葡萄籽百香果啤酒發酵工藝優化

劉俐彤，汪洋帆，趙存朝，2，陶 亮，2*，田 洋，2，3

（1.云南農業大學 食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.國家辣木加工技術研發專業中心，云南 昆明 650201；3.食藥同源資源開發與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650201）

葡萄籽是葡萄加工過程中，種子、皮和莖榨汁后留下的固體殘渣[1]。其富含多酚[2]、維生素[3]、花青素[4]、不飽和脂肪酸[5]等營養素，且具有抗癌[6]、抗炎[7]、抗氧化[8]等功效。百香果（Passiflora edulisSims）又稱西番蓮、巴西果、雞蛋果，西番蓮科西番蓮屬的草質藤本植物，生長于熱帶地區，原產地為巴西。其口感酸甜清爽，香味濃郁，富含維生素[9]，類胡蘿卜素[10]以及酚類化合物[11]等多種營養素，有消除疲勞[12]、降脂降壓[13]、消炎去斑[14]、護肝養顏[15]等神奇功效。目前學術界對葡萄籽的功效研究較多，加工工藝方面稍顯欠缺，尚未達到提高葡萄廢棄物利用率的目標。當前市場上常見的百香果加工產品主要包括飲料[16]、果醬[17]、果凍[18]、果脯[19]等，國內百香果啤酒的需求主要依賴于進口，相關研究相對匱乏。

啤酒是以大麥芽和小麥芽為主要原料，加以啤酒花，經過液態糊化和糖化，液態發酵釀制而成的一類飲品。果啤是指將水果用于啤酒釀造而得到的一種含酒精飲料[20]，近年來，因其清爽口感和低酒精度在國內外廣受青睞。目前國內市場啤酒種類較為單一，大多以大麥為主要原料釀制啤酒[21]，不符合當下消費者多元化、品質化的消費需求。因此，國內外研究者將水果作為輔料加入啤酒中，一方面賦予啤酒水果獨特香氣，改善其直接食用的不悅口感[22]；另一方面使啤酒具有保健功效。由添加果蔬等原料所帶來的天然生物活性物質，可減少酒精對人體機體的氧化和毒性作用[23]。除此之外，果啤還具有豐富的功能成分，能降低膽固醇、抑制脂肪生成、促進新陳代謝，在利尿、激發肝功能活性、美容養顏和護膚方面也具極佳效果[24]。目前，市場上常見的果味啤酒多以櫻桃[25]、藍莓[26]、西瓜[27]等作為輔料釀造，鮮見葡萄籽與百香果為輔料制作的果啤。考慮到綜合利用葡萄籽及百香果，本試驗擬以二者相復配釀制啤酒，研發一種利口、營養、新穎的果味啤酒。利用單因素試驗考察混合主料（大麥芽、小麥與水）料液比、薩茲香型酒花添加量、混合輔料（葡萄籽、百香果與麥汁）料液比、初始pH值、酵母添加量和主發酵溫度等因素對葡萄籽百香果啤酒感官評分的影響，并通過響應面優化葡萄籽百香果啤酒發酵工藝條件，借此拓寬啤酒市場生產鏈，降低啤酒企業成本，提高果蔬的綜合利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大麥麥芽：市售；小麥、葡萄籽：沃爾瑪超市；百香果：云南德宏天佑科技開發有限責任公司；薩茲香型酒花、馬革努門苦型酒花：淄博塔斯曼釀酒原料有限公司；WB-06艾爾活性干酵母（干物質含量94.0%～96.5%，活細胞數＞6×109個/g）：費曼迪斯酵母有限公司；纖維素酶（酶活50U/mg）、果膠酶（酶活500 U/mg）：河南萬邦實業有限公司。

1.2 儀器與設備

HJJ-6數顯恒溫水浴鍋：常州華奧儀器制造有限公司；WT20002電子天平：杭州萬特衡器有限公司；2500Y粉碎機：永康市鉑歐五金制品有限公司；DPX-9162B-1恒溫培養箱：上海福瑪實驗設備有限公司；WZB數顯折光儀：上海儀電物理光學儀器有限公司；PAL-1糖度儀：日本ATAGO公司；J-001泡持杯：上海立昕國際貿易有限公司；Alpha Astree型電子舌系統：法國Alpha M.O.S.公司；PHS-25/3C酸度計：上海越平科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄籽百香果啤酒的加工工藝流程及操作要點

