火腿微生物發酵劑研究進展

趙婧含鞠銘孫德鵬董微巍樸春香

(1.延邊大學農學院,吉林 延吉 133002；2.延邊大學食品研究中心，吉林 延吉 133002；3.東北寒區肉牛科技創新教育部工程研究中心,吉林 延吉 133002)

西式發酵火腿是以豬后腿肉為原料，通過不同技術進行腌制，再經過干燥(煙熏或不煙熏)達到成熟后制成的肉制品。這種類型的火腿具有穩定的色澤、典型的芳香氣味和緊實的質地，可以直接食用。西式發酵火腿種類繁多，不同品牌火腿的生產技術和感官屬性也大不相同，而風味是影響火腿整體接受度的一個關鍵因素，其受到火腿原料、加工技術和成熟時間的顯著影響。火腿是經過發酵和長時間的成熟生產出來的。6～30個月的成熟期促進了西式發酵火腿典型風味的形成[1]。其中的風味化合物主要來源于蛋白水解、脂解、糖酵解和次生代謝產物。西式發酵火腿中蛋白質含量相對較高，蛋白質被微生物轉化為多肽，并進一步轉化為各種氨基酸。氨基酸被確定為許多揮發性化合物的前體，包括發酵過程中產生的酮、醛、醇、酸、酯、烯烴和烷烴。源于支鏈氨基酸轉氨作用的風味化合物(BCAAs，包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)因其類型復雜、豐度高和風味閾值低而受到關注，這突出了其在發酵肉風味發展中的重要作用。在肉制品中，支鏈醛類是最豐富的風味化合物，包括通過亮氨酸的轉氨基作用和α-酮基異抑肽酶的進一步脫羧作用產生的3-甲基丁醛。因此，在乳酸菌發酵過程中，提高支鏈氨基酸衍生的揮發性化合物對發酵肉的風味至關重要。發酵肉成熟過程中的分解代謝主要是由微生物氨基轉移酶的作用引起的。包括乳酸菌(LAB)在內的許多微生物參與了亮氨酸向3-甲基丁醛的轉化。

發酵劑是指活的或休眠狀態的微生物制劑，理想的發酵劑在促進肉制品發酵的同時，還起著抑菌防腐、保證質量的作用，且能產生良好的代謝活性，從而改善發酵肉制品的感官品質[2]。自然發酵肉制品的歷史悠久，1940年，詹森和帕多克開始使用乳酸菌生產發酵香腸，乳酸菌可以利用碳水化合物發酵產生乳酸和其它香氣化合物[3]。葡萄球菌是近年來使用最廣泛的微生物發酵劑[4]，凝固酶陰性葡萄球菌是發酵產品中通過降解支鏈氨基酸和脂肪酸而形成顏色和風味所必需的[5]，其能夠迅速減弱肉制品的產酸能力，縮短發酵成熟期，抑制肉的腐爛和致病微生物的繁殖，從而提高產品品質。毫無疑問，接種發酵劑是以較短的發酵時間和高質量生產安全產品的重要工具。目前，微生物在肉制品中的應用越來越廣泛，而且在成熟過程中，微生物對火腿風味的形成有促進作用[6]。因此，本文總結了不同微生物發酵劑在火腿發酵中的應用，以期通過加入微生物來改善火腿的風味，為火腿生產提供理論依據。

1 不同微生物發酵劑在火腿發酵中的應用

1.1 凝固酶陰性葡萄球菌

由于凝固酶陰性葡萄球菌是生腿腌制后自生菌群的一部分，因此很可能成為火腿發酵劑中的候選者。一些凝固酶陰性葡萄球菌，如肉葡萄球菌(S.carnosus)和木糖葡萄球菌(S.xylosus)，作為發酵肉制品中的發酵劑具有悠久的歷史[7,8]，其在火腿發酵過程中可以改善色澤并產生香氣。這些積極的影響是由于不同的代謝活動(如硝酸鹽還原和蛋白水解)所引起的，其通常也能夠在高鹽濃度下生長。與木糖葡萄球菌和馬胃葡萄球菌(S.equorum)相比，S?ndergaard和Stahnke[9]研究的肉葡萄球菌菌株比這2個物種的耐鹽性更高。研究表明，某些肉葡萄球菌能夠在氯化鈉濃度為15%～20%的條件下生長[10]。

