NLRP3炎癥小體在缺血性腦損傷中作用的研究進展

田明巧，官勁帆，安露露 綜述 韓江全 審校

遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院神經內科，廣東 珠海 519100

目前腦卒中已經是我國致死率第一位的疾病，與缺血性心臟病、支氣管肺癌并稱為我國健康的三大殺手[1]，而腦卒中的患者中大約70%為腦梗死[2]。腦梗死發生后，除超早期的血管內治療外，尚無其他明顯有效的治療措施，因此，發現和尋找治療腦梗死的新靶點仍是腦梗死防治研究中的重點。炎癥小體是一種大分子復合物，可在感受到細胞內各種刺激后進行組裝，炎性小體的組裝引起天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)激活，從而促進具有生物活性的白細胞介素1β(IL-1β)和白細胞介素18(IL-18)的分泌，并誘發稱為焦亡的炎性細胞死亡[3]。炎性小體的效應器有效地驅動免疫反應，并介導腦梗死發生后無菌性炎癥反應過程的控制。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3[nucleotide binding and oligomerization(NOD)-like receptor pyrin domain containing-3，NLRP3]炎癥小體是最早發現的炎癥小體之一，研究表明通過抑制NLRP3炎癥小體激活可以減輕梗死后神經細胞的缺血性損傷[4]，因此對NLRP3炎癥小體在缺血性腦損傷的作用及其機制做一綜述。

1 NLRP3的概述

免疫系統是宿主防御的重要組成，種系編碼的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)參與激活免疫系統，以應對入侵的病原體、死亡細胞或環境刺激物的有害刺激[5]。PRRs識別由內源性應激產生的獨特微生物成分，稱為病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)，并觸發下游的炎癥通路，以消除微生物感染和修復受損組織[6]。炎癥小體是一組激活炎癥性Caspase-1的胞內多聚蛋白復合物，由其敏感蛋白(一種PRR)定義，PRR寡聚形成親Caspase-1的活化平臺，以應對DAMPs或PAMPs。已有4個PRRs成員被明確證實可以形成炎性小體：NLRP1、NLRP3和NLRC4，以及黑素瘤缺乏因子2(absent-in-melanoma2，AIM2)[7-8]。

2002年MARTINON的團隊最早發表了關于NLRP3炎癥小體的概念，當時他們揭示了組織損傷、先天免疫過程和Caspase-1依賴性反應之間的關鍵聯系[9]。NLRP3炎癥小體通常有三種主要成分：NLRP3受體蛋白、Caspase-1酶和促進兩者相互作用的凋亡相關斑點樣蛋白[apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain(CARD)，ASC]。NLRP3是最典型的炎癥小體傳感器分子，由人類的22個基因家族編碼，是NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)家族的三方蛋白質，包含一個氨基末端的熱蛋白結構域(pyrin domain，PYD)、一個核苷酸結合的中央NACHT結構域和一個亮氨酸重復序列(leucine-rich repeat，LRR)[10]。ASC蛋白由PYD和羧基末端的CARD組成，相比之下，Caspase-1具有一個CARD域、一個中央大催化域和一個羧基末端的小催化亞基域，NLR蛋白的LRR結構域被認為能夠抑制炎性體的自激活[11-12]。在穩定狀態下，LRR結構域折回到傳感器分子的NACHT結構域上，該結構被認為具有NLRP3活性基礎的三磷酸腺苷酶功能。在適當的刺激進行感測和激活后NLRP3發生寡聚，并通過兩種蛋白PYD之間的相互作用進一步募集ASC，促使螺旋形ASC細絲形成，并組裝成一個大的ASC斑點結構[13-14]。在形成ASC斑點后，Caspase-1通過同型CARD-CARD相互作用被募集，從而使鄰近誘導的Caspase-1自我切割，并通過在p20-p10接頭區域的切割而激活[15]。活躍的Caspase-1誘導IL-1β和IL-18的失活前體形式蛋白水解成為它們的生物學活性形式，Caspase-1也將消皮素D裂解成其活性N端片段，從而誘導一種稱為焦亡的炎癥形式的細胞死亡[16-17]。