操作要點：

大麥芽、小麥粉碎：將大麥芽、小麥以質量比4∶1混合倒入對輥粉碎機中粉碎至皮破而不碎，作為主料混合物。

糖化：將粉碎大麥芽與小麥混合物以一定料液比加水分四階段糖化，第一階段邊投料邊攪拌，溫度為35 ℃，恒溫保持30 min；第二階段升溫至50 ℃，恒溫保持30 min；第三階段升溫至65 ℃，恒溫保持30 min（此階段結束進行碘試，若碘試合格進行下一階段，若不合格延長恒溫時間直至碘試合格）；第四階段升溫至78 ℃，糖化結束。

麥汁過濾：把78 ℃的熱水頂入過濾槽，以排出濾板及糟底內空氣，避免麥汁氧化。將糖化醪液泵入過濾槽之后，靜置20 min，分離凝固物。然后進行麥汁回流，以此加強麥汁的澄清度。過濾時觀察過濾槽中糖化醪的情況，當剛剛露出糟層的時候，加入洗糟水洗糟。

麥汁煮沸、添加酒花：麥汁煮沸至100 ℃后，加蓋避免其大量揮發，煮沸時間為45 min。麥汁煮沸時分2次添加酒花，第一次煮沸5 min后加入0.1%馬革努門苦型酒花，第二次煮沸30 min后加入一定量薩茲香型酒花，再繼續煮沸10 min后停止。

葡萄籽預處理：選擇顆粒飽滿、品質優良的葡萄籽投入潔凈的流動水中清洗干凈，在烘干箱105 ℃下烘干，打碎成粉，過100目不銹鋼回轉篩備用。

百香果汁制備：選取成熟度好、無病蟲害、無腐爛、無機械損傷的百香果，去皮取果肉與水1∶1打漿，添加0.1%的果膠酶和纖維素酶，45 ℃酶解2 h，過濾后得到澄清的百香果汁，冷藏備用。

輔料混合：添加葡萄籽（40 g/L）和百香果汁按一定料液比例混合后作為輔料混合物適量添加到麥汁中。

接種：稱取艾爾WB06型活性干酵母提前在25 ℃無菌水中以一定比例活化30 min 備用，接著輕輕攪拌30 min，將其添加到發酵罐中。

發酵：將制得的麥汁和輔料按一定比例混合后，攪拌均勻，在適宜的條件下進行主發酵。主發酵后期每日糖降小于0.3°Bx時進入后發酵，后發酵升溫至13 ℃以還原雙乙酰，當雙乙酰含量降至0.1 mg/L以下時，即可過濾，得到葡萄籽百香果啤酒。

1.3.3 葡萄籽百香果啤酒發酵工藝優化

單因素試驗：以感官評分及酒精度為評價指標，考察混合主料（大麥芽、小麥與水）料液比（1.0∶3.0、1.0∶3.5、1.0∶4.0、1.0∶4.5、1.0∶5.0（kg∶L））、薩茲香型酒花添加量（0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L）、百香果汁添加量（40 g/L、60 g/L、80 g/L、100 g/L、120 g/L）、混合輔料（葡萄籽、百香果汁與麥汁）料液比（0.5∶1.0、1.0∶1.0、2.0∶1.0、3.0∶1.1、4.0∶1.0（kg∶L））、初始pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）、酵母添加量（0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）、主發酵溫度（16 ℃、18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃）對葡萄籽百香果啤酒品質影響。

響應面試驗[28]：以感官評分（Y）為響應值，選取混合主料料液比（X1）、薩茲香型酒花添加量（X2）、混合輔料料液比（X3）、主發酵溫度（X4）4個因素，利用Box-Behnken試驗設計進行4因素3水平試驗，優化葡萄籽百香果啤酒發酵工藝。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 葡萄籽百香果啤酒發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for grape seed and passion fruit beer fermentation process optimization

