3D類器官模型的研究進展及其在化學品毒理學評價中的應用展望

劉薇，梅璽麗，陳雨萌，向哲源，高澤欣，邢立國，趙慧敏，劉猛，陳景文

1.大連理工大學環境學院，工業生態與環境工程重點實驗室，大連 116024 2.中化集團沈陽化工研究院有限公司，沈陽 110027

工業革命以來，人類合成了化肥、農藥、藥物和各種工業化學品，至今美國化學文摘社(Chemical Abstracts Service, CAS)注冊的化學物質有1.5億種以上(每天約增加15 000種)，人類在市場上使用的化學品在35萬種以上[1]。根據2019年3月聯合國環境署(United Nations Environment Programme, UNEP)發布的全球化學品展望Ⅱ(Global Chemicals Outlook Ⅱ)[2]，歐盟區域2016年使用的3.45億t化學品中，62%對人體健康有害。因此，合成化學品是生態與人體健康的重要風險源，是人類社會可持續發展面臨的重大挑戰。

預防和控制化學品對人體健康的風險，需要化學品的毒性數據，以填補關于化學品危害性的信息空白。然而，傳統的毒性測試方法往往需要消耗大量的測試動物，成本高，耗時長，存在動物實驗倫理問題。而且，動物實驗結果外推至人類具有極大的不確定性。新時代的環境毒理學，倡導從以往主要是描述性的科學向更具預測性、主要基于人源細胞和組織的體外高通量測試的科學轉變；倡導通過對毒性通路(toxicity pathway, TP)和有害結局路徑(adverse outcome pathway, AOP)的機理認識并構建計算毒理學模型來進行化學品的風險評價和預測，進而減少實驗測試動物的數目、測試成本和時間。因此，發展基于人源細胞和組織的體外高通量毒性測試方法體系，是新時代環境毒理學的前沿方向[3-5]。

人源細胞和組織用于毒理學測試，先后經歷了2D單層細胞培養、細胞球模型和類器官模型(表1)。2D細胞培養和細胞球模型常用單一的特定細胞系，與體內多細胞組織及其生理功能差異較大。所謂類器官(organoid)，指的是由誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)、胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)或成體干細胞(adult stem cells, ASCs)在體外自組織并經歷一定程度的細胞分化形成的3D結構，具備體內組織器官的部分典型功能，具有較為穩定的表型和遺傳學特性[6-7]。3D類器官模型可模擬組織器官的復雜空間形態，突破了細胞間單純的物理接觸和聯系，表現出細胞間和細胞-基質相互作用，與體內組織器官具有更相似的生理反應。類器官模型與2D單層細胞模型或細胞球模型相比，能更好地用于模擬器官組織的發育過程及生理病理狀態，因而能更好地反映體內毒性效應(表1)。關于類器官模型的基礎研究以及在再生醫學領域的應用進展，已有相關綜述[6-13]。目前類器官模型在化學品毒理學評價領域的應用僅處于起步階段[14]，本文從類器官的生理學特性、構建方法及組織類型等方面，重點綜述了類器官模型對化學品暴露的毒性響應特征，及其在化學品毒理學評價中的優勢和可行性，并提出了存在的問題和對策，以期為基于類器官模型的化學品毒理學研究提供參考。

1 類器官的特性(Organoid features)

類器官由多種細胞自組織形成，在細胞類型、結構和功能等方面模擬體內相應組織器官。作為實驗室培養的器官微縮模型，類器官應用于體外環境中特定靶器官毒理學的研究，具有以下幾方面優勢。

(1)細胞形態呈3D模式。與傳統細胞培養中貼壁生長的2D細胞形態不同，在類器官模型中，細胞在3D空間中生長，形態學特征和生理特性與體內更相似。例如，3D毛囊乳頭細胞球相較于單層培養的毛囊乳頭細胞，其細胞分泌因子能夠改善毛囊微環境，促進毛囊中β-catenin和CD133的表達，這2種蛋白與毛囊干細胞功能和毛囊再生密切相關[15]。呼吸道上皮細胞在3D培養條件下表達上皮細胞標志物PCK、CK5和ZO-1，而且形成纖毛樣突起，但在2D條件下培養并無以上特征[16]。

