不同發病狀態的潰瘍性結腸炎患者血清炎癥因子和免疫球蛋白變化及與腸道菌群變化的相關性*

高磊，張英劍，劉曉敏，曹蕾，王瑞芳，薛娟

河南科技大學第一附屬醫院 1消化內科，2內鏡中心，3檢驗科（河南洛陽471000）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是由腸道微生態改變、免疫調節異常、炎癥反應等多種因素誘發的慢性炎癥性腸道疾病，臨床表現為腹痛、腹瀉、便血等癥狀，病灶多位于大腸，可累及直腸及遠端結腸，并呈連續彌漫性分布，病情反復發作、遷延難愈，嚴重影響患者的身心健康［1－2］。人體腸道內存在種類繁多、數量巨大的細菌群體，在正確情況下參與腸道內分解、代謝，維持腸道內免疫系統的穩定［3］。研究表明，人體腸道菌群發生失衡，腸道細菌出現移位，進入人體微循環，誘發全身炎性反應和自身免疫異常，造成級聯性免疫反應細胞凋亡，致使炎癥持續反復發作，惡化病情［4］。經大量研究證實，機體免疫系統失衡、腸道菌群紊亂及細胞炎性反應是誘發UC的關鍵病理過程，也是UC反復發作、甚至炎癌轉化的重要機制［5－7］。徐寶琪等［7］研究表明，UC患者不同病情階段，其機體炎癥反應、免疫球蛋白水平及與腸道菌群數量也不盡相同。本研究通過檢測不同發病狀態UC患者的血清炎癥因子、免疫球蛋白及腸道菌群變化，進一步分析其相關性，為UC的臨床治療提供參考，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年6月至2020年5月我院收治的UC患者90例作為研究對象。診斷標準：參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018年）》進行診斷［8］；（1）有腹痛、腹瀉及黏液膿血便，呈持續、反復發作狀態；（2）結腸鏡下見黏膜血管紋理模糊或紊亂、充血、水腫，有膿性分泌物附著，病變處見明顯多發性潰瘍或彌漫性糜爛。納入標準：（1）均經病史、臨床癥狀、電子腸鏡及病理組織學確診，符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018年）》中UC的診斷標準；（2）病程＞4周；（3）近1個月未接受激素、益生菌、抗菌藥物及免疫抑制劑等藥物治療；（4）年齡18～80歲；（5）臨床診療資料完整。排除標準：（1）伴自身免疫性疾病者；（2）伴血液系統疾病者；（3）伴慢性肝腎疾病者；（4）伴嚴重心、腦、肺疾病者；（5）伴有克羅恩病等其他腸道疾病者；（6）伴有細菌型痢疾、腸結核等感染性結腸炎者；（7）存在精神疾病或意識障礙者；（8）入組前1個月有益生元、膳食纖維等攝入史者；（9）存在腸癌家族史者；（10）妊娠期、哺乳期婦女；（11）中途退出研究者。根據患者不同發病狀態，將其分為急性組（n＝30）、慢性復發組（n＝30）、慢性持續組（n＝30），另取同時間段內健康體檢者30例為對照組。各組一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則，且已經我院醫院倫理委員會審批同意，患者或其家屬均已簽署知情同意書。

表1 各組一般資料比較 ±s

表1 各組一般資料比較 ±s

項目 例數 性別（例）男 女 年齡（歲） 病程（年）急性組30 17 13 42.34±8.49 2.43±0.61慢性復發組 30 16 14 43.48±7.20 2.47±0.55慢性持續組 30 15 15 42.95±9.11 2.49±0.59對照組 30 16 14 42.88±10.42 F／χ2值 0.628 1.432 0.851 P值0.311 0.076 0.127