1.3.4 葡萄籽百香果啤酒感官評價

葡萄籽百香果啤酒的感官評定標準根據國標GB/T 4927—2008《啤酒》中的相關方法進行。由10名有一定品評經驗的專業人員組成評定小組，分別從色澤（20分）、口感（40分）、氣味（30分）、泡沫性能（10分）四項指標對葡萄籽百香果啤酒采用百分制打分。其感官評分標準見表2。

表2 葡萄籽百香果啤酒感官評分標準Table 2 Sensory scoring standards of grape seed and passion fruit beer

1.3.5 葡萄籽百香果啤酒產品理化及衛生指標測定

麥汁濃度測定：手持糖度儀；pH值測定：酸度計；酒精度的測定：參考國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；總酸的測定：參考國標GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》；細菌菌落計數：平板計數法；大腸菌群檢測：最大或然數計數（most probable number，MPN）法。

葡萄籽百香果啤酒泡持性測定：將密封酒樣緩慢打開，避免酒樣有晃動，并沿杯口中心線勻速倒入泡持杯中，直到酒樣泡沫即將溢出杯口時停止。同時立即用秒表對啤酒泡沫消減時間開始計時，直至酒樣泡沫全部消失停止計時。整個過程需對酒樣泡沫大小、細膩程度和泡沫上升情況進行記錄，結果以整數表示，平行測定3次。

葡萄籽百香果啤酒滋味測定：取40 mL葡萄籽百香果啤酒，過濾后加入電子舌專用樣品杯中。電子舌由8根化學傳感器組成，能對酸味、咸味、鮮味、甜味、苦味、苦味回味、澀味及澀味回味具有專一響應性。數據采集前，對電子舌系統會進行活化、自檢、校準等步驟。以Ag/AgCl作為參比電極，在室溫條件下（25 ℃）進行數據采集，采集時間為120s、平行測定3次。

1.3.6 數據處理

采用Excel 2013、SPSS 19.0 統計軟件對試驗數據進行分析，利用Design-Expert 8.0.6 進行響應面分析，結果以均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 混合主料料液比的確定

由圖1可知，混合主料料液比（大麥芽、小麥與水）在1.0∶3.0～1.0∶5.0（kg∶L）范圍內，葡萄籽百香果啤酒酒精度呈持續下降趨勢，原因可能是大麥芽與小麥混合主料的濃度降低，氮源和碳源含量減少，導致乙醇生成量減少，酒精度降低。酒精度在混合主料料液比為1.0∶3.0（kg∶L）時最高，為5.6% vol，但口感過于粗糙，酒香與麥芽香不平衡。感官評分呈先上升后下降的趨勢，當混合主料料液比在1.0∶3.0～1.0∶4.0（kg∶L）時，感官評分隨之增大；當混合主料料液比為1.0∶4.0（kg∶L）時，感官評分達到最高值，為（85.2±1.6）分；當混合主料料液比在1.0∶4.0～1.0∶5.0（kg∶L）時，感官評分呈下降趨勢。混合主料料液比為1.0∶4.0（kg∶L）時，酒樣麥芽香味突出，醇正濃厚，酒體協調無異味，因此，最佳混合主料料液比為1.0∶4.0（kg∶L）。

圖1 混合主料料液比對葡萄籽百香果啤酒品質的影響Fig.1 Effect of solid and liquid ratio of mixed main materials on the quality of grape seed and passion fruit beer

2.1.2 薩茲香型酒花添加量的確定

由圖2可知，隨薩茲香型酒花添加量在0.2%～1.0%范圍內的增加，葡萄籽百香果啤酒感官評分、酒精度呈現先增加后降低的趨勢。薩茲香型酒花添加量達到0.6 g/L時，酒精度為最大值4.4% vol；薩茲香型酒花添加量為0.4 g/L時，感官評分達到最大值，為（86.1±0.98）分。薩茲香型酒花添加量過低時，口感偏甜，不能平衡麥芽甜味，泡沫穩定性不佳，抑制雜菌效果較差[29]；當其添加量過高，苦味值增加。薩茲香型酒花添加量為0.4 g/L時，酒樣口感豐富，口味醇正，風味穩定，感官評分最高。因此，選擇最佳薩茲香型酒花添加量為0.4 g/L。

