人類輔助生殖技術用醫療器械胚胎毒性檢驗

【作 者】史建峰，王蕊，韓倩倩

中國食品藥品檢定研究院，北京市，102629

0 引言

近年來，受環境污染加劇、生活壓力增加、生育年齡推遲、人流群體和育齡人群患癌年輕化等因素影響，人類生育力水平成持續衰減狀態。世界衛生組織（WHO）預測不孕不育癥將被列入21世紀人類三大疾病之一，僅次于腫瘤和心腦血管疾病。在我國，根據中國人口協會、國家衛生健康委員會發布的數據顯示，我國育齡夫婦的不孕不育率從二十多年前的3%左右上升到近年的15%左右。目前，人類輔助生殖技術（human assisted reproductive technologies,ART）是治療不孕癥的有效手段，在近年來得到廣泛應用，該技術包括體外受精-胚胎移植、卵泡漿內單精子顯微注射、胚胎植入前遺傳學診斷和胚泡轉移技術、配子/合子/胚胎冷凍-復蘇以及其他衍生技術。ART相關的醫療器械主要分為液體類產品、器具類產品和專用儀器，此類醫療器械在使用過程中不僅與人體接觸，還會與生殖細胞、受精卵和胚胎接觸，會影響子代的健康和發育，因此需要重視此類產品的風險管理。國家藥品監督管理局陸續發布《人類體外輔助生殖技術用液注冊技術審查指導原則》（2018年第18號）、輔助生殖用胚胎移植導管注冊技術審查指導原則（2019年第78號）和輔助生殖用穿刺取卵針注冊技術審查指導原則（2020年第31號）。人類輔助生殖技術用醫療器械的生物相容性評價除常規檢驗項目以外，還需要建立更具針對性的檢驗方法，以保證產品的安全性。其中，胚胎毒性評價是人類輔助生殖技術用醫療器械安全性評價體系中的重要組成部分，當前主要包括體外鼠胚試驗和囊胚細胞染色和計數試驗。

1 體外鼠胚試驗

1.1 體外鼠胚試驗在人類輔助生殖技術用醫療器械的安全性檢驗中的應用

體外鼠胚試驗（mouse embryo assay,MEA）是用于評估輔助生殖實驗室培養系統的重要方法[1-3]。在人類輔助生殖技術用醫療器械安全性評價和監督管理中，美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration,FDA）最先實施，并于1998年在美國聯邦法規（Code of Federal Regulations,CFR）指導原則中明確了將產品MEA試驗數據納入注冊資料中[4]。在我國，原國家食品藥品監督管理總局于2016年發布該試驗方法的行業標準YY/T 1434-2016 《人類體外輔助生殖技術用醫療器械 體外鼠胚試驗》[5]，為相關器械產品的研發、生產和監管提供了技術支撐。

1.2 體外鼠胚試驗根據產品臨床使用進行檢驗

MEA是利用小鼠胚胎代替人胚胎，模擬產品的臨床使用，在體外培養環境中將鼠胚與產品進行接觸，通過鼠胚的囊胚發育情況來評價產品對胚胎發育的潛在毒性（見圖1）。例如器具類產品主要為制備產品的浸提液與鼠胚進行接觸；液體類產品中洗滌液、操作液、活檢液及移植液等短期接觸產品通常與鼠胚接觸20 min后再轉入胚胎培養液中繼續培養；序貫/全程培養液則根據其在胚胎培養發育階段的使用情況來與鼠胚進行接觸。

圖1 體外鼠胚試驗結果觀察Fig.1 Observations of MEA

1.3 試驗操作對試驗結果的影響

根據現行標準，MEA采用體內受精的方法，取1-細胞或2-細胞進行試驗。由于1-細胞對環境的反應更加敏感[6-7]，該標準推薦使用1-細胞試驗方法。MEA是一個對技術操作要求較高的試驗，操作熟練程度會直接影響試驗結果。胚胎在母體中處于厭氧環境，大部分哺乳動物細胞氧含量為2%～9%[8]，在脫離母體后，應盡快處理鼠胚以減少在環境中的暴露時間，這是由于環境的氧濃度較高會對胚胎形成率和發育質量造成不利影響[9-10]。另外，在處理鼠胚前，需要將長期接觸鼠胚的檢測樣品液、操作液、培養液表面覆蓋組織培養用油并在培養環境下進行預平衡（通常為4 h～18 h），使溫度、pH值、氧含量和滲透壓達到一個穩定狀態。在鼠胚清洗和轉移的操作中，熟練的技術會在達到操作目的的情況下，減少鼠胚在操作液的停留時間，使其盡快進入最佳培養環境中。同時，熟練的技術對試驗穩定性和平行性也具有積極影響。

1.4 培養體系對試驗結果的影響

MEA需要對雌鼠進行超數排卵以獲得足夠的卵細胞，超數排卵主要是通過孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin,PMSG）與絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,HCG）聯用，而獲得卵細胞的數量和成熟度會有所差異，進而影響受精率和胚胎質量。不同品系的小鼠經超數排卵后獲得的卵子/受精卵數量也有所不同，但一次試驗中在各小鼠中收獲的受精卵的數量差異不宜過大，數量太少或太多均對胚胎質量有不利影響[11]。接觸檢測樣品液之前，要挑選大小和形態正常的受精卵進行試驗，避免收集空泡、白斑、周隙、胞漿顆粒、極體和透明帶異常的受精卵，這會對后期囊胚形成率的結果判定造成干擾。每只小鼠收集的受精卵也應該盡量平均地分配到各個試驗組中，避免個體差異影響結果判定。