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與預處理 采集各組受試者的清晨空腹狀態下的肘靜脈血8 mL置于10 mL EP管中，靜置30 min，經TDZ4－WS自動脫帽離心機（長沙維爾康湘鷹離心機有限公司）離心15 min，離心半徑為11 cm，速度為3 000 r／min，分離上層血清置于5 mL EP管中，置于－70℃冰箱中保持待檢。采集各組受試者的新鮮糞便標本1.5 g置于試劑瓶中，加入4.5 mL稀釋液稀釋，經MX－S型旋渦混勻儀（美國scilogex公司）在3 000 r／min速度下震蕩1 min，稀釋10倍后平均置于不同試劑瓶中，取10μL接種于培養基中置于30℃環境下保存待檢，培養基購自上海中信國建藥業股份有限公司。

1.2.2 血清炎癥因子檢測 采用酶連免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測各組受試者的炎癥因子基質金屬蛋白酶－1（matrix metalloproteinase 1，MMP－1）、轉化生長因子β（transforming growth factor beta，TGF－β）、高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）、β干擾素（interferon－β，IFN－β）、可溶性白細胞介素－2受體（soluble interleukin－2 receptor，sIL－2R）水平，采用美國Molecular Devices Flexstation 3酶標儀（美國RD公司），ELISA試劑盒均購自上海森雄生物技術公司，檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 血清免疫球蛋白檢測 采用免疫比濁法檢測各組血清免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）水平，所用儀器為Array 360 System血清免疫球蛋白分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司），使用儀器配套試劑盒，檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 腸道菌群檢測 培養2～3 d后，由檢驗科專業人員初篩后采用VITEK－2 Compact型全自動細菌鑒定儀對雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌、腸球菌給予活菌計數。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件，計數資料以例（%）表示，采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗；血清MMP－1、TGF－β、HMGB1等計量資料以±s表示，經正態性檢驗與方差齊性檢驗后正態分布且方差齊性的計量資料，兩組間比較行重復測量方差分析，多組比較行單因素方差分析，采用Pearson檢驗分析患者血清炎癥因子與免疫球蛋白與腸道菌群的相關性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同發病狀態UC患者與對照組血清炎癥因子水平比較 UC患者血清MMP－1、TGF－β、HMGB1、sIL－2R水平均明顯高于對照組，IFN－β水平明顯低于對照組；急性組患者血清MMP－1、TGF－β、HMGB1、sIL－2R水平均明顯高于慢性復發組、慢性持續組，IFN－β水平明顯低于慢性復發組、慢性持續組；慢性復發組患者血清MMP－1、TGF－β、HMGB1、sIL－2R水平均明顯高于慢性持續組，IFN－β水平明顯低于慢性持續組（P＜0.05）。見表2。

表2 不同發病狀態UC患者與對照組血清炎癥因子水平比較 ±s

表2 不同發病狀態UC患者與對照組血清炎癥因子水平比較 ±s

注：*與對照組比較P＜0.05；△與慢性復發組比較P＜0.05；▲與慢性持續組比較P＜0.05

項目 例數 MMP－1（μg／L） TGF－β（pg／mL） HMGB1（ng／L） IFN－β（pg／mL） sIL－2R（U／mL）急性組 30 2.91±0.35*△▲ 25.38±6.92*△▲ 289.96±16.15*△▲ 30.33±4.21*△▲ 442.95±26.08*△▲慢性復發組 30 2.55±0.30*▲ 19.10±4.87*▲ 217.03±13.92*▲ 41.64±6.76*▲ 371.23±20.69*▲慢性持續組 30 2.12±0.27*△ 13.85±4.21*△ 152.54±12.68*△ 55.78±7.30*△ 353.52±16.75*△對照組 30 0.64±0.21 4.27±1.05 94.41±9.26 69.46±7.85 97.21±7.04 F值 24.026 29.931 57.070 35.183 62.235 P值0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 不同發病狀態UC患者與對照組血清免疫球蛋白水平比較 UC患者血清IgA、IgM水平均明顯低于對照組，急性組患者血清IgA、IgM水平均明顯低于慢性復發組、慢性持續組，慢性復發組患者血清IgA、IgM水平均明顯低于慢性持續組（P＜0.05）。見表3。

