219a-5p inhibitor 組AFAP1L2 mRNA 及蛋白表達均上升（P<0.05）（見圖7B、圖8）。表明miR-219a-5p負向調控AFAP1L2表達。

圖5 miR-219a-5p mimics轉染對AFAP1L2 mRNA表達的影響

圖6 miR-219a-5p mimics轉染Capan-1細胞對AFAP1L2蛋白的影響

圖7 miR-219a-5p inhibitor與AFAP1L2 mRNA相對表達量比較

圖8 miR-219a-5p inhibitor轉染Capan-1細胞對AFAP1L2蛋白表達的影響

2.8 miR-219a-5p與AFAP1L2堿基互補配對

構 建 wt-AFAP1L2-pMIR-REPORT 及 mut-AFAP1L2-pMIR-REPORT 熒光報告載體，將野生型與突變型AFAP1L2 螢光報告載體與miR-219a-5p mimics 共轉染到Capan-1 細胞，螢光素酶活性檢測結果顯示，AFAP1L2 野生組miR-NC 及miR-219a-5p mimics 熒光素酶活性分別為（0.69±0.09）和（0.24±0.03），差異有統計學意義（P<0.05），轉染wt-AFAP1L2-pMIR-REPORT 的3'-UTR 端熒光素酶活性下降；AFAP1L2 突變組miR-NC 及miR-219a-5p mimics 熒光素酶活性分別為（0.64±0.11）和（0.61±0.16），差異無統計學意義（P>0.05），轉染mut-AFAP1L2-pMIR-REPORT 的3'-UTR 端熒光素酶活性無變化。見圖9。

圖9 螢光素酶活性比較

3 討論

細胞增殖被一系列的檢查點蛋白和細胞調控蛋白包括細胞周期蛋白和細胞周期依賴激酶（CDKS）保護和調控，細胞增殖調控通路的失衡會導致癌變及癌癥的發展[9-12]。miRNA 失調會通過靶向作用于細胞周期調節因子影響細胞周期，調控細胞生長速度，導致細胞周期停滯，并調控Caspase 水平，凋亡細胞增加，抑制細胞生長[12-13]。有研究顯示，miR-219a-5p 通過靶向作用于MRTFa提控乳腺癌細胞的遷移和表皮間質化，在肝癌中，miR-219a-5p 通過靶向作用于GPC3 抑制肝癌細胞增殖[14-15]。肌動蛋白絲相關蛋白（AFAP）家族是包括AFAP 1、AFAP1L1 和AFAP1L2/XB 130 在內的適配器蛋白重要成員，AFAP1L2 肌動蛋白結合蛋白和CSRC 激活蛋白，AFAP1L2 可以促進腫瘤的發展。有研究表明，AFAP1L2 可以調節細胞的生長、遷移和侵襲，可能通過cAMP-CSRC-磷酸肌醇3 激酶/Akt 途徑發揮作用[16-18]。在惡性腫瘤中，miRNA 可以對下游信號通路進行調控，從而介導惡性腫瘤細胞的增殖、細胞周期、凋亡及侵襲等惡性行為[19-21]。本研究在前期工作基礎上通過生物信息學軟件進行預測分析，miR-219a-5p 與AFAP1L2 可能具有靶向調控關系，并確定3'-UTR 的結合位點。

本研究首先檢測胰腺癌細胞及HPDE 細胞中miR-219a-5p 和AFAP1L2 的表達，發現miR-219a-5p在胰腺癌細胞株中的表達低于HPDE 細胞，AFAP1L2 mRNA 及蛋白在胰腺癌細胞株中的表達高于HPDE 細胞。細胞增殖試驗顯示，AFAP1L2 對胰腺癌細胞增殖具有正向調控作用。miR-219a-5p 表達對胰腺癌細胞增殖具有負向調控作用，對AFAP1L2 及miR-219a-5p 表達水平的調控間接驗證兩者對胰腺癌細胞增殖具有相反作用。另有研究顯示，miR-219a-5p 與腫瘤直徑、組織學分化程度及肝癌患者總生存時間具有相關性，miR-219a-5p抑制肝癌細胞增殖，并促進其從G1 期向S 期轉化[15]。本研究也顯示，在胰腺癌細胞中上調miR-219a-5p表達，可誘導細胞S 期阻滯，導致細胞凋亡增加。本研究為進一步研究miR-219a-5p 及AFAP1L2 在胰腺癌細胞增殖調控中的機制，檢測了miR-219a-5p表達上調或下調后AFAP1L2 mRNA 及蛋白水平的變化，結果顯示，miR-219a-5p 負向調控AFAP1L2 表達，為進一步驗證兩者是否具有直接的調控關系，進行螢光素酶活性檢測試驗，結果顯示miR-219a-5p與AFAP1L2 的3'-URT互補結合，miR-219a-5p 與AFAP1L2 存在直接的靶向調控關系。本研究對miR-219a-5p 及AFAP1L2 在胰腺癌細胞增殖調控中機制的研究結果顯示，miR-219a-5p 通過調控AFAP1L2 表達負向介導胰腺癌細胞增殖。HUANG等[15]對83 例肝癌組織中miR-219a-5p 表達進行檢測，結果顯示，miR-219a-5p 高表達的患者腫瘤體積小，組織分化程度高，患者總生存率長，并通過負向調控GPC3 表達抑制肝癌細胞增殖。LAHDAOUI 等[22]研究顯示，miR-219 的3'-UTR 與MUC4 互補結合，具有靶向調控關系，通過對MUC4 的直接調控，激活Akt 及Erk 信號通路，影響胰腺癌細胞遷移及增殖，是抑癌基因。ZHAO 等[23]觀察AFAP1 RNA 對胃癌的預測價值，結果顯示，AFAP-RNA 與胃癌生存期呈負相關，對胃癌細胞增殖具有促進作用。WANG 等[24]認為，在肺癌中，AFAP1L1 下調會激活Caspase-3 和P38 表達，抑制PRAS 40 表達，對肺癌細胞增殖具有促進作用，加速細胞周期的進程，阻止細胞凋亡。目前在腫瘤研究中沒有miR-219a-5p 對AFAP1L2 的調控作用研究。MüLLER 等[25]對胰腺癌中多個miRNA 進行篩查，并對靶點進行觀察及預測，進一步評價miRNA對胰腺癌診斷、預后預測及治療靶點選擇的意義。本研究結論為miR-219a-5p 通過靶向調控AFAP1L2表達負向介導胰腺癌細胞增殖及凋亡。隨著研究的深入，miR-219a-5p 及AFAP1L2 可能成為未來胰腺癌診斷的腫瘤標志物及預測預后的靶基因。