早發性冠心病的基因學研究進展

蘇 雅， 姚 康， 葛均波

復旦大學附屬中山醫院心內科，上海 200032

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)已成為人類第一大死因[1]。目前，冠心病的部分發病危險因素已明確，包括吸煙、肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常、冠心病家族史、年齡及性別等。臨床發現，冠心病家族史可顯著增加個體患冠心病的概率[1]，這提示冠心病發病可能與遺傳因素有關。在家系及雙胞胎研究[2]中，冠心病的遺傳率為40%～60%。

遺傳因素對冠心病發病的影響在年輕患者中更加顯著，這表明基因變異在早發性冠心病(premature coronary artery disease，PCAD；男性在55歲以前、女性在65歲以前發生冠心病[3])的發病機制中占有重要地位[2]。罕見突變及常見突變都能通過影響脂質代謝、血栓形成、血管內皮再生及修復等不同代謝通路導致PCAD。本文將綜述PCAD發病機制中基因學研究成果及最新進展，并探討其在中國人群中的適用性。

1 符合孟德爾遺傳規律的PCAD

1.1 PCAD與脂質代謝通路異常 在冠心病的基因學研究中，對脂質代謝通路相關基因的罕見突變研究最為充分。低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)相關基因與PCAD關系最為密切；此外，部分高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)單基因突變的罕見疾病也會導致PCAD[4]。

1.1.1 LDLR、載脂蛋白B(APOB)、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶kexin-9(PCSK9)、低密度脂蛋白受體銜接蛋白1(LDLRAP1)與家族性高膽固醇血癥 家族性高膽固醇血癥通常被認為是一種常染色體顯性遺傳病[5]。以血漿高水平低密度脂蛋白膽固醇(LDL-cholesterol, LDL-C)為特征，患者易患PCAD、早發腦血管病及外周血管病。其發病機制與LDL顆粒由受體介導的攝取功能障礙有關。該通路的功能障礙可由編碼以下4個蛋白的基因罕見突變引起[6]。(1)LDLR: 超過90%的分子診斷病例中[7]，家族性高膽固醇血癥由編碼低密度脂蛋白受體(LDLR)的基因突變引起。目前該基因共有1 700個突變被描述。LDLR基因突變導致肝細胞表面的LDLR缺失或失活，肝細胞攝取LDL-C減少，從而使血漿LDL-C水平升高[5-6]。(2)APOB: 約5%的分子診斷家族性高膽固醇血癥病例中，致病突變位于編碼APOB的基因[8]。攜帶APOB突變的患者LDL顆粒與LDLR結合障礙導致循環LDL-C濃度升高。(3)PCSK9: 2003年編碼PCSK9基因的獲得性功能突變被確認是家族性高脂血癥的另一個致病原因[9]。突變的PCSK9在與LDLR形成復合物時，可干擾LDLR的回收，由此導致LDLR降解，從而減少肝細胞表面可與循環中的LDL顆粒結合的受體數量。(4)LDLRAP1: 在家族性高脂血癥中，一種罕見的常染色體隱性遺傳亞型，LDLRAP1基因在1p36.11位點的純合和復合雜合突變產生。LDLRAP1在LDL的內化過程中通過內吞作用與LDL受體相互作用。當該過程存在缺陷時，導致LDL分解代謝缺陷和血漿LDL-C水平升高，產生高膽固醇血癥表型[10]。

由于LDL清除途徑受損，LDL顆粒積聚在血管壁，導致炎癥反應，從而使內皮組織損傷、動脈粥樣硬化斑塊形成[11]。這一過程開始于患者年輕時，Jongh等[12]的研究表明，在9～18歲的無臨床癥狀雜合型家族性高脂血癥患者中，血管內皮功能已明顯受損。因此該病患者易發生PCAD。有研究[13]表明，在前他汀時代，家族性高膽固醇血癥患者在20～39歲死于冠心病的概率是普通人群的100倍。

1.1.2 載脂蛋白E(APOE)與家族性高脂血癥Ⅲ型(FHⅢ) FHⅢ是一種常染色體隱性遺傳病。其典型特征包括血漿高中間密度脂蛋白血癥、掌部微黃色斑塊、富膽固醇的炎性黃色瘤。該病患者易發生PCAD及周期性胰腺炎[14]。