在腌制的生腿上或在火腿加工使用中發現的2個主要菌種是木糖葡萄球菌(S.xylosus)和馬胃葡萄球菌(S.equorum)。盡管木糖葡萄球菌以香腸模型系統中的香氣產生而聞名，但尚無關于將木糖葡萄球菌用作火腿中單一菌株發酵劑培養物的研究報道。Sánchez Molinero和Arnau[11]進行的火腿實驗中使用的木糖葡萄球菌是市售發酵劑的一部分。在火腿中作為微生物發酵劑的馬胃葡萄球菌也很少見，Hammes和Hertel[12]則認為,馬胃葡萄球菌適合作為火腿發酵劑，因為該物種的菌株可以在低于10℃的溫度下生長良好。發酵劑的使用始于添加微球菌屬和葡萄球菌屬(凝固酶陰性球菌——CNC)菌株，使得顏色更好，降低pH值，抑制病原微生物，降低工藝的經濟要求，并對火腿的風味和顏色作出了積極貢獻。

1.2 乳酸菌(LAB)

作為大多數肉類加工所使用發酵劑的一部分，在一些研究中已經測試了乳桿菌屬并將其用于火腿發酵。乳酸菌能代謝碳水化合物主要產生乳酸，以及少量乙酸、二乙酰。還可產生肽酶和氨肽酶以及通過降低pH提高組織蛋白酶的活性，從而直接或間接參與蛋白質降解。Toledano等[13]研究了11種市售乳酸菌菌株對豬肉肌球蛋白的水解能力，用來測定蛋白質水解是否影響西式發酵火腿的最終風味；提出嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)可以作為候選發酵劑，顯示出了對肌球蛋白的高水解活性。Alicia Rodriguez等[14]在西式發酵火腿表面使用商業發酵劑，除了葡萄球菌和霉菌外，還包括沙克乳桿菌和戊糖乳桿菌(L.pentosus)菌株，以研究發酵劑對氣味、風味和外觀的影響；其認為加入發酵劑處理的西式發酵火腿存在感官特性的差異，改善了火腿的風味。Md.Kauser-Ul-Alam等[15]研究LAB作為發酵劑代替亞硝酸鹽改善肉制品色澤，對其在不同條件下的表型特性進行了研究。在乳酸菌中，片球菌屬和乳桿菌屬菌株已被廣泛研究并用作發酵劑，如乳酸乳桿菌、戊糖乳桿菌、薩基乳桿菌、植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、戊糖乳桿菌和干酪乳桿菌。此外，乳酸菌還可以用作其它腌肉制品的發酵劑。

1.3 霉菌和酵母菌

脂解和蛋白質水解的過程會提高火腿的感官質量[16,17]。據報道，普通青霉(P.commune)、產黃青霉(P.chrysogenum)、納地青霉(P.nalgiovense)和枝狀枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)菌株顯示出高脂解和蛋白水解活性，被認為可以增強最終產品的典型風味。

為了篩選適當的發酵劑，Ockerman等[18]從西班牙火腿表面分離出5株青霉屬菌株，并在肉模型中測試了風味。黃灰青霉(P.aurantiogriseum)和沙門柏青霉(P.camemberti)菌株在3～8℃的范圍內提高了火腿的風味品質，但超過12℃時風味品質降低。這些結果有力地表明，不同揮發性化合物的產生依賴于菌株。Andrade等[19]的研究證實了這一點，其從伊比利亞火腿中分離出117種酵母菌株，主要是漢遜德巴利酵母(D.hansenii)和涎沫念珠菌(C.zeylanoides)，并比較了體外58種揮發性化合物的產量，在未接種的對照品與漢遜德巴利酵母和涎沫念珠菌的接種批次之間，檢測到揮發性化合物(支鏈醛、醇和酮)的含量差異。有人建議將漢遜德巴利酵母的2種生物型作為火腿發酵劑中的主要微生物，因為其對西式發酵火腿的風味化合物的產生有很大影響，如3-甲基丁醛[20]。在豬里脊肉中測試了產黃青霉(P.chrysogenum)和漢遜德巴利酵母(D.hansenii)對蛋白水解過程和揮發性化合物形成的影響。與漢遜德巴利酵母相反，產黃青霉(P.chrysogenum)對肌原纖維蛋白具有蛋白水解活性，并導致氨基酸分解及其代謝衍生化合物的增加，如羧酸和支鏈醛。漢遜德巴利酵母的應用能夠產生更高濃度的環醇和芳香醇。Rodríguez等[21]對伊比利亞干腌火腿中分離出來的微生物蛋白水解酶活性進行評價，發現產黃青霉對干腌肉制品中蛋白質的水解起重要作用，能顯著提高火腿中游離氨基酸的含量。多數霉菌在人工培養基上可以產生霉菌毒素，因此霉菌發酵劑需驗證安全無毒后方可應用，產黃青霉和納地青霉是常用的不產毒霉菌發酵劑[22]。

