膿毒癥并發(fā)急性腎損傷患兒的血清miR-182-5p、miR-21-3p表達(dá)變化及其臨床意義

郭艷梅，李君娥，孫慧，霍習(xí)敏，徐梅先，王曉冬

河北省兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)內(nèi)科，石家莊050031

膿毒癥是感染導(dǎo)致的的全身炎癥反應(yīng)綜合征。全球每年有120 萬(wàn)例膿毒癥患兒，病死率4%～50%，是導(dǎo)致全球兒童病死的主要原因［1］。急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是膿毒癥常見(jiàn)且最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，在重癥患者中有較高的發(fā)病率與病死率。早期診斷AKI并及時(shí)對(duì)癥治療對(duì)改善膿毒癥患兒的預(yù)后具有重要意義［2］。目前臨床主要通過(guò)血清腎損傷分子（kidney injury molecule，KIM-1）、胱抑素C（cystatin C，Cys-C）、血肌酐（serum creatinine，Scr）的變化預(yù)測(cè)早期腎損傷，但以上指標(biāo)對(duì)早期腎功能損傷的預(yù)測(cè)敏感度較低，常延誤患兒的早期治療。因此，尋找一種更加準(zhǔn)確的早期腎功能損傷的預(yù)測(cè)指標(biāo)是目前的研究熱點(diǎn)。微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，調(diào)控細(xì)胞的多種生物學(xué)功能。miRNAs 在腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［3］。miR-182-5p［4］與miR-21-3p［5］參與了AKI發(fā)生、發(fā)展，可為早期AKI的診斷提供新思路。但miR-182-5p、miR-21-3p 在膿毒癥并發(fā)AKI中的診斷價(jià)值相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究觀察膿毒癥患兒血清miR-182-5p、miR-21-3p的表達(dá)變化，分析血清血清miR-182-5p、miR-21-3p 表達(dá)對(duì)膿毒癥并發(fā)AKI 的預(yù)測(cè)價(jià)值?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取河北省兒童醫(yī)院2017 年5月－2020 年9 日收治的膿毒癥患兒113 例，其中男76例，女37例；年齡2～10歲，中位6歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）13～17 kg/m2，中位17 kg/m2。根據(jù)是否并發(fā)AKI 分為AKI 組89 例和NAKI 組24 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合膿毒癥《兒童膿毒性休克（感染性休克）診治專家共識(shí)（2015 版）》［6］診斷標(biāo)準(zhǔn)；②AKI 符合《KDIGO 急性腎損傷臨床實(shí)踐指南（2012）》［7］診斷標(biāo)準(zhǔn)；③患兒家屬或監(jiān)護(hù)人知情研究；④臨床資料完整者；⑤近期未使用腎毒性藥物、接受腎臟手術(shù)、造影劑檢查者；排除標(biāo)準(zhǔn)：①自身免疫性疾病者；②慢性肝病者；③血液系統(tǒng)疾病者；④惡性腫瘤者；⑤長(zhǎng)期使用免疫抑制劑、激素者；⑥腎炎、尿道梗阻等非膿毒癥引起的腎臟損傷者；⑦既往腎臟疾病者。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，納入者家屬均簽署知情同意書。

1.2 膿毒癥患兒血清腎功能指標(biāo)、miR-182-5p及miR-21-3p檢測(cè) 采集患兒入院后次日6 mL清晨空腹靜脈血，3 000 r/min離心10 min，半徑80 cm，分離血清，分為兩份，置于-80 ℃冰箱中待檢。其中1份采用ELISA 法檢測(cè)血清腎功能指標(biāo)腎損傷分子-1（KIM-1）、胱抑素C（Cys-C）、肌酐（Scr），試劑盒由上海百蕊生物技術(shù)有限公司提供，所有操作均嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書進(jìn)行。另一份采用實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)血清miR-182-5p、miR-21-3p，采用TRIzol 試劑盒（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；規(guī)格100 mL）提取血清總RNA，TakaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海臻諾生物科技有限公司；規(guī)格為20 μL/100 次）轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入miR-182-5p、miR-21-3p 引物序列。miR-182-5p上游引物5′-ACTACTTCGACTGAGACACG-3′，下游引物5′-GTCTGCATGCTGTCCTTG-3′；miR-21-3p 上游引物5′-ACTCCTACGACTTAGACATG-3′，下游引物5′-GACTGTATGCTGTCGTAG-3′；以U6 為內(nèi)參，上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-182-5p 反應(yīng)條件：95 ℃10 min（1個(gè)循環(huán)）、95 ℃15 s、63 ℃60 s、72 ℃15 s（40 個(gè)循環(huán)），以U6 做內(nèi)參校正，反應(yīng)結(jié)束后得到各反應(yīng)管Ct，以2-ΔΔCt代表血清miR-182-5p、miR-21-3p 的相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)3次，取平均值。

