MicroRNA－218單核苷酸多態性與結直腸癌易感性的關系*

李天煜，龐彩蓮，徐瑞梅，林悠閱，呂昕琪，范志豪，鐘展華，何俊力，袁朝漢，魏馳譽，黃舒琪，謝烷頤，廖日煜

廣東醫科大學 1外科學教研室，3公共衛生學院，4研究生學院（廣東東莞523808）；2東莞市大朗醫院檢驗科（廣東東莞523770）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是發生于結直腸上皮的惡性腫瘤，其發病率居惡性腫瘤中的第3位，同時也是癌癥致死的第二大原因［1］。到2030年，預計CRC的全球疾病負擔將增加60%，新增病例將超過220萬，死亡人數將超過110萬［2］。結直腸癌的發生、發展是一個多要素的病理變化過程，且涉及多個基因的改變。遺傳因素在CRC發病中起重要的作用［3］。然而，CRC的發病機制尚不完全清楚，有待進一步研究。MicroRNAs（miRNAs）是一種參與腫瘤發生、發展的調節性非編碼RNA，它通過與蛋白質編碼mRNAs的3′端非編碼區（3′－UTR）結合，導致靶mRNA分子的翻譯抑制，在基因編碼轉錄后調控中發揮重要作用。單個miRNA可調控多個靶mRNAs，miRNA可調控約60%的人類基因［4］。目前研究顯示miR－218 rs11134527、miR－25 rs41274221、miR－143 rs4705342、miR－106a rs137881717的基因多態性與不同類型癌癥的發生、發展相關［5］。而microRNA－218 rs11134527的GG基因型與多種癌癥的發生、發展存在密切相關性，尤其與消化道腫瘤有潛在關聯。我們初步篩選實驗表明microRNA－218 rs11134527可能與CRC有潛在關系，并影響CRC的發生、發展。在此基礎上，應用聚合酶鏈式反應－連接酶檢測反應技術（LDR－PCR）檢測上述基因在CRC患者血清中的表達水平，并采用二元邏輯回歸分析對miR－218 rs11134527等4個多態位點與CRC易感性的關聯程度進行評估，旨在探討其多態位點在CRC診斷中的臨床價值，為CRC的篩查、診斷、治療及預后提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取廣東醫科大學附屬醫院、江門市中心醫院、東莞市人民醫院和東莞市大朗醫院2017年8月至2019年7月確診為CRC并未作任何治療的66例患者（CRC組）。此外，選擇124例來自同期4個醫院且體檢結果均為正常的健康個體作為對照組。所有CRC患者和正常健康個體均為無血緣關系的人群。所有CRC患者均經過組織病理學證實。本研究收集CRC患者標本時，采集患者靜脈血標本2 mL，經EDTA－K2抗凝，－20℃保存，進行后續實驗。本研究經嚴格審查批準，獲得相關4個醫院醫學倫理委員會的批準進行人體組織細胞采集、檢查與實驗，并與患者簽署知情同意書。

1.2 基因組DNA的提取、分型 在受試者知情同意后，提取每個樣本的外周靜脈血，加入抗凝劑后充分混勻。用TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒提取各樣品的基因組DNA，并將提取的DNA保存在－80℃冰箱中，直至下一步的基因分型。對66例結直腸癌患者和124例健康對照者的microRNA－218 rs11134527、microRNA－25 rs41274221、microRNA －143 rs4705342 和 microRNA －106a rs137881717多態位點采用聚合酶鏈式反應－連接酶檢測反應技術（LDR－PCR）進行分型。MicroRNA－218 rs11134527、microRNA－25 rs41274221、microRNA－143 rs4705342 和 microRNA－106a rs137881717四個單核苷酸多態性的基本信息在國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）提取，見表1。首先構建PCR反應體系，總體積為20μL，包括50 ng基因組DNA樣品、1×PCR緩沖液、3 mmol／LMg2＋、2 mmol／L／每個dNTP、0.5 p引物混合物和1 U Taq DNA聚合酶。引物序列見表2。第二步是建立一個LDR反應體系，該反應體系總體積為10μL，其中包含1μL LDR緩沖液、第一步的4μL PCR產物、每種探針混合物2 pmol和2 U Taq DNA連接酶。探針序列見表3。在基因分型過程中，隨機選擇15%的樣品進行重復測定，與先前測定結果一致率為100%。

