基因工程技術在基因治療中的應用進展

劉婷婷 綜述 張殿寶 審校

1.營口經濟技術開發區中心醫院(營口市第六人民醫院)，遼寧 營口 115007；2.中國醫科大學基礎醫學院，遼寧 沈陽 110122

基因治療是指將外源正?；驅塍w內，糾正基因缺陷引起的疾病以達到治療目的。1972年，費里德曼提出基因療法用于治療人類遺傳性疾病的設想[1]。然而，1990年，美國國立衛生研究院首次開展基因治療的臨床研究。基因治療最初用于單基因遺傳性疾病的治療，隨著技術發展，擴展到癌癥、慢性疾病、神經退行性疾病和代謝紊亂性疾病的治療[2]。理想的載體是基因治療的關鍵，病毒載體感染細胞效率較高，能夠整合宿主細胞基因組，是基因治療常用的遞送系統。經過半個世紀的發展，結合了基因工程技術的基因治療策略得到了優化。與細胞免疫技術結合，增強T細胞抗腫瘤的能力；與基因編輯技術結合，精準修復缺陷基因，治療疾病[3]。本文將根據基因治療所涉及的基因工程技術為主線，闡述基因治療在臨床及臨床試驗中的研究進展。

1 病毒載體技術

病毒載體是最早應用于基因治療研究的工具。病毒載體介導的基因導入方法有兩種：體外轉移和活體直接轉移。病毒載體分為整合型和非整合型。整合型病毒載體通過體外轉移用于體外基因治療，而非整合型病毒載體通過活體直接轉移用于體內基因治療。目前，應用于基因治療較常見的整合型病毒載體包括γ-逆轉錄病毒載體和慢病毒載體，而非整合型病毒載體為腺相關病毒載體(adeno-associated virus，AAV)。本文通過病毒載體導入的方法探討其在基因治療中的應用。

1.1 體外基因治療 20世紀末，γ-逆轉錄毒載體首先用于造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)的基因導入[4]。1990年，美國食品藥品監督管理局(food and drug administration，FDA)監督了美國首例人體基因治療試驗，該試驗利用γ-逆轉錄病毒載體轉導HSCs治療患有腺苷脫氨酶缺乏性重度聯合免疫缺陷癥的兒童，2例患兒接受治療后臨床表現良好，生長發育正常[5]。2000年，法國內克爾醫院研究人員利用γ-逆轉錄毒感染HSCs治療X-連鎖重癥聯合免疫缺陷癥患者。10 例患者中有9 例治療成功，然而有4 例患者經過31～68 個月的治療后發展成T 細胞白血病，原因是外源基因在基因組中的隨機插入激活了癌基因的表達[6]。γ-逆轉錄病毒載體插入突變的安全性問題給基因治療帶來了巨大的挑戰。

在基因治療中，慢病毒載體比γ-逆轉錄病毒載體更有優勢。慢病毒介導外源基因整合入5'-非編碼區，降低致癌風險；慢病毒可以感染非分裂細胞，轉染效率高，并且可以攜帶更大、更復雜的外源基因片段。因此，慢病毒載體目前是大多數HSCs 編輯的首選工具。慢病毒載體靶向HSCs在遺傳性神經疾病、β地中海貧血等疾病的治療中顯現了較好的效果[7]。X-連鎖腎上腺腦白質營養不良癥是一種嚴重的男孩大腦脫髓鞘疾病，該疾病是由于腎上腺腦白質營養不良蛋白(一種由ABCD1基因編碼的三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白)缺乏引起。X-連鎖腎上腺腦白質營養不良癥患者經過骨髓清除治療后，輸注慢病毒載體轉導的HSCs，14～16個月后2例患者的進行性腦脫髓鞘停止，表明慢病毒載體靶向HSCs可為腎上腺腦白質營養不良提供臨床療效[8]。此外，β地中海貧血是世界上最常見的單基因疾病，其發病機制是基因突變造成β-珠蛋白合成減少，最終導致溶血性貧血。首個成功的β地中海貧血基因治療試驗是利用編碼β-珠蛋白的慢病毒載體轉導自體HSCs，經治療后患者不依賴輸血長達33 個月，且有穩定的血紅蛋白生成[9]。目前，β地中海貧血基因療法Zynteglo已在歐洲上市。如何優化載體的設計和生產工藝，提高載體有效轉導、靶向遞送和受控基因表達仍面臨挑戰。

1.2 體內基因治療 AAV 是一類天然復制缺陷的非致病、無包膜的細小病毒。AAV 具有低免疫原性、低致病性、宿主范圍廣泛以及穩定表達等優勢，是最有潛力的基因治療載體之一，并已廣泛地應用于臨床研究。2004年，中國最先將基因治療藥物Gendicine引入市場。Gendicine 通過AAV 攜帶p53 基因治療頭頸部鱗癌，可是該藥物的治療效果存在爭議。2012年，歐洲藥品管理局(European medicines agency，EMA)批準了首款基因治療藥物Glybera，其利用AAV 載體攜帶LPL 基因治療脂蛋白脂肪酶缺乏引起的嚴重肌肉萎縮疾病[10]。2017年，FDA 批準了基因治療產品Luxturna，其通過AAV2 攜帶視網膜變性等位基因65 治療罕見遺傳性視網膜病變造成的視力喪失[11]。2019年，FDA 批準基因治療產品Zolgensma，其通過AAV9 裝載運動神經元生存蛋白，治療2 歲以下脊髓性肌萎縮癥兒童(NCT03955679)。最近，有報道顯示AAV 遞送基因編輯系統可有效改善杜氏肌營養不良癥[12]。AAV 相關的基因療法NAN-101 的Ⅰ期臨床試驗也正在進行中，可用于治療充血性心衰(NCT04179643)。