圖2 薩茲香型酒花添加量對葡萄籽百香果啤酒品質的影響Fig.2 Effect of Saze type hops addition on the quality of grape seed and passion fruit beer

2.1.3 百香果汁添加量的確定

由圖3可知，當百香果汁添加量在40～120 g/L范圍內增加時，葡萄籽百香果啤酒酒精度變化不明顯，而感官評分呈先增加后下降趨勢。當百香果汁添加量為80 g/L時，二者均達到最大值，分別為4.7% vol和（86±0.75）分。當百香果汁添加量較低時，百香果味不足，口感層次豐富度低；若其添加量過高，導致葡萄籽百香果啤酒整體口感偏酸，掩蓋了啤酒本身麥芽香味。當百香果汁添加量為80 g/L時，果味突出，口感協調，麥芽香濃郁。因此，選擇最佳百香果汁添加量為80 g/L。

圖3 百香果汁添加量對葡萄籽百香果啤酒品質的影響Fig.3 Effect of passion fruit juice addition on the quality of grape seed and passion fruit beer

2.1.4 混合輔料料液比的確定

由圖4可知，隨混合輔料（葡萄籽、百香果汁∶麥汁）料液比的增加，葡萄籽百香果啤酒酒精度呈先增加后降低的趨勢，可能是因為溶液總濃度的提升導致體系的不均勻，過高的濃度以及輔料帶來的其余糖度也能對酵母菌及其他有益菌有抑菌作用，導致酵母酒精發酵降低，酒精度降低。感官評分隨輔料比例的增加呈先下降后上升繼而下降的趨勢。混合輔料料液比為0.5∶1.0（kg∶L）和3.0∶1.0（kg∶L）時，葡萄籽百香果啤酒感官評分均較高，分別為（83±1.3）分、（86±0.94）分；混合輔料料液比為2.0∶1.0（kg∶L）時酒精度達到最高，為4.6% vol。混合輔料料液比為0.5∶1.0（kg∶L）時，葡萄籽與百香果汁添加量較少，二者成分溶解低，呈味及功效作用較小；而混合輔料料液比過高，易造成啤酒苦澀味增加。混合輔料料液比為3.0∶1.0（kg∶L）時，酒樣口感飽滿豐富，口味醇正，酒體協調無異味，感官評分最高。因此，最佳混合輔料料液比為3.0∶1.0（kg∶L）。

圖4 混合輔料料液比對葡萄籽百香果啤酒品質的影響Fig.4 Effect of solid and liquid ratio of mixed auxiliary materials on the quality of grape seed and passion fruit beer

2.1.5 酵母添加量的確定

由圖5可知，隨著酵母添加量的增加，葡萄籽百香果啤酒感官評分、酒精度均呈現先上升后下降的趨勢。酵母添加量較低時，可能會減少啤酒風味和香氣的代謝副產物的生成，致使口感寡淡，營養成分損失；酵母添加過高可能造成異味，葡萄籽與百香果汁混合香氣不足，感官品質下降。當酵母添加量為0.10%時，葡萄籽百香果啤酒酒精度、感官評分最高，分別為4.5% vol和（84±1.13）分，酒樣有明顯的酒香、麥香，口感豐富飽滿。因此，選擇最佳酵母添加量為0.10%。

圖5 酵母添加量對葡萄籽百香果啤酒品質的影響Fig.5 Effect of yeast addition on the quality of grape seed passion fruit beer

