單細胞測序技術及其在結直腸癌中的應用

鄭磊 ，路佳

結直腸癌是常見的胃腸道腫瘤之一，其發病率隨著年齡的增長而增加。根據最新癌癥統計結果，結直腸癌是世界第三大常見的惡性腫瘤，位居肺癌和胃癌之后［1］。30%～50%的新確診患者已進展為轉移性結直腸癌，其 5 年生存率僅為 50%～60%［2］。腫瘤異質性是由于單個腫瘤內的細胞出現不同程度的分化，導致的癌細胞之間遺傳和分子特征的差異［3］，其在癌癥的形成和發展過程中起重要作用。結直腸癌具有高度異質性，傳統的研究方法僅能對整個腫瘤組織進行分析，無法在單細胞水平比較腫瘤內的差異［4］。單細胞分離和測序技術以單個細胞為研究對象，能夠對細胞異質性進行較為深入的研究［5］。單細胞分離技術結合高通量測序技術使得解析腫瘤組織的異質性分子特征成為可能，可應用于基礎研究、臨床診斷和藥物開發領域［6］。此外，它還可用于發現異常增生的細胞類型，以尋找結直腸癌新的發病機制［7］。本文對單細胞測序技術及其在結直腸癌中的應用進行系統綜述。

1 單細胞測序技術簡介

根據樣本類型，單細胞測序技術可分為單細胞基因組測序和單細胞轉錄組測序。目前已經開發了不同的方法進行單細胞捕獲和文庫構建，每種方法均有各自的技術特點。單細胞基因組測序技術中的多次退火環狀循環擴增技術能夠對分離的單細胞中的微量全基因組DNA進行高效擴增，獲得高覆蓋率的完整的基因組后進行高通量測序。單細胞轉錄組測序技術 Smart-seq2、液滴測序（Drop-seq）、10×Genomics 等能夠滿足高靈敏度、低偏好性的cDNA擴增，具有一定的應用前景。

1.1 單細胞測序樣本制備 單細胞樣本制備主要有細胞團及組織獲取、細胞懸液制備、單細胞分類、單細胞分散到獨立容器4個步驟。不同的樣本類型制備單細胞的方法各不相同，單細胞捕獲質量決定了單細胞測序技術的通量和成本。單細胞捕獲最初采用纖維吸取或激光捕獲顯微分離技術分離單個細胞，特定類型的單細胞也可以通過熒光激活細胞分類術（fluorescent activated cell sorting，FACS）分離到孔板中。基于微孔或液滴的微流控高通量方法Drop-seq利用微流控裝置將帶有條形碼的微珠和細胞一起裝入微液滴，將液滴分割成納升大小的反應室，條形碼隨后會連接到反轉錄后的cDNA上，由此可檢測數以千計的細胞，提高了分離細胞的通量和效率［8］。

通過單細胞捕獲后得到的單個細胞懸液可進行相應細胞類型的細胞原代培養，根據細胞類型選擇相應的培養條件。經過培養的低代次的細胞在細胞狀態上基本與體內性狀差異不大，而且可以有效去除前期分散處理過程中的死細胞和細胞碎片，恢復一定的細胞活力。經過原代培養后，可通過顯微鏡挑取單細胞于EP 管中，或通過流式細胞儀進行分選，選擇活力好的細胞群，分選單細胞于96孔板中，用于單細胞測序分析［9］。

1.2 單細胞建庫及測序

1.2.1 單細胞全基因組建庫測序 由于人類單個二倍體細胞中能分離出的DNA含量極少，因此需要進行全基因組擴增（whole genome amplification，WGA），以滿足高通量測序的樣本量需求［9］。在單細胞全基因組建庫及測序中，WGA是其關鍵步驟。常用的WGA 技術有：（1）簡并寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR）。DOP-PCR 是一種特殊的PCR，由于是指數擴增，因此對細胞基因組的物理覆蓋率一般低于10%［10］。（2）多重置換擴增（MDA）。MDA 是一種利用phi29聚合酶對基因組進行指數擴增的技術，對單細胞基因組或外顯子組物理覆蓋率大于90%［10］，解決了基于PCR 擴增帶來的偏倚。（3）Nucseq。Nuc-seq是2014年由Wang等［11］開發的全基因組和外顯子組單細胞測序方法，該方法通過檢測G2/M期細胞核，使細胞基因組平均覆蓋率達到了91%。