(2)能夠反映細胞間相互作用和細胞-基質相互作用。類器官模型包含多種細胞類型，突破了傳統2D模型中簡單的細胞間物理接觸，形成了更加緊密的細胞間生物通信和信號網絡，細胞間相互影響、反饋及協作發育。細胞間相互作用和細胞-基質相互作用支持細胞微環境穩態的建立，有助于形成和維持具有特定結構和功能的微型組織器官。類器官模型可顯著促進針對細胞相互作用過程的毒理學研究，例如對細胞粘附、遷移、分化和愈合等細胞功能的損傷作用[17]。

(3)具有良好的生理功能。例如，皮膚類器官比單層培養的角化細胞、成纖維化細胞具有更好的抗氧化應激能力[18-19]，與人體表皮脂質成分高度相似，具有較為完善的屏障功能。Lancaster等[20]構建的腦類器官模型，不僅符合哺乳動物的基本神經發育機理，還具備了一定的人類大腦發育特征，并且作者利用該腦類器官模型成功構建了在小鼠體內很難模擬的小頭畸形障礙疾病模型，有效解決了該疾病實驗研究的難題。相對于單層細胞培養，3D培養條件下的生殖細胞中自噬體數量明顯降低，緩解了細胞在體外培養中產生的應激反應[21]。

2 類器官模型的構建方法(Organoid development methods)

根據使用的支架材料和培養設備等，常用類器官構建方法主要包括4類：懸浮培養、凝膠支架培養、旋轉生物反應器和氣液界面培養(圖1)。此外，生物打印技術和器官芯片技術是類器官模型構建的新興方法。

2.1 懸浮培養

使用低附著力表面的培養瓶/微孔板、磁懸浮器件或者采用懸滴法，細胞可在液體培養基中懸浮生長并形成類器官。懸浮法不使用支架材料，細胞自發團聚，避免了其他因素的干擾。懸滴法中細胞懸滴所含細胞數相同，球體大小一致，無需借助額外裝置，自發實現細胞成球，局限性主要在于不適于大規模培養[22]。磁懸浮方法將具有生物相容性的磁性納米顆粒引入細胞，將磁性驅動組件蓋在培養板頂部，細胞在磁力作用下懸浮到空氣-液體界面，并集中在磁鐵下，形成3D結構。Tseng等[23]利用磁懸浮法實現了4種細胞共培養，包括成纖維細胞、內皮細胞、上皮細胞和平滑肌細胞，形成了細支氣管3D模型。

雌性BLAB/c裸鼠（山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物許可證號：SCXK（魯）20160007），6周齡，體質量18～20 g。宮頸癌CaSki細胞購自上海滬震生物科技有限公司。qRT-PCR相關試劑（寶生物）；Fascin抗體（Santa Cruz）；增殖細胞核抗原（PCNA）抗體、Survivin抗體（PTGlab）；細胞周期依賴性蛋白激酶4（CDK4）抗體、p21抗體（R&D Systems）；HRP標記的二抗（羽朵生物）；Fascin siRNA慢病毒和陰性對照慢病毒由深圳中洪博元生物技術有限公司構建。

2.2 凝膠支架

水凝膠由交聯的多聚鏈或復雜蛋白分子組成的網絡構成，其高含水量和高孔隙性使得氧、營養物質和廢物的運輸更為便利，為細胞提供附著、分化和增殖的場所，因而可以作為高效的3D細胞培養基質[24]。水凝膠包括天然來源和人工合成材料，其中Matrigel是一種細胞體外培養最常用的天然基質膠，是從富含胞外基質蛋白的EHS小鼠腫瘤中分離得到的，其組分與體內大多數活細胞的胞外基質相似[25]。Matrigel在4 ℃時為液體，當濃度>4 g·L-1時，在24～37 ℃時凝膠化[26]。Matrigel主要成分為層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白和硫酸肝素糖蛋白等，具有結構支持和信號轉導的作用。其中層粘連蛋白含量最為豐富，是主要的凝膠因子。Matrigel還包含FGF、EGF、TGF-β、IGF和PDGF等生長因子，通過改變生長因子的組成和濃度，可調控特定類型的細胞增殖和分化。Matrigel的局限性主要在于組分不完全明確，存在一定的產品批次差異[11]。

表1 不同體外細胞模型的優缺點Table 1 Advantages and disadvantages of various in vitro cell models

圖1 類器官的構建方法和組織類型注：ASCs表示成體干細胞，ESCs表示胚胎干細胞，iPSCs表示誘導多能干細胞。Fig. 1 Methods for organoid development and tissue-specific typesNote: ASCs stand for adlut stem cells; ESCs stand for embryonic stem cells; iPSCs stand for induced pluripotent stem cells.