2.1.6 初始pH值的確定

由圖6可知，隨初始pH值在3.5～5.5范圍內的增加，葡萄籽百香果啤酒感官評分呈先上升后下降趨勢，當初始pH值為5.0時感官評分達到最大值，為（83.4±0.43）分。葡萄籽百香果啤酒酒精度隨初始pH值增加并無明顯變化。pH的影響多集中于影響菌群生長的遲滯期；影響發酵時間的長短；影響代謝底物和終產物的種類和比例；影響膠體穩定性；對于酒精度的影響較小。當初始pH值較低時，葡萄籽百香果啤酒偏酸，發酵周期較長；初始pH值過高，導致葡萄籽百香果啤酒整體口感偏甜，無法突出果味。pH值控制在5.2～5.6也可以減少二甲基硫（dimethyl sulphide，DMS）的生成量[30]，以保證啤酒的風味質量。當初始pH值為5.0時，葡萄籽百香果啤酒酸甜適中，酒體平衡有層次感。因此，最佳初始pH值為5.0。

圖6 初始pH值對葡萄籽百香果啤酒品質的影響Fig.6 Effect of initial pH on the quality of grape seed passion fruit beer

2.1.7 主發酵溫度的確定

由圖7可知，葡萄籽百香果啤酒感官評分隨主發酵溫度在16～24 ℃范圍內的升高呈先上升后下降趨勢。在主發酵溫度為20 ℃時，感官評分最大，為（85.2±1.2）分；當主發酵溫度達到22 ℃時，酒精度最大，為4.2% vol。主發酵溫度較低時，葡萄籽百香果啤酒口味寡淡，發酵周期長；主發酵溫度的提高雖可縮短發酵周期，但酵母將產生大量的酯類、高級醇等揮發性物質，嚴重影響啤酒的風味[31]。當主發酵溫度為20 ℃時，葡萄籽百香果啤酒酒體圓滑爽口，平衡有層次感。因此，最佳主發酵溫度為20 ℃。

圖7 主發酵溫度對葡萄籽百香果啤酒品質的影響Fig.7 Effect of main fermentation temperature on the quality of grape seed and passion fruit beer

2.2 葡萄籽百香果啤酒發酵工藝優化響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗優化葡萄籽百香果啤酒發酵條件

基于Box-Behnken試驗設計，在單因素試驗的基礎上，利用Design Expert 8.0.6軟件進行分析，選取混合主料料液比（X1）、薩茲香型酒花添加量（X2）、混合輔料料液比（X3）、主發酵溫度（X4）4個因素，以感官評分（Y）為響應值，采用響應面試驗對葡萄籽百香果啤酒加工工藝進行優化。試驗設計及結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiments

2.2.2 模型的建立及顯著性的檢驗

將所得試驗數據利用Design Expert 8.0.6軟件對各因素進行多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：Y=85.80+2.33X1+1.25X2-1.25X3+6.17X4-2.00X1X2+0.25X1X3+1.25X1X4-0.25X2X3-0.50X2X4+0.25X3X4-8.15X12-6.78X22-7.02X32-7.15X42

利用Design Expert 8.0.6軟件對表3數據進行分析方差分析，結果見表4。

表4 擬合二次多項式模型的方差分析Table 4 Variance analysis of fitting quadratic polynomial model

續表

由表4可知，該回歸模型的P值＜0.000 1，說明回歸模型的影響達到極顯著水平（P＜0.01）；感官評分回歸模型失擬性檢驗P=0.822 4＞0.05，表明二次回歸模型與實際試驗擬合性充分，模型失擬項不顯著，表明此模型可用于試驗擬合。模型的決定系數R2=0.968 7，表明該模型能解析96.87%的響應變化，存在3.13%的總變異，說明該模型擬合程度相對較好，試驗誤差較小。校正決定系數R2Adj=0.9375，說明該模型響應值的變化有93.75%來源于所選變量。響應值Y的變異系數（coefficient of variation，CV）與試驗精確度和重復性成反比，其變異系數CV=2.49%＜5%，說明試驗的精確度和重復性較高，且可信度較高。

由回歸系數顯著性表明，在所取因素水平范圍內，各因素對感官評分的影響順序為：X4（主發酵溫度）＞X1（混合主料料液比）＞X2（薩茲香型酒花添加量）=X3（混合輔料料液比）。