APOE基因突變是導致家族性高脂血癥Ⅲ型的病因[14]。APOE是肝細胞上LDL受體的配體，負責攝取乳糜微粒(chylomicrons，CM)、中間密度脂蛋白(intermediate density lipoproteins，IDL)和極低密度脂蛋白(very low-density lipoproteins，VLDL)顆粒。APOE是一種多形態的蛋白質，主要有3個亞型——E2、E3、E4。其中E3是野生型，而E2和E4則與疾病相關[14]。FHⅢ患者主要是APOE2亞型純合子。在FHⅢ患者中，APOE基因突變導致上述脂蛋白顆粒的分解代謝延遲，同時增加血漿中的膽固醇和三酰甘油(triacylglycerol, TG)，導致一系列臨床癥狀發生[14]。

1.1.3 載脂蛋白A-Ⅰ(APOA-Ⅰ)與APOA-Ⅰ缺乏性低脂蛋白A血癥 APOA-Ⅰ是HDL顆粒的主要蛋白質成分。編碼該蛋白的基因僅在肝臟和小腸中表達。在血漿中分泌后，APOA-Ⅰ通過ABCA1介導的游離膽固醇和磷脂從外周血細胞中排出并脂化。這種脂化作用可促進新生圓盤狀HDL顆粒形成[15]。APOA-Ⅰ基因突變導致的APOA-Ⅰ缺乏是家族性低脂蛋白A血癥的發病基礎之一[16]。

大量前瞻性流行病學研究[17]證實，APOA-Ⅰ水平是冠心病發病風險的有力預測因素。然而，APOA-Ⅰ缺陷攜帶者對冠心病的易感性卻有顯著差異性。Yokota等[18]、Pisciotta等[19]、Ikewaki等[20]共報道25例APOA-Ⅰ完全缺乏患者，雖然所有病例血漿HDL-C水平均顯著降低，但只有11例患者表現出PCAD。而在另外一項以頸動脈內膜中層厚度(intima-media thickness, IMT)為測量指標的研究[21]中，APOA-Ⅰ缺乏患者則表現出與PCAD的高相關性。在Hovingh等[21]的研究中，測量33例APOA-Ⅰ(L178P)突變攜帶者及40例家庭對照組的IMT結果發現，與對照組相比，攜帶者的動脈壁厚度進展明顯增加。值得注意的是，該研究指出APOA-Ⅰ(L178P)缺陷攜帶者的動脈粥樣硬化進展速度與家族性高膽固醇血癥患者沒有區別。這提示導致HDL代謝障礙的單基因疾病可能具有與LDL代謝缺陷相似的致心血管損害作用。

1.1.4 APOA-Ⅴ與APOA-Ⅴ缺乏性高三酰甘油血癥 全基因組關聯研究一致確認APOA-Ⅴ是血漿三酰甘油(TG)水平的一個調節因素[22]。APOA5基因位點的單核苷酸多態性與血漿TG升高相關。

APOA-Ⅴ是一種較小的血漿載脂蛋白，已被證實在TG代謝中通過增強VLDL脂解和清除發揮重要作用[22]。升高的TG與心血管疾病的風險增加密切相關。有研究[23]表明，APOA-Ⅴ基因罕見非同義突變的攜帶者發生早發性心肌梗死的風險是普通人群的2.2倍。

1.1.5 ABCG5,ABCG8與谷固醇血癥 谷固醇血癥是一種罕見的兒童常染色體隱性遺傳疾病，其特點是血漿植物甾醇水平顯著升高(30倍)[24-26]。導致谷固醇血癥的分子缺陷由編碼轉運蛋白ABCG5和ABCG8的2個基因突變引起。

谷固醇血癥患者的心血管疾病可出現在0～20歲，但通常要推遲到中年。與純合子家族性高膽固醇血癥患者相似，谷固醇血癥患者同樣可出現主動脈狹窄、溶血及血小板減少癥[27]。

1.1.6 三磷酸腺苷結合盒轉運子A1(ABCA1)與丹吉爾病 丹吉爾病在家族性HDL缺乏疾病中最為嚴重[28]。患者體內膽固醇酯類物質可在全身多器官系統堆積，如扁桃體、周圍神經、腸黏膜、肝、脾、骨髓、淋巴結、胸腺、皮膚、角膜等，引起多器官系統病變。自該病發現至今，在全球確診的100多例患者中，約30%伴隨早發性心肌梗死[28-29]。

丹吉爾病是由ABCA1基因突變引起的常染色體隱性遺傳病[28, 30]。ABCA1基因編碼的轉運體在膽固醇逆向轉運的第1步中起關鍵作用。ABCA1的缺乏削弱了自由膽固醇從外周細胞中的排出，導致膽固醇酯在細胞中積累，從而引起血漿中HDL及總膽固醇水平降低及多器官系統的膽固醇積累[31-32]。

