循環漿細胞在多發性骨髓瘤中的研究進展

左依凡 陳兵

1 多發性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)概述

MM是一種多發于>60歲人群的漿細胞惡性腫瘤，約占血液系統惡性腫瘤10%～15%[1]，是血液系統第二大常見惡性腫瘤。典型特征是在骨髓(bone morrow，BM)內漿細胞的惡性增殖[2]，伴或不伴有外周血和(或)其他髓外組織，如骨、軟組織或皮膚的浸潤[3]。已有研究表明,意義未明的單克隆丙種球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS)是MM的前體階段[4]。MGUS是最常見的漿細胞腫瘤，每年約有1%的MGUS病人發生惡性轉化[4]。MM病人也可能發展為最具侵襲性的漿細胞腫瘤亞型，即漿細胞白血病(plasma cell leukemia, PCL)，其特征是血液中循環漿細胞(circulating plasma cell, CPC)>2×109/L。在這種情況下，惡性漿細胞不再依賴于骨髓基質而是在外周血中循環。

目前，MM仍不可治愈。在過去的十年中，隨著蛋白酶體抑制劑(proteasome inhibitors, PIs)、免疫調節劑(immunomodulatory drugs, IMiDs)及單克隆抗體等新藥的臨床應用，MM病人的總體生存率明顯提高，但生存率存在顯著差異。因此，我們需要重視和加強對疾病的監測與管理。傳統的外周血/尿免疫球蛋白、游離輕鏈、骨髓異常漿細胞、影像學檢查等檢測手段已難以滿足MM復雜的預后判斷。新的檢測項目和方法，對MM預后因素和危險分層的評估、確定治療策略、治療效果以及預后預測具有重要意義。本文將對CPC在MM中的意義和檢測現狀做一綜述。

2 CPC

在實體瘤和大多數血液惡性腫瘤(包括漿細胞腫瘤)中，腫瘤擴散和遠處轉移最常見的方式是釋放腫瘤細胞進入血液循環。循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)是指從原發腫瘤或轉移腫瘤部位釋放到循環中的細胞，其也在漿細胞腫瘤中被發現, 流式細胞術可通過其表面標記物對其檢測。CPC很早就在PCL病人的血液中被檢測到，也在相當一部分MM病人中被檢測到，在MGUS病人中檢測到的較少[5]。惡性漿細胞會離開BM，通過循環進入外周血，然后再特異性歸巢到BM壁龕或其他某些器官或組織，形成局部微轉移灶，以一種“轉移/擴散”方式將疾病擴散到整個BM及髓外組織[6]。

1962年，Ginsberg 研究團隊首次證實CPC在MM病人中存在[7]，此后大量相關研究陸續開展。2013年Paiva等[8]進一步研究了CPC表型、細胞遺傳學和功能特征以及晝夜分布。結果表明，CPC代表了BM克隆漿細胞的一個獨特亞群，其特征是整合素(CD11a/CD11c/CD29/CD49d/CD49e)、黏附(CD33/CD56/CD117/CD138)和激活分子(CD28/CD38/CD81)的下調。此外，將CPC與BM基質細胞共培養時，其大多處于靜止狀態，且具有較高的克隆發生潛能。MM病人每日外周血中CPC絕對數量有顯著波動，在凌晨4:00～12:00達到峰值，下午16:00～24:00達到最低點。這表明在MM病人中，CPC 在休息期間可能會流出至外周血以定植/轉移至除BM的其他部位。

3 CPC與MM關系

CPC的存在在單克隆免疫球蛋白疾病的各階段都是高危標志，其對疾病進展風險具有預測作用。研究顯示，外周血中CPC的存在與MGUS[9]和冒煙型骨髓瘤(smoldering multiple myeloma, SMM)[10]惡性轉化為有癥狀MM的風險增加相關。Kumar等[9]對325例診斷為MGUS病人的外周血CPC進行了分析，結果顯示與無CPC病人相比，有CPC病人進展為另一種漿細胞疾病(最常見的是MM)的可能性是前者2倍(OR=2.1,P=0.03)。Bianchi等[10]使用免疫熒光法對91例SMM病人外周血CPC進行檢測，結果表明，伴有高水平CPC(定義為外周血漿細胞>5%)SMM病人在診斷后2～3年內進展風險增高。Gonsalves等[11]也對100例SMM病人外周血CPC通過流式細胞術進行評估，結果顯示CPC的存在與更短的進展時間(time to progression，TTP)相關[10個月vs未達到(P<0.001)]。有研究表明，血液中CPC的數量從MGUS(CPC中位數為0.008/μL)到SMM(中位數為0.16/μL)和MM(中位數為1.9/μL)逐漸增加[12]。王晶等[13]對17例MM病人[髓外漿細胞瘤(extramedullary plasmacytoma,EMP)陰性者8例，EMP陽性者9例]采用流式細胞術對CPC進行檢測，結果顯示EMP陽性組CPC陽性率明顯高于EMP陰性組(88.9%比25.0%，P=0.008)，這對病人是否有髓外轉移具有重要的提示作用。

