重金屬人體生物有效性、吸收及毒性研究中的腸道細胞模型

王坤，肖羽芯，李夢瑩，馬嬌陽，覃一書，向萍,*

1. 西南林業(yè)大學環(huán)境污染與食品安全及人體健康云南省創(chuàng)新團隊，昆明 650224 2. 西南林業(yè)大學生態(tài)與環(huán)境學院/環(huán)境修復與健康研究院，昆明 650224

廣義上，重金屬是指密度>4.5 g·cm-3的金屬元素，而在環(huán)境污染中重金屬通常指的是鎘、汞、鉛、鉻和砷等具有生物毒性的金屬(砷是一種類金屬，因其毒性效應與其他有毒金屬相似，故也被劃為重金屬之一)。由于重金屬污染具有隱蔽性、長期性、不可逆轉性和生物蓄積性等特點，因此重金屬暴露對人類健康的影響受到廣泛重視。為此，世界衛(wèi)生組織(WHO)每年定期評估重金屬對人類健康的影響，世界各國也以據(jù)其健康風險評估結果，先后建立起重金屬污染管控的環(huán)境標準，規(guī)定了多介質中重金屬的環(huán)境限量標準。然而，越來越多的研究表明，傳統(tǒng)基于重金屬總量開展的健康風險評估方法并不能全面地評價人體實際面臨的暴露風險，因此需要建立更為準確的重金屬暴露風險評估方法。

面對不足，研究者們陸續(xù)發(fā)展起了多種基于生物可給性(bioaccessibility)的重金屬人體暴露風險評估方法，如體外胃腸模擬法，即還原胃腸道物理化學環(huán)境，對環(huán)境介質中污染物的胃腸階段溶出率進行分析。常見的體外胃腸模擬法有基于生理學的提取試驗法(physiologically based extraction test, PBET)、體外胃腸法(invitrogastrointestinal, IVG)和可溶性生物可給性研究聯(lián)合會方法(Solubility Bioaccessibility Research Consortium, SBRC)等[1]。重金屬的生物可給性通常被定義為重金屬經(jīng)過消化過程從環(huán)境介質中溶出至胃或腸道消化液中的部分占總量的百分比[1]，它優(yōu)于基于總量的評估方法，反映了人體胃腸道實際接觸重金屬的情況。即便如此，生物可給性依然無法確定有多少重金屬進入了人體內(nèi)。為更好地反映重金屬的吸收轉運，研究者把通過胃腸道吸收進入人體內(nèi)循環(huán)的重金屬量占重金屬總量的百分比定義為生物有效性(bioavailability)，在此基礎上能較好地對人體重金屬暴露風險展開評估[2]。

目前，研究者們通過動物實驗(invivo)或體外實驗(invitro)開展了有關重金屬的生物有效性和暴露毒性研究。但由于動物實驗存在周期長、成本高、實驗動物與人體的物種間差異等缺陷，限制了動物實驗在重金屬相關研究上的應用。相較之下，體外實驗具有成本低、高通量、重復性好的優(yōu)點，一些研究者選擇體外腸細胞模型開展重金屬腸道暴露的體外實驗研究。重金屬的跨腸細胞轉運是重金屬對人體內(nèi)臟器官產(chǎn)生毒害的重要前提，因而腸細胞模型在重金屬生物有效性、吸收轉運和毒性機制研究中受到特別關注。為了盡可能模擬體內(nèi)腸道功能，多種體外腸道模型得以成功構建與應用。本文綜述了腸道上皮層的結構功能、體外腸道細胞模型發(fā)展、腸細胞模型在重金屬生物有效性或吸收研究中的應用及優(yōu)缺點分析、模型優(yōu)化方法等，并對腸細胞模型的發(fā)展方向進行了展望。

1 人體腸道上皮的結構與功能(The structure and function of human intestinal epithelium)

1.1 人體腸道上皮層結構與功能

攝入受重金屬污染的食物是人體重金屬暴露的重要途徑。進食后，經(jīng)口腔和胃作用后的食糜被送入腸道完成主要的吸收過程。人體消化道中約90%的吸收過程發(fā)生在腸道的小腸之中，其具有不同尺度上的折疊結構，如腸絨毛(villi)和微絨毛(microvilli)，使其具有巨大的表面積，實現(xiàn)對物質的最大程度吸收，同樣包括了對重金屬的吸收[3]。因此，腸道組織結構和各類腸細胞類群的功能特征對建立和優(yōu)化體外腸道細胞模型尤為重要。