1.2.2 單細胞全轉錄組建庫及測序 單細胞轉錄組建庫過程為：捕獲和裂解單個細胞，將釋放的mRNA反轉錄成cDNA，隨后通過多聚胸腺嘧啶、T 重復寡核苷酸啟動方法進行擴增，以構建測序文庫。雙鏈cDNA 合成可直接通過PCR 實現，但可能引入擴增偏差。因此，科學家們利用莫洛尼鼠白血病病毒轉錄酶的鏈轉換活性開發了模板切換技術，包括STRT-seq 和 SMART-seq/Smart-seq2，以減少 3'覆蓋偏差。其他方法如CEL-seq、CEL-seq2 和MARS-seq，通過將T7啟動子并入寡核苷酸引物中，在第二鏈合成后進行體外轉錄以線性擴增。在Illumina 測序平臺上制備測序文庫也需要片段化和適配器合并［12］。

單細胞全轉錄組測序可進行3'、5'端和全長測序，需根據研究目的選擇合適的測序平臺。全長測序方法如Smart-seq2，在基因表達檢測中顯示出更高的靈敏度，并且能夠檢測剪接轉錄變體和T/B 細胞受體（TCR/BCR）序列［13］。該技術的通量較低，成本較高，而InDrop、Drop-seq 或10×Chromium 等3'端測序方法，可同時取樣數千個細胞，更適合于細胞類型和標記的鑒定。既往研究表明，測序深度可能會影響靈敏度，但不會明顯影響細胞分型的準確性［13］。一般而言，每個細胞讀取50 000次就足以進行無偏差細胞聚類和標記識別。

2 單細胞測序在結直腸癌中的應用

腫瘤異質性是癌癥診斷和治療的關鍵。由于腫瘤組織是不同細胞的混合體，因此傳統測序通常難以對癌癥患者的腫瘤組織進行異質性分析。單細胞測序使基因表達譜在細胞水平上得以實現，是研究結直腸癌異質性的重要手段，能夠為結直腸癌的防治提供新的思路。

2.1 結直腸癌分型 單細胞測序技術能通過鑒定單個腫瘤細胞中的基因組改變和特有轉錄組水平來研究腫瘤異質性，因此單細胞測序技術可以通過檢測結直腸癌中的基因表達水平，對結直腸癌進行分型。Dai 等［14］對1 例Ⅲ期結直腸癌患者癌組織中的2 824個細胞進行分析，并通過單細胞轉錄組測序將其聚類為5 個不同的簇，發現每個簇的基因具有不同的功能且富集到不同的基因本體術語中，各個簇之間表現出明顯的異質性，即每個簇能代表一種結直腸癌的分子類型。Zhang 等［3］通過單細胞轉錄組測序檢測來自結直腸癌患者的肝轉移癌組織和癌旁正常組織，共鑒定出6種細胞類型的12個簇，包括癌細胞、T 細胞、髓樣細胞、內皮細胞、成纖維細胞和B細胞。Li等［15］對來自11例結直腸癌患者的969個原發腫瘤細胞和7 例癌旁正常黏膜的622 個細胞進行單細胞轉錄組測序，參考成分分析（RCA），獲得了7個不同的細胞簇，分別為上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞、B 細胞、T 細胞、肥大細胞和髓樣細胞。此外，通過單細胞轉錄組測序得到的差異表達基因和通過批量分析鑒定得到的差異表達基因一致，但在單細胞測序中鑒定出的一些差異表達基因在批量分析中未被檢測到，表明單細胞測序技術能更全面地檢測患者的基因表達情況，進而在分子基礎上對患者進行分型。因此，通過對腫瘤單細胞轉錄本進行研究，可以進一步完善現有的結直腸癌分類系統，有助于提出新的結直腸癌分子分型模型。