1.3 資料收集及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 收集納入兩組患兒的一般資料，包括性別、年齡、感染部位、呼吸頻率、24 小時(shí)尿量、體溫、心率、急性生理和慢性健康評(píng)估Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation，APACHE Ⅱ，分值0～71分，得分越高說(shuō)明病情越嚴(yán)重）、膿毒癥相關(guān)的序貫器官衰竭評(píng)估（sepsis-related organ failure assessment，SOFA，分值0～44分，得分越高說(shuō)明病情越嚴(yán)重）。

采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料以%表示，組間比較用χ2或Fisher檢驗(yàn)；正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；采用Pearson/Spearman相關(guān)性分析法分析血清miR-182-5p、miR-21-3p表達(dá)與膿毒癥患兒血清KIM-1、Cys-C、Scr水平的相關(guān)性；采用多因素Logistics 回歸法分析膿毒癥患兒并發(fā)AKI 的影響因素；繪制受試者工作特征曲線（ROC）分析血清miR-182-5p、miR-21-3p 表達(dá)對(duì)膿毒癥患兒并發(fā)AKI的預(yù)測(cè)價(jià)值，采用Hanley&McNeil法檢驗(yàn)曲線下面積（area under curve，AUC）。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒血清miR-182-5p、miR-21-3p 相對(duì)表達(dá)量及腎功能指標(biāo)水平比較 AKI、NAKI 組血清miR-182-5p 相對(duì)表達(dá)量分別為1.54（0.98，1.98）、0.35（0.28，0.39），P＜0.05；AKI、NAKI 組血清miR-21-3p 相對(duì)表達(dá)量分別為2.66（1.83，3.28）、0.85（0.75，1.00），P＜0.05。AKI、NAKI組血清KIM-1水平分別為23.32（18.70，26.51）、4.70（4.30，5.04）μg/L，P＜0.05；AKI、NAKI組血清Cys-C水平分別為1.83（1.49，2.47）、0.71（0.53，0.78）mg/L，P＜0.05；AKI、NAKI 組血清Scr 水平分別為440.11（391.28，498.90）、0.35（0.28，0.39），P＜0.05。

2.2 膿毒癥并發(fā)AKI患兒的血清miR-182-5p、miR-21-3p表達(dá)量與血清KIM-1、Cys-C、Scr 水平的相關(guān)性 膿毒癥并發(fā)AKI患兒的血清miR-182-5p表達(dá)量與血清KIM-1、Cys-C、Scr 水平均呈正相關(guān)（r分別為0.431、0.230、0.248；P 均＜0.05）；膿毒癥并發(fā)AKI 患兒的血清miR-21-3p 表達(dá)量與血清KIM-1、Cys-C、Scr 水平均呈正相關(guān)（r分別為0.259、0.373、0.269；P均＜0.05）。