表1 rs11134527、rs41274221、rs4705342、rs137881717的基本信息

表2 引物的信息

表3 探針的信息

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行數據處理和統計分析，使用SHEsis軟件（http：／／analysis.bio－x.cn／myAnalysis.php）對microRNAs進行單倍體估算和分析。對照組采用χ2檢驗4個microRNA多態位點的基因型分布是否符合Hardy－Weinberg平衡原則。最后，通過二元邏輯回歸分析評估microRNA－218 rs11134527和其他4個單核苷酸多態性與CRC易感性的相關性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MicroRNA－218 rs11134527及其他3個單核苷酸多態性的基本信息 與NCBI數據庫中國受試者的最小等位基因頻率（MAF）對比，本研究對照組中4個單核苷酸多態性的MAF極為相似。結果顯示，對照組中除了rs41274221外，Hardy－Weinberg平衡測試均正常（P＞0.05），見表4。因此，本研究樣本群體的基因型頻率分布大多遵循Hardy－Weinberg平衡原則。

2.2 MicroRNA－218 rs11134527及其他3個單核苷酸多態性與CRC易感性的關聯分析 基因型關聯分析中，CRC組和對照組僅有microRNA－218 rs11134527這一單核苷酸多態性有顯著差異。二元邏輯回歸分析顯示，與AG、AA基因型相比，microRNA－218 rs11134527中GG基因型與CRC易感性增加相關（OR＝2.31，95%CI：1.04～5.15，P＝0.04），表明攜帶有GG基因型個體的CRC發病風險比攜帶AG或AA基因型個體高出2.31倍。在等位基因和基因型分析中并未發現其余3個單核苷酸多態性與CRC易感性有任何關聯（P＞0.05）。見表4。

表4 MicroRNA－218 rs11134527等4個單核苷酸多態性與CRC易感性的關聯分析 數量（%）

2.3 MicroRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342兩個單核苷酸多態位點形成的單體型與CRC易感性的關聯分析 通過進一步的結構分析，MicroRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342均位于5號染色體上，這2個單核苷酸多態位點位于同一個單體型區。同時，單倍體連鎖不平衡測試提示microRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342之間存在連鎖關系。因此，本研究進一步對比CRC組和對照組之間兩個單核苷酸多態位點形成的單體型頻率。納入本研究的2個單核苷酸多態位點的4種常見單體型（頻率＞3%）幾乎占單體型變異的100%。單體型分析結果顯示，microRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342形成的4種常見的單體型均與CRC易感性不存在任何關聯（P＞0.05）。見表5。

表5 MicroRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342兩個單核苷酸多態位點形成的單體型與CRC易感性的關聯分析數量（%）

3 討論

CRC是一種多步驟、多因素、多基因疾病，由多種環境、生活方式和個體的遺傳易感因素共同作用的結果，其中個體遺傳易感性是CRC發生、發展的主要動因。miRNAs在腫瘤發展過程中特異度較高，穩定性好，因此microRNA對癌癥生物學具有重要意義，已有研究證實miRNAs可以作為乳腺癌、肺癌、腎癌等［6－8］腫瘤的生物標志物。越來越多的研究表明，microRNA表達失調在CRC的發展和轉移中發揮著功能性的作用［9］。