2 NLRP3炎癥小體在缺血性腦損傷中的作用

腦梗死是一種急性疾病，其特征是流向腦組織的血流量突然減少，導致神經功能受損或喪失。腦梗死后，多種機制參與缺血性腦損傷，包括生物能衰竭、細胞穩態喪失、細胞內鈣水平升高、活性氧(reactive oxygen species，ROS)介導的毒性、花生四烯酸產物的產生、神經元和神經膠質細胞的活化、血腦屏障(blood brain barrier，BBB)破壞和白細胞浸潤等[18]。其中炎癥反應是缺血性損傷的重要環節，在腦梗死的整體發病機理中起重要作用，最初是導致缺血性腦損傷，然后是組織再生。最近的研究提供了新的炎癥機制的思路，神經元和神經膠質細胞質膜上的PRRs激活某些炎癥信號通路，促使腦梗死缺血核心帶壞死細胞釋放內源性DAMPs的反應，導致促炎性細胞因子的產生增加和NLRP3炎癥小體介導的神經元和神經膠質細胞死亡[19]。在小鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型中，缺血側腦組織NLRP3的mRNA和蛋白表達顯著上調，持續升高超過48 h，NLRP3表達增加的同時又進一步加重腦缺血損傷，而給予免疫球蛋白可抑制NLRP3活化發揮抗腦缺血性損傷作用[20]。NLRP3的活化不僅存在于神經元中，也存在于星形膠質細胞和小膠質細胞中，減少NLRP3的活化，能抑制星形膠質和小膠質細胞的激活，降低促炎因子的水平，從而減輕炎癥反應[21]。此外，NLRP3炎癥小體介導腦缺血的BBB損傷，通過抑制NLRP3炎癥小體能減輕腦缺血后BBB的損傷，這與增強緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達有關[22]。新近大量的研究證實，通過抑制NLRP3的活化可改善缺氧缺血細胞模型和腦梗死動物模型中的缺血性損傷和神經血管并發癥[23]。

促進IL-1β和IL-18的釋放以及誘導細胞焦亡是NLRP3炎癥小體參與機體糖尿病、動脈粥樣硬化和心室重塑等多種病理過程的重要機制，激活NLRP3炎癥小體加劇腦缺血損傷也與促進IL-1β和IL-18釋放以及細胞焦亡密切相關。IL-1β和IL-18是由多種細胞產生并作用于多種細胞的一類細胞因子，在炎癥反應中起重要作用，它可能是大腦的一線免疫防御，主要由人類的巨噬細胞和單核細胞分泌，并加速與自身免疫、炎癥和感染相關的各種適應性和先天免疫過程[24-26]。許多神經系統疾病共有的細胞損傷機制均與IL-1β和IL-18的有害性相關，缺血性腦損傷發生后IL-1β和IL-18介導谷氨酸興奮毒性與氧化應激反應，從而破壞細胞外基質和BBB，加劇腦水腫，最終導致神經元和膠質細胞死亡[19]。NLRP3炎癥小體在腦梗死發生后被迅速激活，通過上調caspase-1水平增強IL-1β和IL-18的表達，使梗死體積增大和加重缺血性腦損傷[26]。FANN團隊最新研究中，通過體內實驗誘導小鼠腦缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷模型，在體外實驗中對原代皮質神經元細胞進行氧葡萄糖剝奪/復氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGDR)模擬I/R，并同時對缺血側腦組織和OGDR皮質神經元細胞中NLRP3炎癥小體的蛋白水平及炎性成分進行分析，發現腦組織及神經元細胞中NLRP3蛋白以及IL-1β、IL-18的水平顯著增加，而利用Caspase-1抑制劑治療可在實驗性I/R模型中通過下調IL-1β和IL-18的水平保護體外培養的皮質神經元細胞[27]。