2.3 膿毒癥患兒并發(fā)AKI 的影響因素 AKI 組男61 例、女28 例，年 齡6（5，7）歲；BMI18（16，18）kg/m2；感染部位為肺部42 例、腹部26 例、皮膚和軟組織6 例、尿路2 例、顱內(nèi)4 例及血源性感染9 例；心率（117.72 ± 7.14）次/分；呼吸頻率28（26，30）次/分，體溫38（37，39）℃，24 小時(shí)尿量1.45（1.25，1.64）mg/kg，APACHEⅡ評(píng)分（17.00 ± 4.74）分，SOFA 評(píng)分（5.64 ± 2.74）分。NAKI 組男15 例、女9例，年齡7（5，7）歲；BMI 17（16，19）kg/m2；感染部位為肺部10 例、腹部6 例、皮膚和軟組織2 例、尿路1例、顱內(nèi)1 例及血源性感染4 例；心率（115.33 ±5.51）次/分；呼吸頻率27（24，29）次/分，體溫37.5（36，38）℃，24 小時(shí)尿量1.81（1.66，2.27）mg/kg；APACHE Ⅱ評(píng) 分（12.42 ± 4.14）分，SOFA 評(píng) 分（4.29±2.10）分。AKI組24小時(shí)尿量明顯低于NAKI 組，APACHEⅡ評(píng)分、SOFA 評(píng)分明顯高于NAKI組（P＜0.05）。

以24 小時(shí)尿量、KIM-1、Cys-C、Scr、BUN、APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分、miR-182-5p、miR-21-3p為自變量，是否并發(fā)AKI為因變量（是=1，否=0），多因素Logistics 回歸分析結(jié)果見(jiàn)表1。血清KIM-1、Cys-C、Scr、miR-182-5p、miR-21-3p 為膿毒癥患兒并發(fā)AKI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P均＜0.05）。

表1 膿毒癥患兒并發(fā)AKI影響因素的多因素Logistics回歸分析結(jié)果

2.4 血清miR-182-5p、miR-21-3p 表達(dá)量對(duì)膿毒癥患兒并發(fā)AKI 的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC 曲線結(jié)果顯示，當(dāng)Youden指數(shù)為0.594 時(shí)，血清miR-182-5p 表達(dá)預(yù)測(cè)膿毒癥患兒并發(fā)AKI 的AUC為0.820，敏感度為71.91%、特異度為87.50%；當(dāng)Youden指數(shù)為0.549時(shí)，血清miR-21-3p表達(dá)預(yù)測(cè)膿毒癥患兒并發(fā)AKI的AUC為0.831，敏感度為67.42%、特異度為87.50%。當(dāng)Youden指數(shù)為0.737 時(shí)，血清miR-182-5p聯(lián)合miR-21-3p 預(yù)測(cè)膿毒癥患兒并發(fā)AKI 的AUC為0.922，敏感度為82.02%、特異度為91.67%。miR-182-5p+miR-21-3p 聯(lián)合預(yù)測(cè)膿毒癥患兒并發(fā)AKI的AUC 明顯高于血清miR-182-5p、miR-21-3p單獨(dú)預(yù)測(cè)（Z=3.039、2.864，P=0.002、0.004），敏感度、特異度也高于各指標(biāo)單獨(dú)預(yù)測(cè)。

3 討論

KAI 是膿毒癥發(fā)展過(guò)程中最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其病程進(jìn)展快、病情嚴(yán)重、患兒病死率高，目前已成為兒童重癥監(jiān)護(hù)病室病死的主要原因。雖然近年來(lái)隨著支持治療、腎臟替代治療、改善腎臟灌注、抗炎治療等治療手段不斷提升，但膿毒癥合并KAI 的死亡率仍然很高，因此尋找可早期預(yù)測(cè)膿毒癥患兒并發(fā)KAI 的生物標(biāo)志物尤為重要。研究［2］認(rèn)為，膿毒癥中的炎癥反應(yīng)失衡是導(dǎo)致KAI 的重要機(jī)制，炎癥反應(yīng)可引起腎小管壞死，損傷腎組織，同時(shí)炎性反應(yīng)瀑布還會(huì)導(dǎo)致腎內(nèi)分流，影響腎髓質(zhì)灌注，導(dǎo)致腎臟局部缺血，損傷腎臟功能。miRNAs 是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源非編碼小RNA，長(zhǎng)度僅20 bq 左右，能通過(guò)影響炎癥反應(yīng)和細(xì)胞缺血、缺氧、增殖、分化、代謝、凋亡等生物學(xué)過(guò)程或通路，參與調(diào)控AKI的發(fā)生、發(fā)展［8］。