在腸道組織結構中，腸道與腸腔直接接觸的是上皮層(圖1)，其能夠實現(xiàn)腸道的主要功能，具有自我更新能力，由包括執(zhí)行選擇性吸收的吸收性腸上皮細胞(absorptive enterocytes)、分泌黏液的杯狀細胞(goblet cells)、轉運顆粒和呈遞抗原的微褶皺細胞(microfold cells，簡稱M細胞)和分泌抗菌肽的潘氏細胞(Paneth cells)等構成。此外，巨噬細胞和淋巴細胞等免疫細胞散布于上皮層下的結締組織、毛細血管和淋巴組織中，它們同樣對腸上皮功能起著重要作用。腸腔側，覆蓋著上皮細胞的黏液、共生微生物和食糜也與腸道上皮功能密切相關[3]。腸上皮細胞之間通過緊密連接(tight junction)維持了腸道上皮的完整性，并與黏液、細胞分泌的抗菌肽等一起維持了腸道上皮的屏障功能，實現(xiàn)了腸道分泌、免疫和物質的選擇性吸收功能[3]。基于對上述腸道上皮結構與功能的理解，提出并建立了多種腸道細胞模型。

1.2 重金屬的腸道上皮細胞轉運

腸道吸收性上皮細胞作為腸道吸收轉運物質的關鍵部位，存在4種吸收轉運方式：細胞旁途徑擴散(paracellular diffusion)、跨細胞途徑的被動擴散(passive diffusion)、轉胞吞作用(tanscytosis)和載體介導的轉運(carrier-mediated transport)。一些低分子量的親水分子能夠直接通過細胞旁途徑穿過腸道上皮細胞層，細胞旁途徑轉運受細胞間緊密連接和黏附連接的調(diào)控，緊密連接是腸道上皮屏障的重要組成部分，能夠阻止物質自由穿越腸道上皮細胞層。據(jù)報道，一些毒性重金屬如砷、鎘和汞能夠通過調(diào)節(jié)細胞緊密連接相關蛋白質的表達來增強細胞旁路途徑的通透性[4]。小分子可以通過不依賴能量的被動擴散穿過腸道上皮細胞膜的脂質雙分子層。轉胞吞作用是腸道上皮細胞腸腔側通過受體介導的胞吞，將分子吸收，然后通過胞吐將內(nèi)吞物釋放轉運到細胞的基底側的吸收轉運過程。

作為載體介導的轉運方式，金屬離子轉運蛋白(transporter)調(diào)控著重金屬在腸上皮細胞膜上的進出，這是腸上皮細胞吸收和轉運重金屬的重要途徑，本文綜述了部分轉運蛋白對重金屬的轉運功能(表1)。內(nèi)流轉運蛋白(influx transporter)在腸腔側將金屬離子吸收進細胞，而外排蛋白(efflux transporter)可以將金屬離子從細胞內(nèi)排出腸上皮細胞的基底側或腸腔側。鐵、錳和鋅等金屬是人體的必需元素，細胞膜上存在著吸收轉運這些金屬的轉運蛋白，而一些毒性重金屬與必需元素特征相近，采用模仿“搭便車”的方式，競爭或劫持必需元素的轉運蛋白進入細胞，這一過程被稱為離子擬態(tài)(ionic mimicry)[5]。例如，在腸道吸收過程中，鎘能夠利用細胞重要的二價金屬轉運蛋白DMT1(divalent metal transporter 1)進入腸上皮細胞[6]。除此以外，重金屬還能通過分子擬態(tài)(molecular mimicry)間接被細胞吸收轉運，部分重金屬能夠結合到生物分子的特定位點上形成復合物，結合了重金屬的生物分子復合物通過轉運蛋白(如氨基酸轉運蛋白、有機陰離子轉運蛋白)攜帶著重金屬完成了跨膜轉運[5]。如砷在細胞內(nèi)能夠與谷胱甘肽形成As(GS)3復合物，Shukalek等[7]研究發(fā)現(xiàn)多藥耐藥蛋白(multidrug resistance-associated protein)MRP1和MRP2負責將As(GS)3復合物轉運出細胞。

圖1 小腸上皮的組織結構Fig. 1 The structural pattern of small intestinal epithelium

2 基于腸道細胞的體外模型(In vitro models based on intestinal cells)

為研究重金屬的生物有效性、吸收轉運過程和毒性效應及其機制，模式動物(如小鼠)被廣泛應用，然而隨著研究深入，越來越多的報道指出小鼠腸道結構、菌群與人類存在差異，因此，動物模型并不能完全模擬人體腸道[17]。此外，出于實驗倫理考慮，歐盟等發(fā)達地區(qū)以替代(replace)、減少(reduce)和優(yōu)化(refine)的“3R原則”提倡科研者使用體外方法替代和減少動物實驗。鑒于此，腸道細胞模型為重金屬的腸道暴露研究提供了一種具有較好生理相關性的體外方法，其采用的人源細胞能較好地模擬人體腸道的功能特征，并在不同實驗室表現(xiàn)出了較高的可重復性，還具有實驗成本低、高通量和周期短等優(yōu)點。