外周血中CPC可能與侵襲性生物學(較高的增殖率、較高的細胞遺傳異常發生率和血管生成增加)相關[14]。CPC被認為是干細胞樣腫瘤漿細胞，血液中CPC數量的增加可能會導致腫瘤更快、更廣泛地擴散到整個BM及髓外部位，這就可以解釋血液中較高的CPC計數與該病侵襲性特征之間的關聯[12]。Nowakowski等[15]的研究也證實了上述觀點。然而，Gonsalves等[16]認為CPC可能與腫瘤負荷存在正相關性。無論采用形態學還是流式細胞術方法，血液中CPC水平高的MM病人BM漿細胞比例都較高。未來還需要更大樣本進一步驗證CPC與腫瘤負荷確切的相關性。

3.1 新診斷多發性骨髓瘤(newly diagnosed multiple myeloma，NDMM) 在NDMM病人中，約75%的病人外周血中檢測到CPC，CPC的數量被證明是整體生存的獨立預測因子[15]。即使流式細胞術或免疫熒光檢測到非常少的CPC，對于NDMM病人，其預后也較差[14]。Nowakowski等[15]研究結果表明，CPC>10個的病人中位總生存期(overall survival，OS)明顯少于CPC<10個的病人(37.3個月比58.7個月,P=0.001)。在新藥治療時代，Gonsalves等[16]對157例NDMM病人(96%病人采用PIs/IMiDs為主的新藥誘導治療)的外周血CPC采用流式細胞術進行評估結果顯示，CPC≥400個組和CPC<400個組病人的中位至下次治療時間(time to next treatment，TTNT)分別為14個月和26個月(P<0.001)，2組對應的中位OS分別為32個月和未達到(P<0.001),且CPC≥400個組病人的國際分期系統(international staging system,ISS)分期、肌酐水平、漿細胞標記指數、骨髓漿細胞百分比、存在熒光原位雜交法(FISH)高危因素病人比例均高于CPC<400個組病人。在多變量分析中，CPC≥400個對OS及TTNT的負面影響均具有統計學意義。在新藥時代，CPC的檢測不僅可以評估NDMM病人預后，也可以預測自體造血干細胞移植(autologous stem cell transplantation，ASCT)后的早期復發[14]。Chakraborty等[17]分析了247例新藥誘導治療后早期行ASCT的NDMM病人，分別在診斷時和移植前用流式細胞術對其CPC進行評估。結果顯示，診斷時CPC陽性的病人中，誘導治療后CPC轉陰與移植后無進展生存期(progression-free survival，PFS)和OS的顯著改善有關。然而，與在診斷時和ASCT前沒有檢測到CPC的病人相比，他們的生存率仍然較低。移植后嚴格意義的完全緩解(stringent complete response，sCR)在CPC-/-組為32%，在CPC+/-組為30%，在CPC+/+或-/+組為12%(P=0.018)。ASCT后3組的中位PFS分別為30、24和14個月，5年總生存率分別為83%、70%和43%(P<0.001)。 Gonsalves等[18]的另一項研究對556例NDMM病人外周血CPC進行分析，將那些≥5 CPCs/μL且修訂的國際分期系統(Revised International Staging System, R-ISS)Ⅰ期或Ⅱ期的病人重新分類為R-ISS ⅡB期。在診斷時，有、無CPC的病人中位TTNT和OS分別為25個月比43個月(P<0.001)和54個月比89個月(P<0.001)。診斷時≥5 CPCs/μL的病人，其TTNT和OS如下：R-ISS Ⅰ期為40個月和未達到； R-ISSⅡ期為30個月和72個月；R-ISSⅡB期為21個月和45個月，R-ISS Ⅲ為20個月和47個月。可見R-ISS ⅡB期的病人TNNT和OS與R-ISS Ⅲ期相似。由此表明，將CPC數量納入目前R-ISS分期系統能使NDMM病人的預后評估更準確。

