關節活絡丸溶液灌胃對大鼠膠原誘導性關節炎的治療效果及其作用機制

郭小文，任青，張鑫，李敏婷，李雪玲，彭康

1 南方醫科大學中西醫結合醫院藥學部，廣州 510315；2 南方醫科大學中西醫結合醫院治未病中心

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜炎為主要病理特征的自身免疫性疾病，屬中醫學“痹病”或“歷節”的范疇［1］。目前，RA 治療方案多種多樣，但其療效及患者滿意度均欠佳［2］。長期的臨床實踐發現，中醫藥具有多成分、多通路、多靶點治療優勢，目前已越來越多的用于RA 的治療中［3］。關節活絡丸（Guanjie Huoluo Pill，GJHL）是我院長期應用的治療RA 院內制劑，具有滋補肝腎、益氣養血、舒筋活絡、散寒止痛之功效。我們前期共納入106 例RA 患者，采用GJHL 治療后達到臨床治愈18例、顯效34例、好轉43例、無效11例，治療總有效率高達88.62%，但GJHL 治療RA 的具體作用機制尚不明確。2017 年6 月起，我們制備膠原誘導性關節炎（Collagen induced arthritis，CIA）模型大鼠，觀察GJHL 的治療效果，探討其抗炎的主要藥理作用機制，以期為進一步研發RA治療新藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 SPF 級Wistar 大鼠32 只，雄性，體質量120～150 g，購自于廣州中醫藥大學實驗動物中心，在南方醫科大學中西醫結合醫院實驗動物中心飼養，設施使用許可證號SCXK（粵）2013-0034。弗氏完全佐劑、Ⅰ型膠原蛋白水解酶（美國Sigma 公司），雞Ⅱ型膠原蛋白（上海遠慕）制備Ⅱ型膠原蛋白乳化液：在冰浴條件下，將2 mg/mL的Ⅱ型膠原蛋白溶液（將雞II 型天然膠原溶解于0.l mol/L醋酸溶液中搖床過夜）2 mL 與等體積的完全弗氏佐劑混合，總體積為4 mL，終濃度1 mg/mL，使用電動勻漿器以25 000～30 000 r/min 進行混勻，每次2.5 min，暫停2.5 min，反復3～4 次，至形成油包水白色乳液，滴至水中不擴散。大鼠白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）ELISA 檢測試劑盒（深圳欣博盛）、GJHL 由黃芪、枸杞子、淫羊藿、黃精（制）、牛膝、細辛、桑枝、秦艽、桂枝、雷公藤、丹參、雞血藤、薏苡仁、山藥、茯苓組成，由南方醫科大學中西醫結合醫院藥房提供（粵藥制字Z20110010），將GJHL 溶于純凈水至濃度為0.252 g/mL。來氟米特（LEF，5 mg/片，蘇州長征—欣凱制藥有限公司，批號：H20060034）純凈水溶至濃度為0.525 mg/mL，PV-200 足趾容積測量儀（成都泰盟科技有限公司），EPOCH酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.2 CIA誘導及GJHL給予方法 32只大鼠按隨機數字表法分為GJHL組、陰性對照（NC）組、空白對照（BC）組、來氟米特（LEF）組，每組各8 只，除NC 組外，其余3組大鼠參照文獻［4］及雞Ⅱ型膠原蛋白說明書制備CIA 模型：大鼠于尾根部注射0.2 mL 膠原+CFA 乳劑進行首次免疫，造模第7 天于大鼠尾根部注射0.1 mL 膠原+IFA 乳劑進行增強免疫。7 天觀察并記錄各組大鼠踝關節的關節炎指數（arthritic Index，AI），若AI≥4 表示造模成功。誘導成功后，GJHL組、LEF組分別予GJHL、LEF混懸液灌胃，NC、BC 組大鼠予等劑量純凈水灌胃，10 mL/kg，2 次/天，連續灌胃28 d。