2.2 循環腫瘤細胞分析 循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）是在癌癥患者的血液中發現的腫瘤細胞，該細胞具有完整的核，表達細胞角蛋白，但不表達CD45（白細胞標記，可以作為CTC 篩選的分子標記）。研究表明，CTC 不僅與臨床病理特征相關，還具有預測預后的價值［16］。用于CTC分析的結直腸癌患者血液來源包括腸系膜、門靜脈或外周靜脈血。隨著單細胞測序技術的發展，結直腸癌患者的CTC可進行基因組和轉錄組水平上的多角度基因表達分析。例如，比較基因組雜交技術可以在單個CTC 中分析 DNA 拷貝數的變異［17］。CTC 的單細胞轉錄組分析，在將RNA 反轉錄為cDNA 后，需要進行擴增，然后使用微陣列或下一代測序進行基因表達分析［16］。Wang 等［17］開發了新的單細胞測序平臺ChimeraX?-i120，利用該平臺檢測CTC 具有高靈敏度、準確性和可重復性的優勢，在結直腸癌中，CTC陽性檢出率超過60%，而在健康人血液中很少發現CTC。在 Heitzer 等［18］研究中，從 6 例晚期結直腸癌患者的血液樣本中分離出了CTC，并將原發腫瘤的基因組圖譜與每例患者的肝轉移和CTC圖譜進行比較，發現在CTC 與原發灶和肝轉移灶間，一些基因，特別是已知的結直腸癌驅動基因（如KRAS、APC、PIK3CA）的拷貝數變化具有相似之處。通過對原發灶和相應的肝轉移組織進行深度測序發現，CTC 中的特有突變在原發和轉移組織中也存在亞克隆水平突變。這些研究表明了分離和表征CTC 的重要性，因其攜帶了癌癥患者疾病發展過程中形成的突變，可以作為液體活檢來監測治療反應，也有助于患者的個體化治療。然而，CTC 不一定攜帶與原發腫瘤相同的突變，這種不一致性可能是結直腸癌患者對化療反應存在差異的原因。隨著研究的發展，未來CTC將可能用于推進結直腸癌的個性化治療以及復發監測。

2.3 結直腸癌轉移中的研究 結直腸癌的高轉移率是導致患者死亡的重要原因［19］,但目前已批準用于治療轉移性結直腸癌的靶向治療方法不多，且已知的靶向藥物對于BRAF 和PIK3CA 等基因的突變療效甚微［20］。選擇何種技術對轉移性結直腸癌的復雜特性進行研究成為開發新的診斷標志物和藥物治療靶點的關鍵［21］。與傳統轉錄組測序相比，單細胞轉錄組測序能夠根據細胞類型提供特異的診斷和預后標志物以及個體化抗癌藥物的治療靶點。Bian等［22］在2018 年建立了單細胞三體組測序（scTrioseq）技術，該技術能夠從單個細胞層面同時檢查突變、轉錄和甲基化；該研究對來自10 例結直腸癌患者（Ⅲ或Ⅳ期）的原發腫瘤和轉移瘤進行了scTrioseq測序，為研究腫瘤進化與基因譜系相關的表觀改變提供了新的方法，并證實了在譜系中DNA甲基化水平表現出一致的上調或下調，而在各個譜系之間DNA甲基化的上下調趨勢可能存在較大差異。Ono等［23］對來自小鼠結直腸癌模型中的200個腫瘤細胞進行單細胞外顯子組和轉錄組測序，以鑒定腫瘤異質性，并研究了單個細胞如何產生腫瘤異質性；該研究從體外培養的類器官中分離單個結直腸癌細胞，移植到小鼠體內，成瘤后行單細胞測序，發現由于出現新的轉錄亞群，腫瘤細胞轉錄組的異質性有所升高，這些亞群抑制了間充質標記基因的表達，說明新的細胞亞群具有上皮間質轉化特性；同時研究還發現，在具有類似表達特征的人類患者中，結直腸癌有顯著的轉移趨勢，揭示了結直腸癌轉移時腫瘤細胞上皮間充質轉化的轉化機制。Leung 等［24］利用單細胞DNA 測序技術發現在轉移性結直腸癌患者中存在二次轉移現象，說明腫瘤轉移灶仍然處于不穩定狀態。王智鋒［25］利用單細胞測序檢測結直腸癌原發灶和轉移灶的突變情況，發現SMAD4基因的突變是驅動腫瘤轉移的關鍵基因；此外，這項研究還發現結直腸癌轉移灶中存在與細胞有絲分裂檢查點調控相關基因DLG2的突變，說明轉移的腫瘤細胞仍然保留侵襲能力。因此，利用單細胞測序技術鑒定結直腸癌轉移過程中關鍵的分子特征具有重要的研究價值。