2.3 旋轉生物反應器

旋轉生物反應器解決了類器官構建的主要難題之一，即細胞的營養和氧氣供給。例如，與靜態懸浮培養相比，旋轉生物反應器中的神經節細胞和S型視錐細胞的分化能力增強，促進和改善了視網膜類器官構建中的細胞增殖和分化[27]。在旋轉生物反應器中建立的小頭畸形障礙的大腦類器官模型，盡管6～7個月后尺寸有所皺縮，但可維持活性長達15個月[20]。保持適宜的轉速對使用旋轉生物反應器培養類器官至關重要，攪拌速度過慢會使細胞球沉降，速度過快則會損壞細胞。此外，該方法不適用于培養粘附性低或對剪切力敏感的細胞[28]。

2.4 氣液界面法

氣液界面(air-liquid interface, ALI)培養是指細胞的頂層暴露于空氣中，底層與液體培養基接觸，而不是完全浸入培養基中。ALI培養主要用于構建呼吸道和皮膚模型，還用于腎和腦類器官[12, 29-30]，有利于呼吸道纖毛細胞和皮膚表皮細胞等細胞的定向分化和增殖。ALI法有利于氧傳輸，提高了培養體系內的氧濃度，ALI培養體系中的氧梯度相比于浸沒培養體系降低了1.5倍[13]。因此，ALI法改善了細胞氧合作用，進而促進類器官的自組織，有助于其維持更長時間。例如，ALI培養體系中的大腦類器官可以維持更長時間，從而促使模型進一步成熟[29]。ALI培養在操作上存在一定的難度，此外在半透膜上培養的類器官模型難以進行分離和高通量毒性測試[31]。

2.5 器官芯片技術

傳統的類器官培養需在特定時間點向培養基中加入外源因子，外源因子和細胞分泌的可溶性因子在干細胞的局部微環境中自發擴散，不容易控制，無法精確模擬體內器官發育關鍵因子的梯度分布。器官芯片技術在體外模擬機械力刺激、特定信號通路和化學梯度等復雜條件的組織器官生理微環境，從而精確地調控細胞行為，減少類器官構建的變異性[32]。微流控芯片技術能促進內分泌細胞分化和胰島類器官成熟，Tao等[33]采用人誘導多能干細胞在多層可灌注芯片上動態灌注培養出了胰島類器官，相比于靜態培養形成的胰島類器官，對于葡萄糖的刺激更敏感，且胞漿中Ca2+通量更高。此外，可通過器官芯片技術模擬灌注血管，Shirure等[34]構建的腫瘤類器官芯片器件由3個相互連接的隔室組成，可支持內皮細胞自組裝形成血管，是解決3D細胞培養中血管形成難題的重要策略之一。Wang等[35]提出了一種在微流控芯片細胞灌注式培養系統中構建肝類器官的方法，通過對微陣列的尺寸進行優化，調控類器官大小與均一性。由于微流控芯片技術是按照預先確定的方式設計和構建的，對細胞的大小、形狀和相對排列的控制存在一定的局限性[32]。

2.6 3D生物打印

3D生物打印將生物材料和活細胞在指定的逐層堆疊的組織中同步定位，與傳統的組織構造方法相比，采用3D生物打印法構建類器官具有精確、可重復及尺寸可控性強的優勢[36]，能夠精確地定位活細胞、蛋白質、DNA、藥物、生長因子和其他生物活性物質的時空分布，以控制生物組織的形成。大部分的3D組織模型缺乏組織界面，如血管內皮組織與周圍結締組織和實質細胞之間的界面，而組織界面對器官功能至關重要[37]。King等[38]利用3D生物打印平臺開發了近端人腎小管模型，由腎成纖維細胞、內皮細胞和原代人腎小管近端內皮細胞形成了組織界面，該模型暴露于順鉑后，組織活性呈劑量依賴性降低，且通過組織病理學觀察到上皮細胞數量也呈劑量依賴性降低，通過抑制陽離子攝取轉運蛋白OCT2可保護其免受這種損傷。Nguyen等[39]報道，通過生物打印的人類肝臟組織在培養4周時仍能維持ATP、白蛋白水平以及細胞色素P450酶活性，且對肝毒性藥物曲氟沙星和結構類似的左氧氟沙星表現出不同的毒性反應，表明該肝組織模型能夠區分結構高度相似的藥物毒性。3D生物打印的局限性主要在于打印過程中細胞存活率降低，影響類器官活性，此外生物打印的類器官數量較為有限[40]。