1.4 混合菌種發酵劑

目前，乳酸菌和凝固酶陰性葡萄球菌被認為是肉類發酵中2種重要的細菌，其抗菌代謝產物(包括有機酸、溶菌酶和過氧化氫)是抑制病原菌的最重要因素[23]。凝固酶陰性葡萄球菌有助于抑制脂質氧化和亞硝酸鹽肌肉蛋白的形成，促進硝酸鹽的還原能力[24]。有些葡萄球菌也參與了蛋白水解和脂解，如金黃色葡萄球菌。在發酵過程中，蛋白質水解決定了發酵肉的感官和營養特性[25-29]。近十年來的許多研究表明，蛋白質水解不僅與內源酶的活性有關，還與某些細菌群有密切聯系，如葡萄球菌[30-32]。葡萄球菌在肉類發酵過程中蛋白質分解受到乳酸菌的影響[33]。因此，在篩選多菌種發酵劑時，應考慮乳酸菌和葡萄球菌之間的協同作用[34]。

Tremonte等[35]認為，葡萄球菌和肺炎鏈球菌混合培養比單一培養葡萄球菌效果更好。混合發酵過程中微生物的相互作用以及葡萄球菌蛋白水解能力對發酵質量的影響尤為重要。從傳統肉制品中分離的微生物有望成為肉類發酵的候選菌種，其對肉中的環境有很好的適應性[36]。從自然發酵中分離出來的乳酸菌和葡萄球菌可以根據特定的代謝活性提供獨特的誘人香味[37-39]。王永霞等[40]從20多種傳統發酵肉制品中分離出菌株198株，并篩選出2株過氧化氫酶陽性球菌，初步鑒定為肉糖葡萄球菌(StapHylococcus carnosus)S15和S113，并研究了戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)P20、米酒乳桿菌(Lactobacillus sake)J17分別同2株葡萄球菌在模擬肉湯中混合培養的相互關系，初步確定了混合肉品發酵劑P20加 J17可以改善火腿的品質。在Schlafmann等[41]的研究中，將馬胃葡萄球菌與嗜鹽四聯球菌(Tetragenococcus halophilus)結合用于西式發酵火腿模型系統中，總體上改善了火腿品質并減少金黃色葡萄球菌的數量。在Black Forest火腿的生產中發現，聯合菌種實現了顏色的改善，并且金黃色葡萄球菌的數量減少了3～5log cfu·g-1。Chen等[42]還研究了3種乳酸菌(戊糖乳桿菌、彎曲乳桿菌和薩凱乳桿菌)和1種葡萄球菌(木糖乳桿菌)對發酵肉制品中脂類和蛋白質氧化水解的影響。研究結果表明，細菌發酵可以抑制肉中蛋白質和脂類的氧化，促進肉中蛋白質和脂類的水解，從而改善其風味和感官品質。

2 微生物發酵劑對火腿安全性的影響

有學者將有硝酸鹽還原酶活性的凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)或微球菌添加到西式發酵火腿中，該菌使火腿中的NO3-還原為NO2-。研究表明，具有高硝酸還原酶活性的微生物可以彌補火腿顏色缺陷和降低生火腿產品中殘留的硝酸鹽含量[43]。在Bosse等[44]的研究中，將2種不同的肉葡萄球菌用作北歐火腿的發酵劑，以研究其不同的硝酸還原酶活性以及對最終產品的顏色形成、硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的影響。1株LTH 7036菌種在體外顯示出較高的硝酸鹽還原能力，另1株LTH 3838菌種卻相反。同樣，在火腿內部也觀察到了這些影響，接種LTH 7036的火腿比接種LTH 3838的火腿產生更高的亞硝酸鹽含量和更低的硝酸鹽含量，LTH 3838菌株在體外還具有針對肌漿蛋白的水解活性。Héquet等[45]在火腿中對比使用了產細菌素的清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)2512 和不產細菌素的清酒乳桿菌L110，雖然二者有相似的培養基酸化速率，但產細菌素的處理組中英諾克李斯特菌(Listeria innocua)的數量更低，且整個貯藏期60d內目標菌株均未顯著生長。Ramaroson等[46]發現,在接種乳酸菌的火腿中除精胺外的生物胺產量極少，這也可能包括了肉中自然存在的精胺。