2.4 結直腸癌化療耐藥性機制探索 化療耐藥性是影響結直腸癌患者預后的重要因素，化療耐藥細胞的形成通常歸因于治療前后腫瘤中罕見的耐藥性克隆［26］。這些具有耐藥性的結直腸癌細胞能夠破壞藥物轉運，使細胞調節過程失調，通過遺傳或表觀遺傳修飾改變患者的藥物敏感性和治療靶點［27］。根據基因表達、表觀遺傳學、通路特征和治療反應來研究化療耐藥性癌細胞，已成為當前的研究熱點［27-28］。

常規轉錄組研究可以挖掘化療耐藥有關的基因表達特征，但得到的結果只能體現組織水平的平均情況，忽略了基因表達的細胞特異性［29］。單細胞轉錄組分析能夠研究單個細胞的轉錄組，更適合于細胞特異性精確治療。Chen 等［30］研究證實了單細胞RNA測序能夠表征類器官中4種不同類型的細胞亞型的耐藥能力，包括奧沙利鉑治療后的藥物誘導組、藥物不敏感組、藥物敏感組和藥物超敏感組；單細胞測序結果顯示，對腫瘤類器官進行藥物治療會引起不同亞型間的差異反應，藥物不敏感組細胞占所有4 組細胞的百分比在藥物治療后有所增加，而藥物敏感組治療后細胞百分比降低；對這些亞型進行差異表達基因及通路富集分析，進而通過聚類對結直腸癌進行詳細分類，能夠更好地為可能或已經表現出化療耐藥性的結直腸癌患者選擇治療方案。由此可見，單細胞RNA測序有望用于預測抗腫瘤藥物的有效性，進而指導用藥，甚至用于預防化療耐藥。