2.2.3 響應面試驗優化葡萄籽百香果啤酒發酵工藝

由圖8可知，響應面的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀地反映混合主料料液比（X1）、薩茲香型酒花添加量（X2）、混合輔料料液比（X3）、主發酵溫度（X4）之間交互作用對葡萄籽百香果啤酒感官評分的影響。曲面圖弧度變化越陡峭，等高線越密集且呈橢圓形或馬鞍形時，表示兩因素之間交互作用越顯著。由表3可知，P=0.047 3＜0.05，交互項X1X2的曲面傾斜度較大，坡度較陡，且等高線呈橢圓形，較密集，說明其影響極顯著（P＜0.01），反之，X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4影響不顯著，各因素間交互作用對葡萄籽百香果啤酒的感官評分的影響大小依次為X1X2＞X1X4＞X2X4＞X1X3=X2X3=X3X4。

圖8 各因素交互作用對葡萄籽百香果啤酒感官品質影響的響應面及等高線Fig.8 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory quality of grape seed and passion fruit beer

2.2.4 葡萄籽百香果啤酒最佳發酵工藝條件的確定和驗證試驗

通過Design Expert 8.0.6分析得到葡萄籽百香果啤酒的最佳釀造工藝條件為混合主料料液比1.0∶4.2（kg∶L），薩茲香型酒花添加量0.62 g/L，混合輔料料液比2.11∶1.00（kg∶L），主發酵溫度21.77 ℃。在此優化條件下，葡萄籽百香果啤酒感官評分理論值為88.44分。考慮到實際操作的可行性，將發酵工藝參數調整為混合主料料液比1.0∶4.0（kg∶L），薩茲香型酒花添加量0.6 g/L，混合輔料料液比2.0∶1.0（kg∶L），發酵溫度21 ℃。在上述最佳條件下進行驗證試驗，得到葡萄籽百香果啤酒感官評分實際值為（86.45±1.99）分，與理論值接近，具有一定的實際應用價值。

2.2.5 葡萄籽百香果啤酒理化和衛生指標

由表5可知，啤酒的理化指標和衛生指標均符合國家相關標準。成品葡萄籽百香果啤酒顏色呈琥珀色，酒樣澄清無異物；香氣富有層次感，麥香和百香果香味相互突顯，泡沫潔白細膩；口感酸甜可口，酒體豐滿，是一款安全衛生的烈性啤酒。

表5 葡萄籽百香果啤酒理化和衛生指標檢測結果Table 5 Test results of physicochemical and hygienic indexes of grape seed and passion fruit beer

2.2.6 葡萄籽百香果啤酒味覺成分分析

啤酒電子舌分析結果見表6和圖9。由表6和圖9可知，電子舌的8個傳感器對葡萄籽百香果啤酒的滋味均能做出不同程度的響應。與燕京啤酒進行比對，葡萄籽百香果啤酒主要包括酸味、咸味、苦味、鮮味、甜味，其中酸味、鮮味和甜味的響應值最強，澀味的響應值最弱，說明葡萄籽百香果啤酒的整體滋味偏甜和鮮，口感酸甜可口，豐富度飽滿。結果表明，電子舌與評酒人員感官評分結果基本一致。

表6 葡萄籽百香果啤酒味覺強度指標響應值Table 6 Response value of taste intensity index of grape seed and passion fruit beer

圖9 葡萄籽百香果啤酒味覺強度指標雷達圖Fig.9 Radar chart of taste intensity index of grape seed and passion fruit beer

3 結論

在葡萄籽百香果果酒發酵過程中，混合主料料液比、薩茲香型酒花添加量、混合輔料料液比、主發酵溫度對葡萄籽百香果啤酒感官評分均有顯著影響，通過響應面優化得葡萄籽百香果啤酒的最佳工藝條件為：混合主料料液比1.0∶4.0（kg∶L），百香果汁添加量80 g/L，薩茲香型酒花添加量0.6 g/L，酵母添加量0.10%，混合輔料料液比2.0∶1.0（kg∶L），初始pH值5.0，主發酵溫度21 ℃。此優化條件下，葡萄籽百香果啤酒感官評分為88.44分。本研究將為葡萄籽和百香果產業的深加工提供了依據，提高葡萄籽和百香果的經濟價值，豐富了我國啤酒市場，為果味啤酒的開發利用提供基礎。