3 類器官的組織類型(Tissue-specific organoid types)

根據模擬組織器官的類型，類器官模型主要包括皮膚、肝、腎、肺、腦、心臟和生殖類器官等。此外，也有研究報道成功構建了腸、乳腺、前列腺、胰腺和視網膜等類器官模型[10, 41]。

3.1 皮膚類器官

歐盟提出從2009年3月開始禁止動物試驗用于化妝品安全性評價[42]，極大地促進了3D皮膚組織模型的發展。其中較早投入使用的模型有EpiskinTM模型和Epikutis?3D表皮模型。EpiskinTM模型將分離的人表皮細胞接種在特定的生物材料上培養，形成具有3D結構的人表皮模型，已經被廣泛應用于皮膚腐蝕性體外試驗[43]。張光甫等[44]依據Epi Derm的構建原理采用人皮膚成纖維細胞與鼠尾膠原混合培養模擬真皮層，在真皮層上接種人角化細胞，經氣液培養形成表皮層，構建人皮膚模型，并利用該模型對10種殺菌類農藥的皮膚腐蝕性和刺激性進行檢測，腐蝕性檢測結果與動物評價測試結果的一致率為100%，刺激性結果的一致率達到80%，表明重組人皮膚模型在農藥品皮膚毒性評價中具有良好的應用前景。Liu等[45]構建的由上皮細胞、成纖維細胞和內皮細胞組成的無支架雙膜皮膚模型，與成纖維細胞和內皮細胞的共培養以及單一培養相比，3種細胞之間的相互作用上調了血管化相關的生長因子VEGF、bFGF和PDGF的表達，形成了更豐富的血管。

3.2 肝臟類器官

肝臟是人體最重要的解毒器官，也是很多外源化學物毒性作用的靶器官，構建肝細胞體外3D模型可以對化學物的毒性進行更有效的檢測。2013年，Takebe等[46]將肝細胞、人臍靜脈內皮細胞和人間充質干細胞共培養，模擬肝臟發育早期的細胞譜系，并通過內皮細胞和間充質干細胞的相互作用，產生了類似人肝芽組織的3D聚合物，移植入小鼠體內后具有良好的血管生成功能，該研究被Science評為2013年的十大突破之一。不足之處是這些體外培養的肝芽組織缺乏膽管結構。2017年，Vyas等[47]利用肝細胞胞外基質支架，使人胎兒肝祖細胞自組織形成了肝類器官，提升了對肝膽器官形成過程的模擬效果，同步形成了分化的肝細胞和膽管結構。Shinozawa等[48]利用多能干細胞構建了具有膽汁轉運功能的肝臟類器官，含有具有膽管樣結構的極化未成熟肝細胞，建立了膽汁酸的單向轉運途徑，通過測試存活率、膽汁淤積和線粒體毒性，對238種市售藥物的肝毒性具有較高的預測能力(敏感性：88.7%，特異性：88.9%)，并將其轉化為適用于384微孔板的高速實時成像分析平臺。

3.3 腎臟類器官

原代腎上皮細胞在分離后20 min內即喪失細胞特征，在單層培養條件下幾周內即完全去分化，因此腎毒性評估通常使用永生化細胞系。但永生化細胞系往往不具備誘發毒性的基本分子結構，例如攝取化學物的小分子轉運體和部分毒性靶標受體，并且存在藥物外排能力低等局限[49-50]。在腎小球類器官模型中，可誘導表達裂隙隔膜、腎臟濾過功能和腎小球發育相關基因，而且在阿霉素作用48 h后，MAFB-BFP2強度呈劑量依賴性下降[51]。Astashkina等[52]報道，慶大霉素等4種腎毒性藥物作用于腎小管類器官，藥物擴散較好，而且能夠誘發和體內毒性相似的效應，包括尿N-乙酰-β氨基葡萄糖苷酶和γ-谷氨酰轉移酶升高、炎癥因子升高、腎毒性蛋白和基因標志物升高等，而永生化細胞HEK293和LLC-PK1則無相關毒性反應。此外，在單層培養的腎小管細胞中，細胞色素P450活性迅速喪失，而在3D培養中可持續表達。

