血管平滑肌細胞增殖在動脈粥樣硬化中的研究進展

柳麗 黃菁菁 李曉慶 季軍 周鵬 魯翔 何慧薇

心血管疾病是全人類死亡的主要原因之一，來源于中動脈層的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖是形成動脈粥樣硬化斑塊的核心機制之一。在動脈粥樣硬化形成過程中，VSMCs經歷了復雜的結構和功能變化，產生不同的表型促進VSMCs的增殖[1]。VSMCs動態調節表型后增殖的能力促使其在控制血壓、血液分布以及維持血管結構完整性方面發揮著重要作用，參與生理和病理性血管重塑。VSMCs增殖的調控過程極為復雜，包含多種調控分子和信號途徑的共同作用，因此詳細了解VSMCs的特征及其增殖過程對研究用于血管治療的新藥物至關重要。本文就VSMCs增殖在動脈粥樣硬化中的研究進展及當前藥物研究情況做一綜述。

1 VSMCs增殖與動脈粥樣硬化

在正常動脈中，VSMCs位于內側層，負責動脈的收縮以及分泌細胞外基質(extracellular matrix, ECM)，并在維持動脈順應性及彈性回彈中起重要作用。正常動脈中的VSMCs表達一系列“SMC標記”，通常包括平滑肌細胞肌球蛋白重鏈(MYH11)，SM22α/tagln、平滑肌細胞肌動蛋白(ACTA2)、平滑肌素等。在動脈粥樣硬化血管中，VSMCs的這些標志物表達降低，反而獲得了細胞增殖、遷移以及分泌各種ECM和細胞因子的能力。VSMCs是一種具有表型轉化能力的細胞類型，在動脈粥樣硬化前病變彌漫性內膜增厚(diffuse intimal thickening，DIT)時，VSMCs由中膜向內膜遷移，并在此過程中完成靜止的“收縮”表型向激活的“合成”表型轉化[2]。“合成”型VSMCs以收縮蛋白表達減少為特征，增強生長因子、受體以及ECM蛋白酶的表達，并由中膜向內膜遷移和增殖，有助于形成初始的動脈粥樣硬化斑塊。在晚期階段，他們會進一步增殖聚集，形成纖維帽以穩定易碎斑塊。早期的研究表明，VSMCs可以通過促進纖維帽形成，穩定動脈粥樣硬化斑塊，保護斑塊不破裂，這被認為是個有益的作用。但近年來的研究表明，VSMCs似乎比預期更為多變，可以通過失去VSMCs特征變成泡沫細胞，并獲得炎癥細胞的特征。

在動脈粥樣硬化過程中，VSMCs能向多個表型轉化，包括鈣化(成骨、軟骨形成和破骨)和巨噬細胞表型。一方面，一些VSMCs在表型轉化時獲得巨噬細胞特性，分化為脂質負載的泡沫細胞樣巨噬細胞，通過降低清除脂質、死亡細胞和壞死碎片的能力以及加劇炎癥來促進動脈粥樣硬化[3]。另一方面，VSMCs向鈣化表型方面轉化。VSMCs表型的可塑性和骨軟骨分化在動脈粥樣硬化性動脈內膜鈣化中起關鍵作用[4]。動脈內膜鈣化與動脈粥樣硬化不良事件，如斑塊破裂、心肌梗死、卒中等有重要關系。VSMCs通過調節表型促進細胞增殖，從而參與動脈粥樣硬化全進程。

2 影響VSMCs增殖的主要因子及信號通路

影響VSMCs增殖最主要的因子是血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)及其受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)。他們可通過影響多條下游信號通路來刺激VSMCs增殖，包括Ras/MAPK、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt)等通路，這些信號通路均受蛋白酪氨酸磷酸酶負性調控。除此之外，成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、胰島素和膆島素樣生長因子1(IGF-1)也可以進一步刺激VSMCs的增殖。促進VSMCs增殖的活性物質包括：血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)和內皮素-1(endothelin 1, ET-1)、凝血酶、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、整合素、環核苷酸磷酸二酯酶和端粒酶等。炎性細胞因子ILs、TNF-α、鈣以及活性氧(reactive oxygen species, ROS)等,最終都將通過影響細胞周期進程調控VSMCs的增殖。