3.2 復發難治性多發性骨髓瘤(relapsed or refractory multiple myeloma，RRMM) 對于RRMM病人，復發后需要重新分層指導治療。RRMM的不良預后包括初診已經存在或新近獲得的高危細胞遺傳學異常、高β2微球蛋白和(或)低血清白蛋白(即ISS Ⅲ期)、異常乳酸脫氫酶、輕鏈或IgA型、腎功能不全和髓外疾病[19]。緩解時間短、進展快、既往治療較多也是不良預后的預測因素[20]。Gonsalves等[21]將上述因素納入647例接受連續治療的RRMM病人中進行研究，采用流式細胞術對其外周血CPC進行評估。結果顯示，CPC在完全緩解(complete response，CR)病人中均陰性。在疾病穩定(stable disease，SD)病人中，CPC的存在預示中位生存期較差(22個月比未達到;P=0.004)，在疾病進展(progressive disease, PD)病人中，CPC≥100個(流式細胞儀收集150 000個細胞時)預示生存期較差(12個月比33個月;P<0.001)。該研究強調CPC檢測在疾病處于CR或SD病人中的重要性。Rawstron等[22]報道了治療后CPC數量下降的趨勢，RRMM的早期CPC狀態可能具有預后價值，并有助于識別最終對挽救治療有反應或失敗的病人。RRMM病人在第一個治療周期后CPC不降低可能有助于早期識別對該治療有耐藥性的病人[23]。目前對RRMM病人CPC的研究較少。

4 CPC作為新生標志物

CPC的臨床意義及其隨時可及性為疾病的診斷和評估帶來了新視角，有望將CPC納入新的危險分層標準，評估病情、指導治療。Abe等[24]研究了PET-CT結合定量CPC對MM病人的預后價值。結果表明，除了腫瘤負荷外，這2個參數可能反映骨髓瘤略微不同的生物學特征，并且它們作為預后標記可能相互補充。PET-CT結合定量CPC系統的預后表現獨立于高危的細胞遺傳異常狀態(CAs)或R-ISS(這是已知最強大的預后因素)，提示該系統可以用來補充和改進已建立的分層策略。未來對更多病人的CPC及其對應的骨髓漿細胞的橫向、縱向基因組和免疫表型研究將進一步闡明其發病機制和在疾病進展中的作用。

由于CPC在MM病人外周血中數量較少，因此其檢測一直是一個挑戰。傳統細胞學是檢測MM病人血液中存在大量CPC的一種簡便、快速的方法，但由于評估的有核細胞數量有限和它們的形態相似性，通常不能準確地將其從正常/反應漿細胞中區分出來，特別是在CPC數量較低的病人中。因此，免疫熒光顯微技術隨后被采用。它可以更靈敏、準確地評估MM病人血液中的CPC[9]。這項技術可以檢測10 000個單核細胞中的1個克隆漿細胞(靈敏度為10-4)，從而提高了傳統細胞學的靈敏度。但該技術存在靈敏度相對有限、費時費力、CPC純度低等局限性，阻礙了其在許多實驗室的常規應用[25]。流式細胞術作為一種簡單、快速(<4 h)、經濟和通用的方法，已被廣泛用于鑒定、表征和計數MM病人血液中的CPC[25]。通過流式細胞儀可以識別出50%～75%NDMM病人中的CPC，具體取決于標記物和使用的特異性抗體組的數量，分析的細胞數以及樣品制備方案[26]。但目前缺乏標準化的方案(抗體選擇及每個樣品分析的細胞數量的異質性)，檢測CPC的靈敏度水平不穩定，以及對新鮮樣品(<24～48 h)的需求也限制了結果的可重復性，也因此限制了其更廣泛的用途和適用性。下一代流式細胞術(next-generation flow cytometry, NGF)與傳統的流式細胞術(8～10色)相比，靈敏度和可重復性更高[27]。最近NGF也被用于檢測MM病人血液中CPC[12]。近年來，Allele-specific oligonucleotide定量聚合酶鏈反應(ASO-qPCR)和下一代測序(next generation sequencing，NGS)等分子技術也應運而生。它們是用于檢測和定量CPC的高特異性和靈敏性(<10-5～10-6)的分子方法[28]。與ASO-qPCR相比，NGS是一種更靈敏、適用度更廣的分子技術。ASO-qPCR和NGS等分子技術不需要新鮮樣品，因為它們可以使用存儲的血液衍生核酸來評估CPC[29]。但其檢測周期較長，無法及時反映CPC狀態，且其對CPC及MM病人的相關性仍需進行大量研究。綜上，流式細胞術是目前在臨床及科研領域應用檢測 CPC的最佳方法。

5 存在問題及展望

綜上所述，CPC作為一個新的預后生物標志物，其存在與疾病進展、不良的細胞遺傳學、較低的總生存率和較高的復發率有關，同時可預測侵襲性疾病進展，在評估NDMM和RRMM病人的預后中發揮著重要作用。有關CPC的生物學特征和病理生理機制有待進一步研究。