3.4 肺類器官

肺癌的發病率和死亡率占惡性腫瘤的首位，2018年全球癌癥統計報告顯示，185個國家地區的肺癌發病率在36種癌癥中占11.6%，有176.64萬人因肺癌死亡，約占癌癥死亡總人數的18.4%[53]，室內外環境空氣污染是呼吸道疾病的主要誘因之一。人體氣道上皮是吸入空氣污染物的主要毒性靶區，且人呼吸道上皮基底細胞中表達CYP450代謝酶，基于該細胞的肺類器官成為體外吸入毒理學研究的理想模型[17]。氣管結構的出現是肺類器官構建成功的重要標志[10]。Desai等[54]構建的肺3D模型，可在培養基中維持100 d以上，并形成組織良好的近端氣道上皮結構，包括基底細胞和纖毛細胞以及少量club細胞。Treutlein等[55]建立的3D肺類器官可以表達遠端肺上皮細胞的標記物Sftpc/Sox9和Hopx/Sox9。Yamamoto等[56]誘導人多能干細胞培育出肺泡類器官，經GNE7915和胺碘酮處理后Ⅱ型肺泡上皮細胞的板層小體明顯增大，與體內毒性反應一致。最近，Takayama[57]利用支氣管類器官，發現SARS-CoV-2病毒的主要靶標是呼吸道上皮基底細胞，并導致I型干擾素信號升高。EpiAirwayTM是一個商品化的肺3D組織模型[58]，具有良好的均一性和重復性，由正常人氣管/支氣管上皮細胞培養形成高度分化的假復層上皮組織模型，包含基底細胞、杯狀細胞和纖毛細胞，其黏液纖毛表型與人類呼吸道上皮組織非常相似[59]。EpiAirwayTM測試預測強吸入毒性化學物質與動物測試效果相當，預測中/低毒性呼吸道刺激物的毒性效應優于動物測試[60]。Chang等[17]比較了不同多環芳烴類化合物對EpiAirwayTM模型轉錄組學特征的影響，指出可利用該方法識別多環芳烴類化合物的致癌機理。Hild和Jaffe[61]利用Matrigel支架建立了一種不依賴ALI培養的高通量類支氣管模型培養方法，使用384孔細胞培養板即可，在該培養體系中人呼吸道上皮基底細胞可分化為杯狀細胞和纖毛細胞。Liu等[62]進一步考察了該方法的性能，發現在一定的初始細胞接種數量和細胞代際范圍內，細胞群落形成效率和支氣管模型尺寸變異性較小，具有良好的穩定性。

3.5 腦類器官

人腦的復雜性極高，很難采用動物模型研究人類大腦功能，因此迫切需要建立人腦發育體外模型[20]。腦類器官模型的轉錄組和表觀遺傳組學特征和胎兒大腦相似，有利于研究致畸物對中樞神經系統發育的毒性作用和機理。利用單細胞測序比較胎兒大腦和腦類器官皮層細胞組成和譜系關系，發現超過80%的皮層疾病或進化相關的差異表達基因在腦類器官中表達模式相似[63]。2013年，Lancaster等[20]培養出與9～10周胚胎大腦類似的“類大腦”，該模型可以形成分離的但相互依存的不同腦區，如大腦皮層和腦膜等，極少一部分會分化成海馬體，該腦類器官表現出人大腦皮層發育的重要特征，即特征性前體區域組織，其中含有大量的放射狀膠質干細胞。2015年，Kirwan等[64]構建了人大腦皮層神經網絡，能夠模擬體內皮質網絡的發育和功能，可用于人類前腦神經網絡生理學機制的研究。乙醇作用于腦類器官造成祖細胞過早分化、神經突生長抑制及細胞死亡，且轉錄組學分析發現一系列新的毒性靶基因和信號轉導通路，包括GSX2、RSPO2和Hippo信號通路[65]。尼古丁損害腦類器官的皮層發育，造成神經元分化和遷移異常[66]。類前腦經雙酚A暴露，對神經祖細胞增殖和腦區厚度產生劑量依賴性的抑制作用[67]。