2.1 PDGFR及其相關信號通路

2.1.1 Ras/MAPK信號通路：以癌基因H-Ras, K-Ras以及N-Ras為主要代表的Ras家族成員可調節細胞轉化、致瘤和轉移，并與絲裂素活化蛋白激酶(MAPKs)細胞外信號調節蛋白激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38一起參與PDGFR的信號轉導，并在VSMCs增殖中發揮了重要作用。以往研究表明，在血管損傷細胞模型和活體動物研究中，沉默H-Ras基因可以抑制大鼠頸動脈球囊損傷后內膜增厚[5]；雷公藤內酯醇可以使MAPK信號通路失活，抑制細胞周期蛋白p21和成視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein, RB)的表達，從而抑制VSMCs增殖[6]。

2.1.2 PI3K/Akt途徑：PI3K通過激活蛋白激酶B(Akt)和蛋白激酶C(PKC)家族的一些成員調節VSMC增殖和遷移，并在血管損傷后促進新生內膜增生，使用PI3K或Akt抑制劑可以抑制VSMCs的增殖[7]。過表達的PKC-δ可以通過抑制細胞周期蛋白D1和E的表達來抑制VSMCs的增殖。研究表明，高水平的趨化素樣因子1與G2/M期中VSMC的積累和少量凋亡的VSMC有關[8]，而Akt1si-RNA納米粒子洗脫支架具有減輕支架內再狹窄的能力[9]。

2.1.3 磷脂酶C-γ(PLC-γ)途徑：PLC-γ與PDGFR結合后被磷酸化并獲得催化活性，是激活PDGFR信號轉導的重要介質。PLC-γ催化二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)分解為肌醇-1,4,5-三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)，進而通過調控胞內Ca2+和PKC活性激活下游信號。PKC的過度表達或磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1(PDK1)對內源性激酶的刺激作用可導致p21的降解，p21是細胞周期進程的抑制因子，從而促進細胞增殖。體外實驗表明，PDGFR-β誘導的PLC-γ信號中斷抑制了PDGF對VSMCs的分裂和趨化反應，促使小鼠因球囊損傷新生內膜形成減少[10]。

2.1.4 JAK/STAT途徑：Janus激酶(JAKs)是一種通過JAK-STAT途徑傳遞細胞外信號的非受體酪氨酸激酶。JAKs可能與G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)、細胞內細胞因子受體[IL-6和干擾素-γ(IFN-γ)受體]的結構域有關。細胞因子受體與配體結合導致JAKs二聚體化、相互轉磷酸化和活化，通過酪氨酸殘基為信號轉導和轉錄激活因子(STAT)蛋白提供對接位點。STATs在調控細胞周期進程中起著重要作用，在哺乳動物中，存在7種不同的STAT基因，他們的特征序列以及其組織特異性分布使特征反應成為可能。研究表明，STAT3通過上調細胞周期蛋白D2、D3和A，細胞分裂周期25A(CDC25A)以及下調細胞周期抑制劑p21和p27來刺激G1/S相轉變。故沉默STAT3的表達可降低球囊損傷大鼠的VSMCs新生內膜增殖。內皮細胞中JAKs活性的負調控因子細胞因子信號傳導抑制因子-3(SOCS-3)的過度表達，可抑制STAT3磷酸化及活化，從而抑制IL-6/IFN-γ介導的VSMCs的遷移和增殖[11]。

2.1.5 蛋白酪氨酸磷酸酶：蛋白酪氨酸磷酸酶是PDGFR及下游信號通路的負調節因子。胞漿低分子量磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶(LMW-PTP)、T細胞蛋白酪氨酸磷酸酶(TC-PTP)和蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(PTP-1B)均可使PDGFR去磷酸化。 Akt的活性由磷酸酶2A(PP2A)調節。磷酸酶和緊張素同源物(PTEN)是PI3K/Akt途徑的負調控因子。有研究表明，在VSMCs中過度表達PTEN抑制了Ang Ⅱ誘導的細胞增殖和遷移。受體樣磷酸酶密度增強磷酸酶-1(DEP-1)去磷酸化PDGFR，從而影響PLC-γ信號傳導[12]。磷酸酶通過脫磷酸化STAT激活酪氨酸激酶直接或間接調節STAT活性。