2 囊胚細胞染色和計數試驗

2.1 囊胚細胞計數是對MEA的重要補充

MEA以囊胚形成率作為試驗結果的判定指標，然而這一判定指標不能全面反映產品的安全性能，這是由于囊胚形成率不能代表囊胚發育的質量，例如鼠胚分別在氧濃度為5%和20%的培養條件下得到的囊胚形成率相近，但是囊胚細胞數和孵化程度卻有很大差異[12]。又如具有正常形態學的囊胚，其細胞數仍有可能較少且發育潛能較差[13]。因此，需要在MEA的基礎上建立檢驗囊胚發育質量的試驗方法。相較于囊胚擴張程度和孵化狀態等形態學觀察，對囊胚細胞計數是一種更加客觀、實用的方法，這一方法通過大量研究也得到了充分驗證[14-17]。因此，通過對囊胚細胞進行計數，可以在一定程度上反映囊胚的發育質量，也是對體外鼠胚試驗的一種重要補充。

2.2 囊胚細胞的分系、染色和計數

早期胚胎發育包含一系列重要事件，如卵裂、致密化和囊胚形成。胚胎在8-細胞開始致密化[18]，也是胚胎發育過程中的第一次分化。致密化主要是細胞黏附分子E-cadherin（Cdh1）在細胞間接觸膜中的積累所介導[19]，卵裂球間發生黏附，單個細胞膜已經不存在，進而擠壓使細胞形狀發生改變，致密化后的桑椹胚的內部細胞將發育成為囊胚的內細胞團（inner cell mass,ICM），而外部細胞將發育成滋養外胚層（trophectoderm,TE）。在8-細胞期由于細胞的極化作用，使基因調控水平不同，如Cdx2（caudal type homeobox 2）在胚胎外周發生極化的細胞中表達水平升高，在胚胎內部非極性細胞表達水平較低。而維持胚胎干細胞多能性的關鍵基因Nanog，Oct4和Sox2與Cdx2呈相反的趨勢。將Cdx2作為TE的標志調節因子，而將Nanog，Oct4和Sox2作為ICM的標志因子，通過應用識別以上標志因子的熒光抗體對TE和ICM進行染色，以達到囊胚細胞分系、染色和計數的目的。另外可以用DNA熒光染料對囊胚總細胞進行染色和計數（見圖2）。

圖2 囊胚細胞熒光染色圖像Fig.2 Fluorescent staining of blastocyte

2.3 囊胚細胞染色和計數方法的標準化

囊胚細胞染色和計數是對MEA的重要補充，建立標準化的試驗方法可以為人類輔助生殖技術用醫療器械的質量評價、行業規范和監管提供技術支持。中國食品藥品檢定研究院作為人類輔助生殖技術用醫療器械標準化技術歸口單位，組織起草了行業標準YY/T 1688-2021《人類輔助生殖技術用醫療器械 囊胚細胞染色和計數方法》，該標準通過對囊胚總細胞和內細胞團細胞進行熒光染色、計數，將總細胞和內細胞團細胞的數量作為良好囊胚的判定指標，通過良好囊胚率來評價囊胚的發育質量。目前該標準已經形成報批稿提交國家藥品監督管理局醫療器械標準管理中心。

3 面臨的挑戰

在我國已經有兩種試驗方法可以用于人類輔助生殖技術用醫療器械的安全性檢驗，而且均進行了標準化，另外我國關于人類輔助生殖技術用醫療器械已發布了6個行業標準，我國在該類器械領域的標準化技術水平已處于領先地位。但是，上述兩個方法均有一定的局限性，例如，MEA中小鼠品系對試驗敏感性影響較大，目前常用F1代小鼠對培養體系并不敏感[20-21]，而且小鼠胚胎對次優環境的適應能力更強[22]，這些都是會影響MEA的靈敏性。目前MEA采用體內受精方法，而如精子洗滌液、取卵液和卵母細胞發育培養液等受精前使用的產品，現行標準的適用性受到一些限制。另一方面，與體內受精相比，體外受精雖然不會使囊胚形成率降低[23]，但是會對囊胚發育造成不利影響[24]。囊胚細胞染色和計數雖然可以在一定程度上反映囊胚的質量，但是在對囊胚發育潛能的評價中，該試驗結果的提示作用有限，需要建立新的試驗方法予以支持。

4 展望

體外鼠胚試驗和囊胚細胞染色和計數試驗已經應用于多種人類輔助生殖技術用醫療器械的安全性檢驗，在細胞水平上對產品的潛在毒性進行檢驗。未來需要優化試驗系統來提高敏感性和穩定性，如選擇更加敏感的小鼠品系、營養成分更加簡單的培養系統使鼠胚對毒性物質反應更加靈敏。另一方面，在這兩種方法的基礎上，檢驗技術還需繼續延伸，建立新的方法，如在分子水平上對調控生長和發育的關鍵基因的表達進行檢驗，來檢驗醫療器械產品對胚胎發育潛能的影響。