1.3 各組大鼠AI、關節腫脹率測算 ①分別于灌胃第1（給藥前）、7、14、21、28 天觀察并記錄各組大鼠踝關節的AI。單個肢體AI 評分標準為0 分：無關節紅腫；1 分：踝關節或足趾的輕度紅腫；2 分：踝關節的中度紅腫；3 分：包括趾關節在內的全足明顯紅腫；4 分：多足明顯紅腫伴關節變形、功能障礙。每只大鼠的AI 評分最高為16 分。②分別于灌胃第1（給藥前）、7、14、21、28 天采用容積法檢測大鼠左右后肢體積，用大鼠足趾容積測量儀測量大鼠右后肢趾關節毛際以下的容積（mL）。計算其關節腫脹率，以第1 天測值為基值，以后每次測得的值與之相比所得比值記為關節腫脹率。

1.4 各組大鼠血清及關節滑膜成纖維細胞培養液IL-6、TNF-α 檢測 ①灌胃第28 天，1 mL/200 g 腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，采用腹主動脈采血法采血，4 ℃離心，取上清，按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，測量OD450值，繪制標準曲線，測算各組大鼠IL-6、TNF-α。重復3 次，取平均值。灌胃第28天時無菌條件下取出大鼠膝關節滑膜組織，參照文獻［5］對滑膜細胞進行培養。取滑膜細胞培養液，采用ELISA法檢測各組大鼠關節滑膜成纖維細胞培養液上清IL-6、TNF-α。

1.5 各組大鼠踝關節病理變化觀察 灌胃第28 天取各組大鼠踝關節，經固定、脫鈣、石蠟包埋處理后，切成5 μm 切片，進行HE 染色。光鏡下觀察關節滑膜細胞和血管的增生，滑膜層及滑膜下層淋巴細胞浸潤和軟骨的增生及破壞等情況。踝關節病理評分參照文獻［6］分別從滑膜細胞增殖、細胞侵蝕、血管翳形成、炎癥和骨質侵蝕評分，5 個評分總分即為病理評分。

1.6 統計學方法 采用SPSS 21.0 統計軟件進行數據處理。計量資料以表示，對多個樣本的均數采用方差分析進行比較，組間比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同灌胃時間點各組大鼠踝關節AI、腫脹率比較 灌胃后GJHL 組、LEF 組大鼠于第14 天開始關節紅腫、畸形程度較BC 組輕，AI 評分較低（P＜0.05）。結果見表1、2。

表1 不同灌胃時間點各組大鼠踝關節AI比較（分，）

表1 不同灌胃時間點各組大鼠踝關節AI比較（分，）

注：與BC組比較，*P＜0.05；與NC組比較，△P＜0.01。

表2 不同灌胃時間點各組大鼠關節腫脹率比較（%，）

表2 不同灌胃時間點各組大鼠關節腫脹率比較（%，）

注：與BC組比較，*P＜0.05；與NC組比較，△P＜0.01。

2.2 灌胃第28 天各組大鼠血清及關節滑膜成纖維細胞培養液上清IL-6、TNF-α 水平比較 經LEF、GJHL 灌胃后，CIA 大鼠血清及關節滑膜成纖維細胞培養液上清IL-6、TNF-α 水平均較BC 組低。結果見表3。

表3 灌胃第28天各組大鼠血清及關節滑膜成纖維細胞培養液上清IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，）

表3 灌胃第28天各組大鼠血清及關節滑膜成纖維細胞培養液上清IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，）

注：與BC組比較，*P＜0.05；與NC組比較，△P＜0.01。

2.3 灌胃第28 天各組大鼠踝關節病理比較 3 組CIA 大鼠均有不同程度的滑膜細胞增生及侵蝕、炎癥細胞浸潤、血管翳生成、骨質破壞，但經LEF、GJHL 灌胃后，其程度及病理評分均較BC 組低（P＜0.05）。結果見表4。