3.6 心臟類器官

心臟是外源化學物毒性的重要靶器官之一[14]。Takeda等[68]將3D人工心臟組織用于藥物心臟毒性體外測試，阿霉素誘導細胞釋放乳酸脫氫酶、抑制細胞活力，毒性響應較靈敏，且hERG型鉀通道阻滯劑E-4031和異丙腎上腺素呈劑量依賴的方式誘導鈣瞬變和細胞收縮力發生顯著變化。Lemme等[69]用誘導多能干細胞形成的心肌細胞建立右心房工程心臟組織，與人的肌肉比較，該模型心房的表征指標的mRNA表達水平和蛋白質濃度更高、收縮更快、收縮力更小、動作電位持續時間更短，能夠較為準確地模擬體內心臟生理特征。Lu等[70]報道3D培養能夠促進心肌細胞的成熟和收縮，1 μmolL-1的鉀通道阻斷劑E4031顯著降低了3D心臟類器官的收縮速度，當濃度增加到10 μmolL-1時收縮完全停止，而2D培養的單層心肌細胞在1 μmolL-1時收縮停止，2D心臟類器官表現出更強的耐藥性。

3.7 生殖類器官

目前只有少數研究報道了由睪丸細胞構建睪丸類器官。Sakib等[21]建立了豬、小鼠、獼猴和人的3D睪丸類器官，該模型由生殖細胞、支持細胞、睪丸間質細胞和管周肌樣細胞組成，形成了明顯的生精上皮和由基底膜分隔的間質室。當這些睪丸類器官暴露于鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯后，生殖細胞自噬的水平呈劑量依賴性升高。Pendergraft等[71]用成熟的生殖細胞和永生化的Sertoli-Leydig細胞在懸滴培養系統中培育出人睪丸器類官，并可產生睪酮，4種潛在的促性腺激素化療藥物使該類器官細胞活性明顯下降，凋亡細胞數量顯著增加，且半數效應濃度值明顯高于相應的2D模型。

4 類器官毒理學研究的挑戰與對策(Challenges and strategies of organoid-based toxicology research)

目前類器官模型在化學品皮膚毒性測試方面取得了相對突出的進展，部分模型已在國內外毒理學替代法研究機構通過驗證形成了標準方法，但在其他靶器官毒理學研究中的應用極為有限。對于化學品的毒理學評價，類器官模型有利于模擬化學品在體內的動態分布過程，能夠更準確地預測和評估化學品的毒性效應和機理，將顯著促進化學品健康風險防控。此外，由于干細胞在增殖和分化條件下對外源化學物質的敏感性不同，基于類器官形成過程的毒理學研究，有利于評價化學品的發育毒性、識別化學品的敏感時間窗口和分子靶標。利用類器官模型進行化學品的毒理學評價，需要滿足可獲得高產量類器官模型、可測量毒性終點和高通量測試體系等方面的需求[6]，以下幾方面策略有利于推動類器官毒理學的發展。

4.1 改進類器官構建方法體系及其標準化

類器官模型構建方法的改進及其標準化是類器官毒理學研究的根本任務。盡管類器官在模擬體內器官形態和功能上相比2D細胞模型有了極大的提升，但和體內組織器官的成熟度和復雜性仍有較大差距。在類器官的培養過程中，隨著細胞的大小和體積的增加，簡單擴散過程使得為核心部分細胞提供的氧氣和營養不足，核心部分細胞代謝廢物排出也受到限制。類器官通常缺乏基底、組織駐留免疫細胞和血管，限制了類器官的發育和成熟[7]。此外，類器官變化迅速，在不同培養階段所需培養條件不同。優化細胞組合類型、培養基組成以及結合微流控技術等有望改善類器官模型的功能。類器官的尺寸和細胞組成變異性較大，構建方法標準化有助于改善毒理學評價結果的重現性和準確性。

為滿足化學品毒理學評價的巨大需求，高產量構建方法是類器官毒理學的基本要求。基于微孔板的類器官模型構建方法，與現有的自動化操作和測試儀器相適應，是實現高產量的便捷、有效的方法[62]。此外，Liu等[72]建立了一種基于液滴微流控系統的雜合水凝膠微囊制備體系，該系統支持大規模的類器官培養。實現類器官凍存且復蘇后仍能夠保持形態功能的方法體系，也將有效促進其推廣和應用。延長類器官的生命周期，可促進通過體外試驗預測長期暴露的毒性效應。