2 基因編輯技術

基因編輯是利用基因編輯工具酶精準修改基因組的技術。與傳統的病毒載體介導外源基因技術相比，基因編輯可以介導細胞內的基因添加、基因消融、基因糾正等，精確修復突變基因，使基因治療更加精準和高效[13]。同源重組技術是最早的基因編輯技術，但外源DNA 與目的DNA 自然重組的概率很低。因此，基于核酸酶的基因編輯技術應運而生，該技術不僅減少了外源基因隨機插入，而且提高了對基因組特定片段進行精確修飾的幾率。目前，已知的四種基因編輯技術包括鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFNs)、轉錄激活因子效應核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)、規律成簇的間隔短回文重復(regarding the clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和單堿基編輯(base editing，BE)技術。

2.1 ZNFs 技術 ZFNs 是一種自定義的人工核酸酶，它可以在特定的序列上產生雙鏈斷裂，從而實現有效的靶向遺傳修飾。目前，已有臨床試驗證明ZFNs 可用于治療艾滋病、血友病和宮頸癌前病變等(NCT01044654、NCT02695160 和NCT02800369)。但是，ZFNs 特異性有限、易脫靶，而且蛋白設計費時費力，限制了該技術的大規模應用。

2.2 TALENs 技術 2009年，轉錄激活效應蛋白和FokI 酶區域結合構建了新一代的基因編輯技術TALENs。與ZFNs 相比，TALENs 的優勢是設計更容易、細胞毒性較低，劣勢是載體的構建耗時耗力。TALENs 聯合嵌合抗原受體修飾的T 細胞(chimeric antigen receptor modified T cells，CAR-T)治療多發性骨髓瘤的臨床試驗正在招募中(NCT04142619)。

2.3 CRISPR 技 術 ZFNs 和TALENs 的 應 用 存在一定局限性。至2013年以來，研究者將注意力轉移到CRISPR/Cas9 應用。根據Cas 蛋白的不同，CRISPR/Cas 系統被劃分為Ⅰ到Ⅵ型。廣泛應用于基因編輯的CRISPR/Cas9 是Ⅱ型CRISPR 系統[14]。CRISPR/Cas9 與ZFNs 和TALENs 相比特異性較高。然而，Cas9 核酸酶非特異切割概率較高，導致其脫靶效應相應提升。最近，四川大學團隊首次利用CRISPR/Cas9 修飾T 細胞治療肺癌患者[15]。同時，CRISPR/Cas9 技術已經成為基因編輯CAR-T 的一種簡單而有效的方法。麻省總醫院和哈佛大學團隊利用CRISPR/Cas9和CAR-T技術聯合應用于膠質瘤的研究。該團隊的前期結果提示靶向表皮生長因子Ⅷ(epidermal growth factor receptor Ⅲ，EGFRV Ⅲ)的CAR-T 可定位于顱內腫瘤，并且可有效抑制EGFRVⅢ表達的膠質瘤細胞生長[16]。然而，EGFRVⅢ表達的異質性和腫瘤微環境的抑制性影響其臨床療效。該團隊利用CRISPR/Cas9技術對內源性T細胞受體、β-2微球蛋白進行基因破壞，降低了啟動移植物抗宿主病和細胞排斥的可能性；利用CRISPR/Cas9 技術破壞程序性細胞死亡配體1 基因的表達，改善腫瘤微環境的抑制性。在膠質瘤臨床模型中，三基因編輯的EGFRVIII CAR-T 可增加抗腫瘤效應[17]。2018年10月，FDA 接受了CRISPR/Cas9 技術編輯的基因療法CXT-001遞交的研究性新藥申請，CXT-001是基于基因編輯的自體干細胞療法，用于治療鐮狀細胞貧血癥。最近，全球實現了首例CRISPR/Cas9 基因療法的體內治療，CRISPR/Cas9 在研藥物AGN-151587 通過視網膜下注射給藥治療視力障礙性疾病，這一里程碑事件推動基因編輯技術在基因治療中的快速發展。

2.4 BE 技術 BE 是不需要供體DNA 模板或DNA 雙鏈斷裂即可進行單堿基轉換的基因編輯技術。BE不依賴于非同源末端連接或同源定向修復，而是在基因組上引入精確且高度可預測的核苷酸，以便改善ZFNs、TALENs 和CRISPR/Cas9 技術的隨機插入和缺失引起的移碼突變問題。第三代堿基編輯器BE3將C：G 堿基對轉換為A：T 堿基對，與其他編輯器相比，編輯效率更高，隨機插入和缺失的頻率更低。