表3 不同發病狀態UC患者與對照組血清免疫球蛋白水平比較 （±s）g／L

表3 不同發病狀態UC患者與對照組血清免疫球蛋白水平比較 （±s）g／L

注：*與對照組比較P＜0.05；△與慢性復發組比較P＜0.05；▲與慢性持續組比較P＜0.05

項目 例數IgA IgM IgG急性組 30 2.01±0.17*△▲ 0.69±0.09*△▲ 12.66±0.64*△▲慢性復發組 30 2.23±0.21*▲ 0.84±0.11*▲ 12.61±0.72*▲慢性持續組 30 2.45±0.24*△ 0.98±0.13*△ 12.63±0.67*△對照組 30 2.57±0.16 1.48±0.15 13.13±0.93 F值 11.984 29.241 0.427 P值0.000 0.000 0.551

2.3 不同發病狀態UC患者與對照組腸道菌群比較 UC患者雙歧桿菌株數、乳桿菌株數明顯低于對照組，腸桿菌株數、腸球菌株數明顯高于對照組；急性組雙歧桿菌株數、乳桿菌株數明顯低于慢性復發組、慢性持續組，腸桿菌株數、腸球菌株數明顯高于慢性復發組、慢性持續組；慢性復發組雙歧桿菌株數、乳桿菌株數明顯低于慢性持續組，腸桿菌株數、腸球菌株數明顯高于慢性持續組（P＜0.05）。見表4。

表4 不同發病狀態UC患者與對照組腸道菌群比較 （±s）CFU／g

表4 不同發病狀態UC患者與對照組腸道菌群比較 （±s）CFU／g

注：*與對照組比較P＜0.05；△與慢性復發組比較P＜0.05；▲與慢性持續組比較P＜0.05

項目 例數 雙歧桿菌 乳桿菌 腸桿菌 腸球菌急性組 30 6.43±0.13*△▲ 7.03±0.15*△▲ 11.94±0.47*△▲ 8.64±0.32*△▲慢性復發組 30 7.63±0.17*▲ 7.82±0.19*▲ 10.48±0.32*▲ 8.05±0.24*▲慢性持續組 30 8.44±0.20*△ 8.37±0.22*△ 8.93±0.25*△ 7.57±0.19*△對照組 30 9.77±0.35 9.91±0.31 7.92±0.14 7.06±0.16 F值 13.714 10.085 9.792 8.814 P值0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 UC患者血清炎癥因子與免疫球蛋白與腸道菌群的相關性分析 Pearson相關性分析結果顯示：UC患者腸桿菌株數、腸球菌株數與血清MMP－1、TGF－β、HMGB1、sIL－2R 水平呈負相關（P＜0.05），與血清IFN－β水平呈正相關（P＜0.05）；血清IgA、IgM水平及雙歧桿菌株數、乳桿菌株數與血清MMP－1、TGF－β、HMGB1、sIL－2R水平呈正相關（P＜0.05），與血清IFN－β水平呈負相關（P＜0.05）。見表5。

表5 UC患者血清炎癥因子與免疫球蛋白與腸道菌群的相關性分析

3 討論

UC是由腸道細菌激活所形成的異常免疫反應，造成細胞炎性反應增強，當炎性反應過度超過機體組織耐受度，會對靶器官造成損傷，導致功能障礙，進而發生結腸炎性變化［9］。正常情況下人體腸道內存在大量不同腫瘤的細菌，主要集中在結腸和小腸末端，主要包括人體共生菌、機會致病菌、病原菌3種［10］。腸桿菌、腸球菌屬于機會致病菌，也被稱為非優勢菌群，通常情況下人體腸道內含量較少，當機體免疫功能下降時便會大量繁殖［11］。雙歧桿菌、乳桿菌屬于人體共生細菌，又被稱為腸道優勢菌群，具有調節免疫功能、分解、代謝等作用，能夠對抗機會致病菌對人體腸黏膜的侵入［12］。正常情況下人體腸道內腸道菌群按照一定的比例共存并形成腸道生態平衡，當腸道菌群失調，會導致機體出現異常免疫反應，使得機會致病菌大量繁殖并不斷增強侵襲力，破壞腸道黏膜屏障，引起機體腸黏膜反應［13］。本研究結果顯示，UC患者雙歧桿菌株數、乳桿菌株數明顯低于對照組，腸桿菌株數、腸球菌株數明顯高于對照組（P＜0.05）。提示，與健康人群相比，UC患者有嚴重腸道菌群失調，具體表現為機會致病菌腸桿菌和腸球菌計數明顯增加，而雙歧桿菌和乳桿菌等益生菌合成減少，是造成腸黏膜損傷的重要原因之一，與國內外報道［14－15］基本一致。筆者發現，UC患者中急性組、慢性復發組、慢性持續組雙歧桿菌株數、乳桿菌株數均依次降低，腸桿菌株數、腸球菌株數均依次升高（P＜0.05）。提示急性期UC患者的腸道菌群紊亂更嚴重，細菌感染風險更高，病情更為嚴重。