2.5 腫瘤微環境與免疫治療 腫瘤微環境由多種類型細胞組成，包括免疫細胞、炎性細胞、脂肪細胞、成纖維細胞和血管內皮細胞，以及腫瘤內部和周圍的非細胞成分。腫瘤微環境中的細胞成分已經成為腫瘤進展、器官特異性轉移和治療反應的關鍵調節劑，其中腫瘤浸潤免疫細胞是免疫治療的關鍵［31］。由于腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）可直接影響預后和對免疫治療的反應而受到極大關注［32］。多項研究表明，通過免疫評分策略，TIL 的類型、位置和豐度可用于預測結直腸癌患者的總體生存期和無進展生存期［33］。在原發性人類腫瘤中基于單細胞測序的轉錄組分析不僅揭示了T 細胞異質性，而且通過整合轉錄組和T 細胞受體的分析闡明了T 細胞群之間的動態關系，為預測免疫治療療效和患者預后提供了證據［34］。Zacharakis 等［35］對 1 例晚期乳腺癌患者的腫瘤細胞的全基因組進行測序，從腫瘤細胞里尋找能夠識別突變基因及其表達蛋白的TILs，經過篩選，將能夠有效識別4 種突變的TIL 進行體外擴增后回輸到患者體內，聯合標準免疫治療方案，取得了良好的療效，患者在治療22 個月后腫瘤組織全部清除。由此可見，腫瘤微環境的研究能夠為腫瘤患者提供一種有效的治療手段。單細胞測序技術的應用對于復雜的腫瘤微環境研究具有重要作用。Zhang 等［32］通過單細胞測序技術獲得了11 138 個單個T 細胞的轉錄組，開發了STARTRAC（single T cell analysis by RNA sequencing and TCR tracking）的生物信息學分析方法，定量分析具有不同功能和克隆性的20 個T 細胞亞群之間的動態關系，進而利用該方法對12例結直腸癌患者的癌組織、癌旁組織以及外周血中的20類不同類型T 細胞進行追蹤，揭示了T 細胞的組織分布特性、克隆增生、遷移和狀態轉化關系，發現了結直腸癌獨特的TIL 細胞。研究發現除腫瘤微環境外，TCR 也會影響腫瘤浸潤CD8+效應記憶T 細胞向“耗竭性T 細胞”和效應T 細胞的轉化［32］，這是目前國際上對結直腸癌腫瘤微環境中單個T細胞規模最全面深入的研究。通過對原發性結直腸癌和對應的正常結直腸黏膜組織細胞進行單細胞轉錄組測序，Li等［36］開發了RCA算法，鑒定了兩種不同的結直腸癌相關成纖維細胞亞型，發現通過傳統轉錄組學測序分為同一亞型的患者具有不同的生存率，大大提高了這種算法在預測預后中的價值。de Vries 等［37］分別在結直腸癌組織、腫瘤相關淋巴結、正常黏膜組織和結直腸癌患者外周血樣本中，通過應用流式細胞術在單細胞水平檢測36種免疫標記物的表達，揭示了各種免疫細胞在不同樣本中的分布情況。Zhang 等［34］使用 Smart-seq2 和 10×Genomics 兩種單細胞測序方法分析人類原發性結直腸癌的免疫和基質細胞群，揭示了結直腸癌內髓系T 細胞和髓系間質的聯系，為進一步探索腫瘤浸潤性免疫細胞提供了一種新的思路。除免疫T 細胞外，結直腸癌中B細胞特征的研究也能為結直腸癌腫瘤微環境中的免疫生態系統提供新見解。由于胃腸黏膜的免疫系統長期暴露于食物性抗原和細菌中，胃腸黏膜抗原驅動的免疫保護主要歸因于產生抗體的B細胞和漿細胞。Wang 等［38］通過對結直腸癌原發腫瘤和鄰近正常黏膜組織的約6 000 個免疫細胞進行全長Smartseq2 分析發現，IgA+免疫球蛋白Lambda 恒定區2+（IGLC2+）漿細胞與結直腸癌預后不良有關，而以往研究忽視了分化為IgA+IGLC2+漿細胞的B 細胞亞型在癌組織和非癌組織中的異質性，導致不同結直腸癌中 B 細胞的研究結果存在差異。Zhou 等［39］對 21例微衛星穩定結直腸癌患者和6例無癌老年人進行了單細胞多組學測序，發現在腫瘤微環境和正常組織中的免疫細胞、成纖維細胞和內皮細胞中普遍存在體細胞拷貝數改變（SCNA），腫瘤中SCNA 的成纖維細胞比例遠高于鄰近正常組織的比例（11.1%～47.7%vs.1.1%～10.6%）。此外，研究鑒定出5 個基因：BGN、RCN3、TAGLN、MYL9和TPM2，其作為成纖維細胞特異性的生物標志物，如表達上調預示預后較差。這些研究表明，未來單細胞測序技術能夠在探索免疫細胞多樣性、研究免疫治療機制中發揮重要作用。

3 展望

單細胞測序技術在細胞水平探索結直腸癌的發生發展機制，將成為今后研究的熱點。在基礎研究方面，單細胞測序技術能夠揭示結直腸癌發生發展過程中不同類型細胞的突變、表達、表觀水平的變化，進一步闡明結直腸癌形成的分子機制。在臨床研究方面，運用單細胞測序技術篩選和驗證大量腫瘤異質性相關的變異，既可以發現新的藥物靶點，又可以開發出針對個體化藥物敏感性的預測性生物標志物，為開發精準和個性化的癌癥治療方法提供關鍵信息。盡管目前單細胞測序技術仍處于發展階段，有關結直腸癌單細胞測序方面的公開研究較少，但隨著大規模基礎和臨床研究的逐漸深入，單細胞測序技術會對癌癥患者的治療產生深遠的影響。