3 CAR-T技術及其在腫瘤中的應用

近年來，腫瘤成為基因治療炙手可熱的研究領域，CAR-T療法是當下腫瘤治療最具前景的發展方向之一。具有里程碑意義的是：2017年，FDA 批準的兩款CAR-T 療法Kymriah 和Yescarta，分別用于治療急性淋巴細胞白血病和B細胞淋巴瘤，兩者都在臨床試驗中表現出顯著的抗腫瘤效果。然而，CAR-T針對實體瘤的臨床效果卻差強人意。實體瘤的微環境、特異性靶點的缺乏、免疫抑制、難以歸巢到腫瘤組織等因素限制了CAR-T 在實體瘤的發展[18]。如何找到特異性的靶點以及通過結構優化，提高對腫瘤的殺傷效率，降低CAR-T 對正常組織的損害是CAR-T 面臨的巨大挑戰。科學家們一直致力于CAR-T 的改造和研究，通過安裝自殺基因、多靶點CAR-T聯合、CAR-T聯合其他治療等手段，在肝癌、腎癌、直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中取得了突破性進展[19]。

3.1 肝癌 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院構建了肝細胞癌的雙靶點CAR-T。雙重靶點為磷脂酰肌醇蛋白糖3(glypican-3，GPC3)和去唾液酸糖蛋白受體1 (asialoglycoprotein receptor 1，ASGR1)，分別是肝癌標記物和肝組織蛋白質。雙靶向CAR-T 針對體外共同攜帶兩種抗原的腫瘤細胞在細胞因子分泌、增殖和抗凋亡等方面明顯優于單靶向的CAR-T[20]。為了提高應答效率，該團隊分析了GPC3-CAR-T聯合索拉非尼在肝癌模型中的作用。研究結果表明，索拉非尼可通過促進腫瘤相關巨噬細胞的分泌和細胞凋亡機制增加GPC3-CAR-T的抗腫瘤效應[21]。

3.2 胰腺癌 賓西法尼亞大學團隊Ⅰ期臨床試驗報道，靶向間皮素的CAR-T輸注6例胰腺導管癌患者后，有3例患者腫瘤代謝活性降低，且有1例患者肝轉移灶完全消失[22]。此外，來自英國和美國的團隊開創性地構建了具有開關功能的靶向人類表皮生長因子受體2 的CAR-T，利用Ⅳ期胰腺癌患者來源的異種移植模型模擬胰腺癌侵襲性的特征，包括嚴重的肝轉移和肺轉移。經體內注射后，傳統和新型的CAR-T均顯示出顯著的治療效果，已經擴散到肝臟和肺部的癌細胞也完全消失，但具有開關作用的CAR-T可提供臨床轉化的潛在安全性[23]。

3.3 直腸癌 四川大學團隊發現上皮細胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)可作為CAR-T 治療結直腸癌新靶點。研究顯示通過慢病毒遞送EpCAM CAR-T 至小鼠異種移植模型，以EpCAM 依賴性方式誘導靶細胞產生溶解性細胞毒性，并分泌細胞毒性細胞因子。 此外，EpCAM-CAR-T 過繼轉移顯著延遲了異種移植模型中腫瘤的生長和形成，且安全性評價提示CAR-T 在小鼠體內無全身毒性[24]。

3.4 腎癌 徐州醫科大學團隊構建了人腎細胞癌特異性抗原碳酐酶Ⅸ(Carbonic AnhydraseⅨ，CAⅨ)的第二代CAR-T，CAIX-CAR-T在體外對腎癌細胞具有特異性的殺傷作用，聯合CAIX-CAR-T和舒尼替尼在轉移性腎細胞癌模型中表現出顯著的抗腫瘤效應[25]。在癌癥免疫治療學會2019年會上，公布兩款CAR-T 細 胞 療 法：CCT301-38(AXL)和CCT301-59(ROR2)，用于治療Ⅳ期轉移性腎細胞癌。7 例轉移性腎細胞癌患者進行CAR-T 細胞治療后，6 例患者病情穩定(NCT03393936)。

4 展望

經過半個世紀的發展，基因治療作為前沿的醫學技術，有望成為疾病治療的新手段。但基因治療仍面臨著很多挑戰。臨床級病毒載體的制備是基因治療產品臨床轉化的關鍵。然而，病毒載體生產工藝復雜、成本較高，造成基因治療產品價格昂貴，超出了大部分家庭的支付能力，多款基因治療產品已黯然退市。如何降低開發成本，簡化生產工藝是基因治療產品亟需解決的問題。CAR-T 細胞治療已經在血液腫瘤治療中取得重大突破，在實體瘤的研究中也有顯著進展，可是實體瘤相關腫瘤標志物的異質性限制了CAR-T的臨床治療效果。此外，CAR-T引起的細胞因子釋放綜合征也是需要攻克的難題?；蚓庉嬍腔蛑委熥钋把氐募夹g，但如何解決其脫靶效應，擴大基因編輯后的遞送工具選擇范圍是科學家仍要努力研究的方向。