表4 各組大鼠踝關節病理評分（分，）

表4 各組大鼠踝關節病理評分（分，）

注：與BC組比較，*P＜0.05；與NC組比較，△P＜0.01。

3 討論

RA 是一種關節滑膜炎癥持續存在的慢性自身免疫性疾病，常導致關節破壞畸形。目前抗炎的主要治療手段有生物制劑、非甾體類抗炎藥等，這些藥物雖然能有效的控制RA 的炎癥反應，但是仍有較大的毒副作用且價格昂貴，給患者帶來經濟負擔。因此，尋找療效確切、毒副作用小的治療藥物非常重要。RA 屬于中醫風濕?。ū圆?、痹證）范疇，中醫認為基本病機是，感受風寒濕熱之邪，或因日久正虛，內生痰濁，瘀血正邪相搏，使經絡、肌膚、血脈，筋骨，甚則臟腑的氣血痹阻，而出現肢體關節的腫脹，重著變型、僵直等癥，甚則累及臟腑?！饵S帝內經》記載外邪侵入人體是導致痹病發生的重要條件。歷代眾多醫家通過臨床觀察，總結出風寒濕三氣中但見二氣復合侵入體內，即可致痹。“正氣存內，邪不可干”，痹病發病除外因外，其內因不可小覷，而痹病的主要內因是因為肝腎不足、氣血虧虛。我院院內制劑關節活絡丸內外因兼顧組方，方以黃芪配枸杞補益氣血；淫羊藿配黃精、續斷、牛膝溫補肝腎，強筋壯骨；細辛、桑枝、秦艽、雷公藤、桂枝溫散風寒、祛風通絡；丹參、雞血藤活血通絡；薏苡仁、山藥、茯苓健脾祛濕、消腫。黃芪、淫羊藿、枸杞子、續斷、牛膝等陰陽共進，補益肝腎，強筋健骨，還可增強對雷公藤、細辛之毒性的耐受力，防其毒傷正之弊。全方標本兼顧，風寒濕并祛，并作成丸劑緩圖，對RA 患者的關節腫脹、疼痛、關節僵硬等癥具有較好療效，臨床應用廣泛。其起效的作用機制并未明確。

CIA 大鼠是以慢性、多發性末端關節炎主的免疫性炎癥模型，能夠很好的模擬人RA 炎癥反應，在研究免疫反應、新藥研發及療效評價等方面都具有明顯的優勢［7］。CIA 大鼠致敏第7 天開始出現輕度炎癥，第14 天炎癥細胞浸潤明顯，第21 天出現血管翳形成及軟骨破壞，5～6 周后才出現明顯的骨侵蝕現象［8］，因此對其進行藥物干預28 天可以明顯反應出藥物的抗炎作用及軟骨保護作用。RA 病理改變主要累及關節滑膜，表現為滑膜炎。本實驗結果表明，GJHL 能夠明顯減輕CIA 的紅腫程度及關節腫脹率，療效與LEF類似。

IL-6是多效性前炎癥細胞因子，在RA炎癥過程中起著重要作用，主要包括：影響成骨細胞與破骨細胞的平衡，最終導致骨質疏松；與受體或者多種炎癥因子結合后作用于多條信號通路而增強炎癥反應［9］。RA 患者的血清和滑膜液中的IL-6 水平具有所升高，且其水平與RA 的疾病活動度和影像學的關節破壞程度正相關。進一步研究［9］發現，RA 的關節外癥狀如貧血、疲勞、急性反應蛋白升高等也與IL-6 的全身系統性作用密切相關。這些均提IL-6信號轉導通路是RA 發病過程中起著重要的作用，也可能是治療RA 的靶點。本實驗中GJHL 能降低CIA 大鼠血清和滑膜細胞培養液中IL-6 的含量，提示GJHL起到抗炎作用的作用機制與IL-6相關。

TNF-α主要由巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞等炎癥細胞產生，滑膜襯里層的非炎癥細胞滑膜巨噬細胞也能產生［10］，其參與的誘導炎性細胞聚集和激活、促進滑膜細胞增殖、誘導成纖維滑膜細胞產生骨和軟骨破壞的細胞因子和蛋白酶、刺激巨噬細胞產生其他細胞因子等活動導致RA 患者出現一系列的病理變化［10］，它與IL-6又能相互影響，并都參與了骨質破壞的過程［11］。因此，抑制TNF-α 的分泌也能很好的控制住炎癥過程及骨質破壞情況。本實驗結果顯示，GJHL 能降低CIA 大鼠血清和滑膜細胞培養液中TNF-α 的含量，這也說明GJHL 的抗炎作用很可能是通過抑制TNF-α的分泌實現的。

綜上所述，GJHL 對CIA 大鼠關節炎具有良好的治療效果，GJHL 溶液灌胃可降低CIA 大鼠四肢AI、關節腫脹率、踝關節病理評分，其機制可能為GJHL降低血清及關節滑膜組織IL-6、TNF-α表達。