多項研究[21]表明，血漿高APOA-Ⅰ及HDL水平是人類動脈粥樣硬化的保護因素，流行病學資料也表明APOA-Ⅰ水平是冠心病強有力的預測因素之一。除了調節膽固醇外排功能，HDL還能通過調節炎癥反應、抗氧化及調節血管舒縮功能實現對心臟血管的保護[33]。此外，HDL還可減緩LDL的氧化，從而預防動脈粥樣硬化[34]。當血漿中HDL及APOA-Ⅰ水平下降時，LDL氧化增加，動脈粥樣硬化進程加快，導致丹吉爾病患者中PCAD患病率高達30%，明顯高于普通人群。

1.1.7 PCAD與先天性高同型半胱氨酸血癥(HHcy) 同型半胱氨酸是蛋氨酸和半胱氨酸正常生物合成的中間產物[35]。多種原因可導致HHcy，如飲食中缺乏葉酸、維生素B6和維生素B12，參與同型半胱氨酸代謝的酶的基因缺陷等[36]。其中，飲食等環境因素及參與同型半胱氨酸代謝的5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶的常見突變往往導致輕至中度HHcy[36-37]。而某些酶的罕見基因突變則會導致重度HHcy(血同型半胱氨酸大于100 μmol/L)，即先天性HHcy。這些罕見突變包括胱硫醚-β-合酶(CβS)的純合突變、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)的純合突變、甲硫氨酸合酶突變及某些維生素B12代謝基因的紊亂[37]。

研究[38]表明，HHcy與心肌梗死和腦卒中存在顯著相關性。其中，MTHER純合突變的先天性HHcy患者常患PCAD[35]。然而，一項大型薈萃分析[35]顯示，MTHFR突變與冠心病發病率升高的相關性僅在中東和日本被證實，在其他地區兩者則無顯著相關性。但更多研究[39]證實，HHcy與冠心病存在確切聯系。據目前已有研究[40]，HHcy患者患冠心病風險增加主要是由于同型半胱氨酸導致血管內皮順應性改變及血小板聚集，從而導致血管內皮功能障礙，促發動脈粥樣硬化。此外，還能通過增加HMG-CoA還原酶的活性促進膽固醇合成[40]，并通過血管平滑肌細胞刺激產生C-反應蛋白，啟動血管內皮炎癥反應[41]。

總之，雖然大多數研究表明HHcy與PCAD存在聯系，但似乎還有其他證據阻止將其作為冠心病的生物標志物[39]。家族性HHcy與PCAD是否存在確切關系還需要進一步研究。

2 多基因發病的PCAD

冠心病是一種典型的由遺傳和環境因素共同決定發病的復雜疾病。雖然有小部分冠心病是由單基因罕見突變引起，但這部分罕見突變在冠心病的發病機制中僅占2%[2,42]。具體到PCAD，盡管遺傳因素在發病機制中占更重要的地位[2]，但有研究[43]證明，在臨床診斷早發性心肌梗死的人群中不具備罕見突變的病例是具有罕見突變病例的10倍。另外，在臨床診斷家族性高膽固醇血癥患者中，也有20%左右并沒有經典的LDLR、APOB、PCSK9突變[44]。這說明，在PCAD的發病機制中，具有較小效應的常見突變的積累仍是主要遺傳模式。

2.1 PCAD與常見變異關聯研究(CVAS) 常見CVAS也稱為全基因組關聯研究(genome-wide association studies，GWASs)，采用包含100萬個由單核苷酸多態性(single-nucleotide polymorphisms，SNPs)DNA標記芯片的高通量DNA微陣列技術[2]。

到目前為止，大型CVAS[1,45]共識別超過150個與冠心病有關的基因座，由這些基因識別的冠心病危險因素包括LDC-L、富含TG的脂蛋白、胰島素抵抗、血栓形成、炎癥、細胞黏附/跨內皮遷移、血管重構、血管張力等。例如，通過CVAS[46]發現凝血酶原G20210A(rs1799963)多態性與早發性心肌梗死存在關聯。凝血酶原(又稱凝血因子Ⅱ)是凝血酶的前體，是一種起促凝作用的關鍵酶，通過促進血小板活化和纖維蛋白及Ⅴa、Ⅷa、ⅩⅢ等因子生成發揮作用[46]。凝血酶原基因內的G20210A多態性(rs1799963)與凝血酶原的較高循環水平相關，因此增加發生心肌梗死的可能性。一項meta分析研究[47]表明，該基因多態性增加心肌梗死的風險與年齡有關，在年齡小于55歲的人群中發現更顯著的相關性。Butt等[48]研究發現，50歲以上的凝血酶原G20210A攜帶者發生心肌梗死的風險沒有升高，而50歲以下的攜帶者發生心肌梗死的風險是年齡匹配的非攜帶者對照組的5.6倍。但需要注意的是，只在高加索人種中發現G20210A (rs1799963)多態性與早發心肌梗死有關[47]。