UC主要病理特征為腸黏膜慢性炎癥損傷，炎癥反應參與UC發生發展。正常情況下腸道內人體共生菌會通過激活胃腸道黏膜固有層巨噬細胞和樹突狀細胞上Toll受體以激活T淋巴細胞，產生抗炎因子以誘導機體對菌群免疫耐受［16］。sIL－2R是一種重要的免疫抑制劑，可中和活化T細胞周圍的白細胞介素－2，減弱機體的內分泌效應，抑制已活化的T細胞的克隆化擴增，發揮正反免疫調節作用［17］。HMGB1是一種重要的晚期致炎因子，受到TLR2調節，參與炎癥過程中的神經－內分泌免疫調節機制，可激活單核巨噬細胞并釋放多種促炎因子，發揮致炎作用［18］。IFN－β為典型的抑炎因子，可抑制單核巨噬細胞功能以發揮抗炎作用，其表達增加則可抑制機體炎癥反應過度加劇［19］。正確情況下人體中MMP－1含量極低，在各種刺激下可表達。加重黏膜組織損傷程度［20］。TGF－β是一種抑炎因子，可抑制促炎因子TNF－α、IFN－γ產生，在炎癥反應過程中發揮重要作用［21］。本研究顯示，UC患者血清MMP－1、TGF－β、HMGB1、sIL－2R水平均明顯高于對照組，IFN－β水平明顯低于對照組，且不同發病狀態UC患者之間存在明顯差異（P＜0.05），與既往的研究［22－23］一致，肯定了上述5種炎癥因子在UC發生、發展中的作用，提示炎癥因子水平表達變化可準確反映UC患者的發病狀態。

受腸道菌群失調及腸黏膜炎癥反應的影響，UC患者存在明顯腸道免疫功能異常。體液免疫是微創腸道菌群平衡的主要系統［24］。有學者證實，UC患者存在不同程度的體液免疫功能紊亂，血清免疫球蛋白IgA、IgM表達發生明顯變化［25－26］。本研究發現，UC患者血清IgA、IgM水平均明顯低于對照組，UC患者中急性組、慢性復發組、慢性持續組均依次降低升高（P＜0.05）。進一步證實UC患者存在明顯的體液免疫功能紊亂，以IgA、IgM為主，IgG無明顯變化，且隨著病情加重而明顯降低，這與彭林艷等［27］的研究結果一致。本研究結果顯示，UC患者腸桿菌株數、腸球菌株數與血清MMP－1、TGF－β、HMGB1、sIL－2R水平呈負相關（P＜0.05），與血清IFN－β水平呈正相關（P＜0.05）；血清IgA、IgM水平及雙歧桿菌株數、乳桿菌株數與血清MMP－1、TGF－β、HMGB1、sIL－2R 水平呈正相關（P＜0.05），與血清IFN－β水平呈負相關（P＜0.05）。提示，UC患者的炎癥狀態與免疫球蛋白及腸道菌群變化密切相關，UC患者的機體高炎癥狀態會加重腸道菌群失衡及免疫球蛋白功能異常，形成炎癥因子釋放—腸道菌群失調—免疫功能異常的惡性循環，進而不斷促進疾病惡化。

綜上所述，不同發病狀態UC患者的免疫球蛋白及腸道菌群不同，且與機體炎癥狀態具有一定相關性，可作為判斷UC患者病情的重要參考指標。