2.2 FGF及其信號通路 FGF可以刺激VSMCs增殖。盡管酸性FGF和堿性FGF都能促進VSMCs的分裂，但大量研究表明，與酸性FGF相比，堿性FGF在血管發育和病理學中發揮著更重要的作用。FGF和PDGF有部分相同的信號通路，如Ras/MAPK的信號轉導。全身注射抗堿性FGF的中和抗體可顯著抑制球囊損傷大鼠VSMCs的增殖。

2.3 EGF及其信號通路 EGF家族由幾種肽類生長因子組成，包括EGF、肝素結合表皮生長因子樣生長因子、表調節素、β纖維蛋白、兩性霉素和4種神經調節蛋白(NRG-1、2、3、4)，他們均具有刺激VSMCs增殖的作用。所有表皮生長因子受體(EGFR)配體均可促進VSMCs向增殖表型轉化。此家族所有成員都必須被去整合素和金屬蛋白酶蛋白裁切，才能具有生物活性。一些研究表明，表調節素是一種由AngⅡ、ET-1和凝血酶誘導的VSMCs分泌的促分裂素，他可能有助于VSMCs的增殖[13]。EGF家族成員與其同源受體結合以影響VSMCs的遷移和增殖。EGF和PDGF的共同信號通路，包括Ras/MAPK、PI3K/Akt、PLC-γ和JAK/STAT信號通路等。

2.4 AngⅡ及其相關信號通路 腎素-血管緊張素系統存在于全身和局部循環中，AngⅡ便來自于此，并發揮著收縮血管的重要作用。急性刺激AngⅡ可調節體內鹽/水平衡、血管運動張力和血壓，而慢性刺激可加速VSMCs的增殖和肥大，影響VSMCs的遷移和細胞外基質沉積，并導致心臟和血管重塑。大量研究表明，干擾AngⅡ的表達可抑制VSMCs的增殖。IOX1作為一種含有2AJumonji結構域(JMJD2A)的抑制因子，可通過選擇性調控細胞周期相關蛋白D1和p21，抑制AngⅡ刺激的VSMCs增殖，IOX1因此被證明是可能治療動脈粥樣硬化的一種潛在的治療劑[14]。

2.5 胰島素和IGF-1信號通路 胰島素是胰腺β細胞產生的一種激素，負責調節葡萄糖。IGF-1是一種與胰島素同源的肽。在VSMCs中，這2種物質通過激活胰島素受體(insulin receptor, IR)表現出類似的信號功能，隨后將由4個(IRS-1、2、3、4)成員組成的胰島素受體底物蛋白(IRS)磷酸化。IR有2種剪接異構體，他們通常在細胞中共同表達。這些細胞還表達高度相關的胰島素樣生長因子-1受體(IGF1R)，IGF1R也能被胰島素激活。IRS-1和2可以激活2種主要的信號轉導途徑：PI3K/Akt和MAPK。許多研究表明，IGF-1/胰島素相關途徑刺激VSMCs增殖。IGF-1在VSMCs中的促分裂作用是通過IGF1R和PI3K介導的。PI3K/Akt、細胞內磷脂酶2(CPLA2)和ERK1/2在VSMCs增殖中也具有重要作用。此外，IGF1R在腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)誘導的VSMCs增殖中起重要作用。如反義寡核苷酸抑制TRAIL誘導的VSMCs增殖[15]。