細胞焦亡是依賴于炎癥反應的程序性細胞死亡的一種模式，對于體內清除病原體是必不可少的，其兩個標志性特征是DNA損傷和膜破裂，前者類似于細胞凋亡，而后者則完全相反[4]。當機體受到毒性刺激時，有害的胞內和胞外信號通過依賴于Caspase-1的經典焦亡途徑誘導胞漿內炎性成分的形成，其主要與非感染性炎癥有關，腦梗死屬于典型的非感染性炎癥[28]，因此Caspase-1在腦梗死后的細胞焦亡過程中具有重要作用。Caspase-1在神經元、活化的星形膠質細胞及小膠質細胞中表達，并且通過抑制Caspase-1表達能使神經細胞免受腦梗死的缺血性損傷[29]。細胞焦亡主要發生于腦梗死缺血半暗帶，缺血核心區域的壞死細胞分泌能引發炎癥介質的危險信號DAMPs，從而加劇細胞腫脹，加速腦細胞死亡。研究發現，在SD大鼠I/R模型中，通過檢測缺血海馬及皮質區細胞焦亡，其結果顯示缺血側在造模后12 h和24 h兩個時間點細胞焦亡陽性率最高，證明細胞焦亡在I/R后神經細胞損傷中具有重要作用[30]。而且在I/R的體內和體外模型中，NLRP3炎癥小體表達顯著升高并誘導神經元細胞焦亡增加，進一步加重神經功能損傷，而靶向抑制NLRP3炎癥小體活化后，神經元細胞的焦亡表現明顯改善[31]?？傊琋LRP3炎癥小體主要是通過增加下游的IL-1β和IL-18釋放以及誘導神經細胞焦亡，從而加劇缺血性腦損傷后炎癥反應、加速BBB破壞以及促進氧化應激反應的發生等病理過程的發展。

3 缺血性腦損傷中NLRP3炎癥小體激活的潛在調控機制

3.1 嘌呤能離子通道型7受體(purinergic ligand-gated ion-channel7receptor，P2X7R) P2X7R是嘌呤能2型受體家族的配體門控離子通道，由嘌呤2型G蛋白偶聯受體(P2YG)和嘌呤2型X受體(P2X)7組成，能被細胞外ATP(extracellular ATP，eATP)封閉，允許陽離子非選擇性地通過，而毫摩爾濃度的eATP持續刺激其觸發非選擇性孔形成，從而允許高達900 Da的分子通過，Na+和Ca2+內流以及K+外排導致細胞離子穩態的變化；此外，P2X7R可以通過其固有的成孔能力與泛連接蛋白半通道的結合來引發大規模細胞內ATP的釋放，從而促進嘌呤能信號傳導和炎癥反應[32]。細胞內離子改變在NLRP3激活中的重要作用已經得到支持，P2X7R和NLRP3炎癥小體能在分離的細胞質下相互作用，細胞膜通道的開放導致胞內K+減少，增強了NLRP3與NEK7蛋白的相互作用，而NEK7蛋白是不可缺少的NLRP3激活劑，除此之外，P2X7R刺激還產生了其他觸發NLRP3活性的物質，如ROS和組織蛋白酶[33]。NLRP3炎癥小體是P2X7R調節腦損傷后炎癥潛在的信號分子，通過激動P2X7R可以使NLRP3激活促進腦組織中的炎癥反應[34]。還有研究表明，在小鼠MCAO模型和缺血缺氧體外模型中進行蛋白印跡分析，發現缺血腦組織中P2X7R以及NLRP3炎癥小體成分顯著增加，利用P2X7R拮抗劑BBG阻斷P2X7R可以減輕神經系統損傷以及抑制梗死后缺血側神經元凋亡，并保護培養的皮質神經元免受缺血缺氧誘導的體外損傷，同時缺血側腦組織中NLRP3、ASC和Caspase-1的表達顯著降低，由此推測該神經保護作用與拮抗P2X7R從而減少NLRP3炎癥小體活化密切相關[35]。