霉菌和酵母菌的應用有時也能有助于提高產品的安全性。Rodríguez等[47]在伊比利亞火腿上施用了產黃青霉RP42C，結果表明，減少了產生OTA的霉菌數量。這些發現也得到了其它研究的證實。如，Comi[48]和Iacumin將霉菌和酵母菌，如納地青霉(P.nalgiovense)、季也蒙假絲酵母(C.guilliermondii)和扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)應用于火腿的表面，同時接種產毒霉菌，結果顯示，其有效地阻止了產OTA霉菌的生長，從而抑制毒素的產生。Virgili等[49]還用分離自意大利發酵火腿的12種酵母菌株在體外進行研究，即使通過增加真菌接種量具有降低酵母拮抗作用的潛力，但氯化鈉的存在卻起到增強作用。在另一項研究中，Simoncini等[50]研究了漢遜德巴利酵母78菌株、馬拉馬氏酵母(D.marama)51菌株和伯頓絲孢畢赤酵母(Hyphopichia burtonii)120菌株在肌肉中的繁殖能力；發現漢遜德巴利酵母(D.hansenii)78菌株、馬拉馬氏酵母51菌株均能夠在肌肉中穩定繁殖，而馬拉馬氏酵母51菌株最能滿足作為微生物發酵劑的要求，由于伯頓絲孢畢赤酵母120菌株不能在意大利發酵火腿的表面繁殖，因此被排除在潛在的發酵劑之外。

3 微生物發酵劑的生存方式

在食品系統中應用微生物發酵劑時會面臨2個挑戰，即引入的方式；發酵劑是否能夠在給定加工條件的食品系統中生存并進行所需的代謝活動。盡管發酵劑適用于肉類發酵，但到目前為止，其應用主要局限于發酵香腸。將其與香腸肉混合可以很容易地引入，而在火腿中，則必須將其引入整個肌肉系統并且不會破壞火腿的質地結構。可以通過在火腿表面涂抹或噴霧的形式添加發酵劑，驗證微生物是否能進入肌肉內部，在不同的研究中已經有學者對這種形式進行實驗。在腌制之前或之后將馬胃葡萄球菌(S.equorum)、肉葡萄球菌(S.carnosus)、嗜鹽四聯球菌(Tetragenococcus halophilus)、戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)和干酪乳桿菌(L.casei)摩擦在整個肉塊的表面上。在最終產品中，乳酸菌主要位于表面，而葡萄球菌則位于內部，這表明微生物在整個肌肉塊都有遷移。在Bosse等[51]的研究中，細菌遷移到肌肉組織中的有效擴散系數被確定為1.9×10-10～1.1×10-8m2·s-1。除了噴灑之外，在添加了發酵劑的鹽水中浸泡也可以用于將發酵劑轉移到肉中。浸泡在添加肉葡萄球菌和植物乳桿菌(L.plantarum)的鹽水中，腌制結束后，從產品中檢測出該微生物數量增加。如果要在腌制的生腿內部應用微生物，則可以通過注射的方式引入[51]。已經有人應用該技術注入肉葡萄球菌、植物乳桿菌(L.plantarum)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、清酒乳桿菌(L.sakei)和變異微球菌(M.Varians)。盡管僅注射就足以將細菌引入到肉類結構中，但是其它過程，如翻滾、真空浸漬、真空翻滾和凍融等也有助于其均勻分布。這些操作程序和每一個不同注射位置都為相應的微生物提供了不同的環境；施加到肌肉內部為微生物提供厭氧環境，而表面微生物則不需要。

北歐風格的火腿如果在加工開始時應用發酵劑，則微生物必須能夠在煙熏處理中存活；南歐風格的火腿則不需要這個條件。南歐風格的火腿中被經常用作表面發酵劑的霉菌是原生微生物群的一部分，但這種微生物很少在北歐風格的火腿中使用。這種差異可能是由煙熏引起的，但到目前為止，尚無研究調查煙熏西式發酵火腿對表面微生物影響的研究。通常，在腌制過程中約5℃的低溫會抑制微生物的生長，因此，要選用微生物發酵劑，至少可以耐受該溫度，如清酒乳桿菌(L.sakei)。生腿腌制過程中微生物存活的另一個障礙是氯化鈉的含量相對較高，最高可達5%。因此，用作發酵劑的微生物必須具有耐鹽性并能適應這種特定的腌制條件。

4 結論與展望

微生物發酵劑的高產酸和快速降低火腿水分活性的能力，有利于縮短肉制品的發酵成熟期；而發酵肉制品的低pH值，不僅能夠抑制細菌和病原體的生長以及毒素的產生，還有利于促進產品干燥。火腿生產中的一些困難，特別是產品安全性的問題，可以通過使用發酵劑來解決。但是，由于存在不同的障礙和環境條件，將生產發酵香腸使用的發酵工藝應用到火腿生產中并不適用。對于微生物發酵劑，引入技術以及其對火腿實際影響的進一步研究是非常令人感興趣的。發酵劑的篩選優化也將會成為國內外研究的重點，特別是在混菌發酵方面，篩選出2種或多種沒有互補拮抗作用的混合發酵劑也將成為發酵肉制品研究領域的熱點。