miR-182 為miR-183 家族成員，高度保守，位于人染色體7q32.2，可結(jié)合RNA 誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物，與靶mRNA完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，使mRNA降解或抑制翻譯。自2003 年miR-182 被首次發(fā)現(xiàn)后，眾多學(xué)者通過(guò)微陣列分析技術(shù)、Northern 印跡法、基因芯片、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)測(cè)定了miR-182表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)其與多種惡性腫瘤相關(guān)［9］。miR-182-5p 由miR-182前體的5’端臂加工而來(lái)。研究［10］表明，腎細(xì)胞癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-182-5p 低表達(dá)，上調(diào)miR-182-5p表達(dá)后，可通過(guò)激活蛋白激酶B/叉頭蛋白O3α抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，提示miR-182-5p與腎臟疾病相關(guān)。WILFLINGSEDER 等［11］通過(guò)全基因組miRNA 和miRNA 分析發(fā)現(xiàn)，miR-182-5p 等20個(gè)miRNAs為移植后AKI的分子調(diào)節(jié)器，隨著AKI期間整體基因表現(xiàn)變化而變化，參與了AKI 發(fā)生和組織修復(fù)過(guò)程，因此推測(cè)miR-182-5p 可能作為AKI 新型生物標(biāo)志物。進(jìn)一步研究［4］又通過(guò)反義寡核苷酸抑制AKI 患者腎臟中miR-182-5p 表達(dá)發(fā)現(xiàn)，抑制腎臟組織中miR-182-5p 的表達(dá)96 h 后患者的腎功能和形態(tài)明顯改善，進(jìn)一步說(shuō)明miR-182-5p 參與了AKI發(fā)生和發(fā)展，可能成為AKI治療新靶點(diǎn)。