3.2 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) MAPK是一組能被不同的細胞外刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，MAPK家族由細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和P38蛋白三個亞族組成，各種應激因素刺激MAPK途徑通過G蛋白偶聯受體激活三層Raf/MEK/ERK級聯反應，而且應激激活的MAPK在能擴大炎癥的級聯反應加重組織損傷[36]。最新研究發現，P38 MAPK激活可促進巨噬細胞中NLRP3炎性小體多個方面的功能，包括前體IL-1β的轉錄啟動、NLRP3受體合成、NLRP3炎性小體復合物的激活以及分泌的IL-1β的下游炎癥信號的傳導[37]。腦梗死發生后，缺血側神經元中發生MAPK信號的激活，其不利于神經元的存活，并且MAPK的藥理學抑制作用可保護神經元在缺血條件下免受凋亡性細胞死亡。通過證實，在局部缺血條件下，MAPK介導的神經損傷作用與NLRP3炎癥小體的激活有關，在神經元中抑制MAPK的表達可以降低外周免疫細胞中NLRP3蛋白活化從而改善缺血性神經細胞死亡[20]。除此之外，炎癥反應是缺血性腦損傷BBB破壞的主要原因，BBB的破壞進一步引起繼發性損傷和功能障礙，增加出血的風險并限制組織的恢復，但是通過抑制MAPK減少NLRP3炎癥小體的表達可以使腦缺血后BBB的分解得到改善[22]，從而改善腦缺血后神經功能損傷。

3.3 核因子E2相關因子-2(Nrf2)/抗氧化反應元件(ARE)信號通路 Nrf2/ARE信號通路在細胞抗氧化和抗炎反應中起著至關重要的作用，一般情況下，Nrf2被Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Keap1)隔離在細胞質中，Keap1被激活后釋放Nrf2并轉移到細胞核中，在其中與ARE結合從而促進下游靶基因如醌氧化還原酶(NQO1)的轉錄。Nrf2/ARE調節細胞抗氧化和抗炎防御系統中涉及的200多種內源性保護基因，包括Ⅱ期抗氧化劑/排毒酶基因以及抗炎共刺激基因和分子伴侶基因，這些保護性基因在提高組織抗氧化能力以及發揮抗毒素、抗炎和抗凋亡作用中起著重要作用[38]。Nrf2/ARE的抗炎作用與在炎癥反應過程中抑制NLRP3炎癥小體激活密切相關，通過依賴Nrf2的方式激活ARE來誘導NQO1表達，可以抑制巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的活化、Caspase-1裂解和IL-1β生成[39]。氧化應激是炎癥反應的常見特征，在缺血性腦損傷病理過程中起關鍵作用，作為靶向Nrf2/ARE的基因，NQO1被認為是可調節的ROS產生的誘導性細胞保護基因，在通過OGDR誘導的BV2小膠質細胞體外模型中，激活Nrf2/ARE信號通路能增強NQO1的表達從而清除ROS，同時降低OGDR誘導的BV2小膠質細胞中NLRP3、ASC和Caspase-1的表達，表明激活Nrf2/ARE信號通路減少NLRP3炎癥小體表達從而改善腦缺血損傷氧化應激和炎癥反應，因此，Nrf2/ARE信號通路可能是抑制NLRP3炎癥小體激活發揮治療缺血性腦損傷的潛在靶標[40]。

4 展望

NLRP3炎癥小體在缺血性腦損傷的病理過程中具有重要作用，NLRP3炎癥小體激活后促進IL-1β及IL-18的釋放以及調控細胞焦亡均能加劇梗死后缺血性損傷。除此之外，在臨床研究中還發現患者血液中NLRP3炎癥小體轉錄水平越高，急性腦梗死的預后越差，其原因可能是NLRP3炎癥小體加劇腦梗死炎癥級聯反應以及對抗抗栓藥物的治療作用[41]。但是目前臨床上NLRP3炎癥小體的特異性抑制劑研究還較少，P2X7R、MAPK和Nrf2/ARE信號通路都是調節NLRP3炎癥小體激活的潛在機制，可以為未來對腦梗死的防控及治療提供了新的思路，而且還能為研發NLRP3炎癥小體抑制劑提供新的方向，但是更具體的調控機制仍需更多的體內體外實驗加以研究。