MicroRNA－218 rs11134527已被有關研究證實與肺癌［10］、宮頸癌［11］、食管鱗狀細胞癌［12］等多種癌癥的發生、發展密切關聯。然而，這些研究均提供了不同的結果。2018年Danesh等［13］報道microRNA－218 rs11134527單核苷酸多態性增加了患乳腺癌的風險。此外，Chuanyin等［11］發現，microRNA－218 rs11134527的GG基因型在宮頸上皮內瘤樣變組和對照組中比AA和AG基因型具有更高的宮頸癌風險。在此基礎上，我們進行了基因型關聯分析研究，結果表明microRNA－218 rs11134527與CRC的易感性增加有關（OR＝2.31，95%CI：1.04～5.15），CRC組和對照組之間差異有統計學意義（P＜0.05）。而microRNA－25 rs41274221、microRNA－143 rs4705342和microRNA－106a rs137881717與CRC易感性卻無關聯（P＞0.05）。再進一步分析位于5號染色體同一個單體型塊上2個單核苷酸多態位點microRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342，結果示2個單核苷酸多態位點形成的單體型與CRC易感性不存在關聯。

目前，已有研究發現microRNA－218 rs11134527的AG ＋GG基因型與非小細胞肺癌的易感性降低有關［10］；而本研究表明，與AG和AA基因型相比，攜帶有GG基因型個體的CRC發病風險比攜帶AG或AA基因型個體高出2.31倍。He等［14］報道microRNA－218 rs11134527的A＞G單核苷酸多態性可降低個體罹患神經母細胞瘤的風險，這提示G等位基因可能是多種疾病發展的保護因子，但其在CRC中的作用有待進一步研究。

近年來有許多microRNA被報道可用于癌癥的化學治療，對降低腫瘤細胞的抵抗性有一定的作用。Nangia－Makker等［15］發現上調microRNA－145的表達和阻斷Wnt／β－catenin的信號可抑制CRC耐藥干細胞的增殖和克隆。目前CRC的主要化療方案是奧沙利鉑／氟尿嘧啶方案，血清中microRNA－92a－3p的高表達也與CRC的轉移和化療耐藥性高度相關［16］。microRNA－218可通過靶向Rictor增加宮頸癌患者對化療藥物雷帕霉素的敏感性［17］。通過靶向Glut1，microRNA－218也增加了膀胱癌對化療藥物順鉑的敏感性［18］。miR－218可通過下調TS的表達，與5－氟尿嘧啶共同抑制CRC細胞的發生、發展，microRNA－218還可通過靶向BIRC5增強5－氟尿嘧啶誘導的細胞凋亡，從而增強藥物療效［19］。除BIRC5外，胸苷酸合酶（TS）也被發現與5－氟尿嘧啶的耐藥有關。奧沙利鉑作為化療的基礎藥物之一，其臨床發展也受到CRC細胞耐藥性的限制。Fu等［20］發現miR－218的高表達可以抑制CRC細胞的自噬，顯著提高腫瘤對奧沙利鉑的敏感性。此外，一些研究證實miR－218聯合MALAT1（一種長鏈非編碼RNA）應用可以抑制上皮細胞－間充質轉化（EMT）過程，從而影響癌細胞對奧沙利鉑的敏感性［21］。以上結果表明，microRNA－218有望成為降低CRC細胞耐藥性的關鍵靶點，但需要進一步的研究來證明。

綜上所述，本研究通過分析microRNA－218 rs11134527證明了microRNA－218 rs11134527與CRC易感性之間的關聯。然而，microRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342單核苷酸多態性位點形成的單倍型與CRC的易感性無關。本研究的結果拓展了CRC易感基因的數據庫，并為未來的研究人員提供了研究方向。此外，microRNA－218 rs11134527有望成為未來CRC發生、發展的重要預測指標，為CRC的早期診斷和治療奠定堅實的分子基礎。

（志謝：感謝廣東醫科大學附屬醫院、東莞市人民醫院、東莞市大朗醫院、江門市中心醫院胃腸外科的醫護人員，在實驗中尤其是標本收集提供便利。）