4.2 受試物的暴露途徑、劑量和毒代動力學特征

體外毒理學模型有利于研究毒性機理和確定相對毒性潛能，在此基礎上，進一步提升體外暴露途徑的體內相關性，確定體外暴露濃度的體內相關性，將極大地推動類器官毒理學模型的發展和應用。由于類器官模型中的細胞呈3D生長和組織模式，且構建體系采用的特殊材料和器件，給類器官毒理學模型的化學品暴露帶來難題。建立與環境暴露相似的暴露途徑，有助于提升類器官毒理學研究結果的相關性。通過類器官及其細胞組分中受試化學物的定量分析，有助于確定靶細胞內暴露劑量，建立更精準的劑量-效應關系。結合生理毒代動力學模型，借助系統生物學和計算毒理學技術，可經體外濃度估測經口濃度，有助于推動基于體外毒理學模型的化學品健康風險評價[42]。

4.3 多層次毒性終點、表征方法和高通量測試體系

建立環境健康效應相關的、靈敏的毒性效應終點以及高通量的定量定性檢測方法，是類器官毒理學研究的核心任務。建立基于形態學、組織/細胞功能、生物化學和基因調控等由宏觀到微觀的多層次毒性效應終點和測定方法[73-74]，有利于深入評估化學品的毒性效應和機理。由于在類器官培養中使用了骨架材料、Transwell培養板或其他器件和材料，用于單層細胞培養的毒理學表征方法，需經改進后應用于3D類器官模型，避免基質等材料的干擾[10, 75]。利用毒理組學技術(包括轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等)有助于全面篩查敏感分子靶標、預測有害效應及闡明毒性作用模式。近年來發展迅速的單細胞測序方法[76]，尤其適合于對類器官中不同類型的細胞進行轉錄組學分析，對于揭示細胞特異性的毒性機制、細胞間相互作用和細胞-基質間相互作用等毒理學問題具有重要意義。基于細胞培養微孔板的類器官構建體系有利于實現毒性高通量評估，可同時進行多種化學品毒性測試，該法僅需少量受試化學品，適合于價格昂貴或處于研發階段的新化學品。

類器官模型不僅適用于毒性效應和機制的基礎研究，還將顯著促進化學品的健康風險評價和管理。基于類器官模型的毒理學研究結果在化學品健康風險評價中具有以下幾方面重要作用。(1)危害鑒定：利用類器官毒性測試篩選潛在的靶器官毒物，為更深入的毒性評價建立優先測試化學品清單，提高化學品毒性測試效率、減少動物實驗。可結合類器官毒理學評價結果和其他方面的研究結果，利用證據權重法(weight-of-evidence)進行化學品危害鑒定。(2)識別毒性作用模式(mode of action, MOA)和AOP：類器官毒理學研究有利于識別化學品在分子、細胞和組織水平的毒性效應，進而有助于闡明化學品的毒性作用機理、MOA和AOP，為化學品風險評價和管理提供重要依據。(3)劑量-效應關系評定：利用體外體內外推法(invitrotoinvivoentrapolation, IVIVE)[77]，結合計算毒理學模型，可根據類器官毒理學研究結果估測在動物/人體內產生毒性效應所需的化學品劑量。(4)風險表征：風險表征是化學品風險評價的最后步驟，需綜合分析危害鑒定、暴露評價和劑量-效應關系的結果，判斷發生某種危害的可能性，類器官毒理學研究結果為風險表征提供實驗依據。此外，類器官毒理學研究結果有助于建立基于靶器官毒性和MOA的更精準的不確定性系數，提高風險評價的科學性和準確性。

類器官毒理學的發展，將顯著提升毒理學基礎研究能力以及對化學品風險評價和管理的支撐作用。目前國內外類器官毒理學的研究均處于起步階段，尚有較多關鍵的科學和技術問題有待攻克。我國少量研究機構在類器官模型的組織工程構建方面已取得了較為突出的進展，但在化學品毒理學評價領域的研究極為有限。化學品毒理學評價急需建立高產量、高通量、靈敏的類器官毒理學模型，研究其對化學品暴露的毒性響應特征和機理，需要細胞和組織工程、毒理學體外/體內實驗研究和計算毒理學等多學科交叉合作，同時急需相關領域專業人才培養。