當進行CVAS時，由于識別的SNPs絕大多數位于染色體非編碼區，因此具有這些使患病風險升高SNPs的人群往往缺乏可檢測的生物學標志[1]。為了對這部分人群進行風險分層，發明全基因組多基因評分(genome-wide polygenic score，GPS)[49]。GPS為根據個體效應大小進行加權的風險等位基因數量計算的評分[2]。一項基于英國Biobank的冠心病GPS研究[49]認為，家族性高膽固醇血癥患者患冠心病風險是普通人群的3倍，而通過GPS同樣能識別患冠心病風險是普通人群3倍的潛在患者。更引人注目的是，通過GPS發現的高風險人群數量是相同風險人群的20倍[50-51]。

冠心病GPS的優勢在于，可從出生時開始評估，早于其他風險因素的鑒別能力[49]。有研究[52-54]表明，冠心病的高多基因風險可能被2種干預措施，即堅持健康的生活方式或使用他汀類藥物進行降膽固醇治療之一抵消。GPS的這些特性可為公共衛生領域制定冠心病的一級預防策略提供幫助。然而，創建準確預測冠心病風險的GPS需要依托大型原始CVAS，還需要精確的算法及建立足夠大的數據庫以檢驗其準確性[49]。這對國家衛生系統而言是不小的挑戰，因此還需要較長時間才能真正將GPS常規運用到醫療中。

2.2 PCAD與基因調控網絡(GRN) 盡管現在CVAS研究如火如荼，但通過現有研究發現的SNPs依然只能解釋冠心病20%左右的遺傳效應[2]。關于缺失的80%，有如下幾種可能的解釋：(1)這種缺失的遺傳性可能是由于基因環境的相互作用[55]，其中一個特定遺傳變異的影響只在一個特定影響因素的存在下表現出來，如肥胖或吸煙[2]；(2)可能許多更常見的變異與冠心病有關，但由于效應量小或等位基因頻率低及樣本量不足，在CVAS中沒有統計學意義[2]；(3)CVAS研究只檢查SNPs，忽略了許多其他形式的基因組變異，如缺失、插入、反轉、復制、拷貝數變異、印記表觀遺傳學等，并且缺乏評估罕見變異的統計學方法[56]。

鑒于目前的罕見變異研究與常見變異研究成果仍不能充分解釋PCAD的遺傳性，GRN被提出[57]。GRN這一概念興起于高維組學技術的發展[58]。通過測量海量全基因組生物學參數，包括DNA變異和表觀遺傳修飾、RNA和蛋白質濃度及各種代謝物等，并將這些多維網狀數據用大型計算機和復雜的算法加以處理，從中識別患病個體發病機制中的關鍵驅動因素[58]。這一技術的進展為理解多基因復雜疾病的遺傳背景提供了新的思路。

具體到冠心病的遺傳背景研究，運用組學的方法引進了基因遺傳表達研究。這種研究可看作是CVAS的延伸，其特點是在中間層中引入RNA表達，捕獲遺傳變異和環境擾動對疾病表型的影響。這種互補的、數據驅動的方法不僅可識別疾病基因，還可識別以GRN形式存在的冠心病致病相關通路[57]。例如，一項基于斯德哥爾摩動脈粥樣硬化基因網絡研究[59]的冠心病基因遺傳表達研究識別了28個獨立的、在心血管疾病中活躍的GRN。這些網絡中的遺傳變異對冠心病遺傳性的貢獻率為10%，高于由CVAS識別的風險基因座[57]。然而，目前并未將組學方法運用至PCAD的遺傳背景研究中。這意味著PCAD的遺傳背景尚有很大的探索空間。

綜上所述，雖然PCAD的遺傳背景研究已取得許多重大成果，但現有成果基于的研究對象絕大部分是高加索人群。在2009年，只有約4%的全基因組基因分型樣本來自非歐洲人群；2014年，這一比例上升至19%[60]。我國目前并沒有多中心、大樣本的PCAD遺傳背景研究項目成果發表。盡管大多數在歐洲人身上發現的與疾病相關的CVAs位點已在東亞人群中被復制[2, 61]，但盡早開展大規模中國人群PCAD遺傳背景研究依然具有重要意義，確認基于高加索人群的研究成果能否完全適用于中國人，甚至尋找到中國人特有的致病基因位點，對我國PCAD患者的預防和治療均有重要意義。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。