2.6 非編碼RNA(ncRNA)及其信號通路 非編碼基因組通過調控基因編程和基因調控在心血管疾病中起著關鍵作用，如微小RNA(microRNA，miRNA)、小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)和長非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)。miRNA是一類長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，通過抑制信使RNA(messenger RNA, mRNA)翻譯或促進mRNA降解，從而在轉錄后水平調節基因表達。許多miRNA參與VSMCs的增殖調控[16]。miRNA-221和miRNA-222通過沉默靶蛋白CKI p27Kip1、p57Kip2和c-kit實現VSMCs的增殖。敲除miRNA-221或miRNA-222能夠抑制大鼠頸動脈損傷后VSMCs的增殖和新內膜的形成[17]。 miRNA-22是VSMCs表型轉換和血管新生內膜病變形成的新型調節劑，通過作用于其靶基因MECP2、HDAC4和EVI1來促進VSMCs收縮基因表達并抑制VSMCs的增殖和遷移[18]。lncRNA是長度大于 200 個核苷酸的非編碼RNA，近年來發現lncRNA參與多種細胞信號通路，調控細胞分化、增殖、遷移和凋亡[19]，例如lncRNA HCG11通過靶向miR-144-3p/FOXF1軸促進動脈粥樣硬化中VSMCs的增殖并抑制其凋亡[20]。lncRNA-H19可以通過lncRNA-H19/miR-148b/WNT/β-catenin軸促進VSMCs的增殖并抑制其凋亡，也可以通過miR-675/PTEN軸促進VSMCs的增殖[21]。

3 VSMCs增殖的調節劑

3.1 臨床上用于抑制VSMCs的藥物

3.1.1 紫杉醇：是從紅豆杉中分離出來的一種天然二萜類化合物，是第一個被發現含有紫杉烷環的化合物，具有抗腫瘤活性[22]。紫杉醇是迄今為止已知的細胞分裂阻斷劑，能通過穩定細胞來干擾有絲分裂微管的聚集，阻斷有絲分裂紡錘體的解體，從而抑制有絲分裂活性。起初因紫杉醇不溶于水使其使用受限，后通過其衍生物10-脫乙酰基-巴卡亭Ⅲ解決了溶解度問題，使得紫杉醇廣泛被用于洗脫支架。許多臨床研究已經明確提出紫杉醇洗脫支架可以預防再狹窄[23]。目前正在研發的新制劑主要集中在納米載體技術上。白蛋白結合型紫杉醇(Abraxane?)自2007年開始用于臨床治療，其他幾種紫杉醇陽離子脂質體也已批準或正在進行臨床試驗的不同階段。

3.1.2 雷帕霉素：早期研究發現雷帕霉素是一種具有抗真菌活性的化合物，隨著研究的深入，研究人員發現雷帕霉素還具有免疫抑制和抗增殖活性的作用。雷帕霉素可阻斷mTOR，通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶調節細胞增殖、生長及運動[24]。目前雷帕霉素衍生物(如依維莫司、佐他莫司)和生物可吸收聚合物是下一代支架研究的熱點[25]。

3.2 體外實驗中有效抑制VSMCs的天然產物 到目前為止，大量體外研究證實許多天然產物能有效抑制VSMCs增殖。如金絲桃苷、黃岑苷及紅酒和葡萄皮中含有的白藜蘆醇。研究表明：白藜蘆醇可以抑制肺動脈高壓小鼠模型中的心室肥大；金絲桃苷作為核受體Nur77的一種有效激活劑，對血管系統有積極影響[26]；天竺葵苷能顯著抑制PDGF-BB誘導的遷移，降低局部黏著斑激酶(FAK)和FAK的磷酸化，減少F-肌動蛋白的表達，但不影響細胞增殖和FAK的磷酸化。黃岑苷是一種類黃酮化合物，在體外實驗中黃岑苷通過miR-126-5p下調高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的表達，顯著抑制氧化LDL誘導的VSMCs增殖和遷移，從而抑制動脈粥樣硬化的進展[27]。

4 結論

VSMCs的增殖受許多生長因子及其受體、血管活性物質、凝血因子、炎性因子、神經遞質、ncRNA和其他分子的影響。這些因素和信號通路的相互作用最終形成了一個共同的調節途徑——細胞周期。由于VSMCs的過度增殖是動脈粥樣硬化、再狹窄和肺動脈高壓等多種心血管疾病的病因，探尋抑制這一過程的方法具有極其重要的意義。盡管調控VSMCs增殖過程的機制很復雜，但最近三十來年的許多體外和體內研究說明VSMCs增殖是可被調控的，近些年也通過深入研究VSMCs的增殖機制尋找到一些心血管疾病治療的新靶點。未來將有更多用于調節VSMCs增殖的新藥物被用于治療心血管疾病，這將為心血管疾病的藥物治療提供新的方向。