miR-21-3p 由miR-21 前體的3’端臂加工而來(lái)，其基因位于人染色體17q23.1，該區(qū)域在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌中常表現(xiàn)為擴(kuò)增，大量證實(shí)上述腫瘤中miR-21-3p 呈高表達(dá)，具有抑癌基因作用［12-13］。HOU 等［12］研究顯示，結(jié)直腸癌組織中miR-21-3p 表達(dá)上調(diào)，抑制miR-21-3p 表達(dá)后能通過(guò)母親DPP 同源物4/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路靶向RNA 結(jié)合蛋白抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和誘導(dǎo)凋亡。ASSMANN 等［14］通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)分析糖尿病腎病患者48 種miRNAs 發(fā)現(xiàn)，有9 個(gè)miRNAs 呈異常表達(dá)，其中miR-21-3p 在重度糖尿病腎病患者中明顯上調(diào)，提示miR-21-3p 參與腎臟疾病。樹(shù)突狀細(xì)胞在腎缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，與AKI 發(fā)生密切相關(guān)。JIA 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，腎缺血再灌注損傷小鼠腎組織中miR-21 表達(dá)缺乏，將miR-21 轉(zhuǎn)移至腎臟后，腎缺血再灌注損傷小鼠腎功能明顯改善，促炎細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)，提示miR-21能誘導(dǎo)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞表型和抗炎反應(yīng)，在AKI中發(fā)揮保護(hù)作用。而miR-21-3p作為miR-21的一條互補(bǔ)miRNA，可能也參與AKI 發(fā)生。后續(xù)學(xué)者研究［16］也證實(shí)，使用馬兜鈴酸Ⅰ誘發(fā)大鼠AKI后，血漿中miR-21-3p 表達(dá)明顯上調(diào)，與血肌氨酸、尿素氮密切相關(guān)，由此說(shuō)明miR-21-3p可能作為AKI的一種潛在生物標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示，AKI 組血清miR-182-5p、miR-21-3p 水平明顯高于NAKI 組，符合上述研究報(bào)道，說(shuō)明miR-182-5p、miR-21-3p 可能參與了膿毒癥患兒并發(fā)AKI 過(guò)程，其表達(dá)升高可能是膿毒癥并發(fā)AKI 患兒的腎細(xì)胞損傷嚴(yán)重，主動(dòng)或被動(dòng)釋放miR-182-5p、miR-21-3p 入 血，導(dǎo) 致 血 清 中miR-182-5p、miR-21-3p 表達(dá)升高。KIM-1 是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，正常腎組織中表達(dá)極低，腎臟損傷后KIM-1 mRNA 可大量表達(dá)，可快速反映近曲小管損傷，是臨床常用AKI 預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。血清KIM-1水平與膿毒癥合并AKI 患者的預(yù)后密切相關(guān)［17］。Cys-C 是一種低分子量蛋白質(zhì)，能自由通過(guò)腎小球，并被腎小管重吸收分解，Scr為人體肌肉代謝產(chǎn)物，由腎臟排泄，血液中Cys-C、Scr 濃度完全取決于腎小球?yàn)V過(guò)率，因此能反映腎小球?yàn)V過(guò)膜通透性情況，可用于早期膿毒癥并發(fā)AKI 預(yù)測(cè)［18-19］。Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清miR-182-5p、miR-21-3p 表達(dá)與膿毒癥并發(fā)AKI 患兒血清KIM-1、Cys-C、Scr 水平均呈正相關(guān)，為膿毒癥患兒并發(fā)AKI獨(dú)立危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步說(shuō)明血清miR-182-5p、miR-21-3p 表達(dá)與AKI的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。目前尚不明確miR-182-5p、miR-21-3p與AKI發(fā)生的機(jī)制，腎小管細(xì)胞死亡為缺血/再灌注腎損傷重要病理因素，鐵死亡與腎臟缺血/再灌注損傷有關(guān)。DING等［20］研究發(fā)現(xiàn)miR-182-5p可能通過(guò)誘導(dǎo)鐵死亡損傷腎臟，參與AKI 發(fā)生。miR-21-3p 則可通過(guò)蛋白激酶B/細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2/叉頭框蛋白O1 通路改變腎管狀上皮細(xì)胞代謝參與AKI 發(fā)生［5］。本研究ROC 結(jié)果中，血清miR-182-5p、miR-21-3p表達(dá)預(yù)測(cè)膿毒癥患兒并發(fā)AKI 的AUC 均大于真區(qū)域，敏感度、特異度分別為為71.91%、87.50% 和67.42%、87.50%，說(shuō)明血清miR-182-5p、miR-21-3p 表達(dá)均對(duì)膿毒癥患兒并發(fā)AKI 具有良好預(yù)測(cè)價(jià)值。進(jìn)一步分析顯示，miR-182-5p+miR-21-3p 聯(lián)合預(yù)測(cè)膿毒癥患兒并發(fā)AKI的AUC、敏感度、特異度均高于血清miR-182-5p、miR-21-3p單獨(dú)預(yù)測(cè)，說(shuō)明聯(lián)合檢測(cè)血清miR-182-5p、miR-21-3p可提升并發(fā)AKI預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，膿毒癥并發(fā)AKI患兒血清miR-182-5p、miR-21-3p表達(dá)明顯降低。血清miR-182-5p、miR-21-3p表達(dá)降低是膿毒癥患兒并發(fā)AKI 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。血清miR-182-5p、miR-21-3p 預(yù)測(cè)膿毒癥患兒并發(fā)AKI 的敏感度及特異度均較高，可能作為膿毒癥患兒并發(fā)AKI的預(yù)測(cè)指標(biāo)。但本研究納入的樣本量較少，且為單中心研究，尚需多中心大樣本進(jìn)一步研究證實(shí)，同時(shí)本研究?jī)H分析了患兒血清相關(guān)指標(biāo)的變化，后續(xù)仍需進(jìn)一步分析miR-182-5p、miR-21-3p 在膿毒癥并發(fā)AKI中的作用機(jī)制。