隨著細胞生物學的發(fā)展，腸道細胞體外模型日益完善。基于Transwell小室的腸道細胞模型(圖2(a))早期被應用于藥物吸收研究領域，近年來陸續(xù)應用在環(huán)境污染物的生物有效性、吸收轉運和毒性研究上，這有助于更早識別出生物有效性高、毒性大的污染物，為污染物的人體健康風險評價提供依據(jù)。目前，腸道細胞模型在重金屬人體暴露方面的研究可簡要歸納為以下幾點：(1)人體對環(huán)境介質中重金屬的吸收轉運過程和生物有效性研究；(2)環(huán)境介質中的其他成分對重金屬吸收轉運的影響研究；(3)重金屬暴露對人體所需營養(yǎng)元素攝取的影響研究；(4)重金屬對腸道產(chǎn)生的直接毒性效應及其機制研究。

2.1 腸道細胞單培養(yǎng)模型

腸道細胞單培養(yǎng)模型所采用的細胞大多來源于人結腸腺癌，相較于更復雜的細胞模型，它具有成本低廉、技術簡單等優(yōu)勢，目前仍然是應用最廣泛的一類腸道細胞模型(圖2(b))。近年來，許多環(huán)境污染物腸道暴露研究采用了這一模型，并取得了與動物實驗相近的結果[18]。基于研究需求，Bourgine等[19]報道了一些常用于建立腸道細胞模型的細胞系基因表達譜，以幫助研究者根據(jù)具體需要，選擇合適的腸道細胞材料。Caco-2、HT29和T84細胞系常用于建立腸道細胞單培養(yǎng)模型，是目前研究最多和應用最廣的腸道細胞系。

表1 人體腸道上皮細胞負責重金屬轉運的相關蛋白Table 1 Transporters for transporting heavy metals in human intestinal epithelial cells

2.1.1 Caco-2細胞模型

分離自人結腸腺癌的Caco-2細胞系長期被廣泛用于重金屬的生物有效性、腸道吸收轉運和毒性效應研究。盡管Caco-2細胞源自人結腸腺癌，但其能夠表達大多數(shù)吸收性腸細胞的形態(tài)和功能特性，是建立腸細胞模型的良好材料，許多改進版的腸道細胞模型也是以Caco-2細胞為基礎發(fā)展起來的。Caco-2模型的建立一般將Caco-2細胞在Transwell小室中培養(yǎng)21 d，在此期間Caco-2細胞生長匯合，并自發(fā)分化，細胞頂部(腸腔側)逐漸形成具有微絨毛的刷狀緣，細胞之間形成緊密連接，表達多種轉運蛋白和代謝酶，最終形成一層極化的吸收性腸細胞層。

Caco-2細胞模型常應用于環(huán)境介質中的重金屬生物有效性和吸收轉運機制的研究[20-22]。研究方法簡言之，即對介質進行體外模擬消化后，用緩沖鹽溶液或培養(yǎng)基對模擬消化液進行混合配比，使其達到細胞生存所需的營養(yǎng)與滲透壓要求，后將溶液加入Caco-2細胞模型的腸腔側進行轉運實驗。Lee和Lee[22]對砷污染稻米進行體外模擬消化，結合Caco-2模型轉運實驗發(fā)現(xiàn)，大米中的總砷生物有效性在16%～38%之間，為評估食用稻米帶來的砷暴露風險提供重要信息。而Fujishiro等[6]利用Caco-2模型研究轉運蛋白DMT1和ZIP14在鎘吸收轉運過程中的作用，進一步闡述了鎘跨上皮吸收轉運的分子機理。

食物基質或藥物對重金屬的生物有效性可能會產(chǎn)生一定影響，因此Caco-2模型可被用于發(fā)掘和篩選降低重金屬暴露風險的方法。Lee等[22]研究發(fā)現(xiàn)精白米中總砷的生物有效性(31%)高于糙米(21%)，研究結果可為砷污染區(qū)居民砷暴露風險防控提供科學膳食指導。此外，Caco-2模型實驗還發(fā)現(xiàn)一些食品添加劑能降低重金屬的生物有效性。Fu和Cui[23]在受污染小白菜的體外模擬消化過程中分別添加FeCl3、CaCl2和醋酸，經(jīng)Caco-2模型轉運后發(fā)現(xiàn)3種添加劑均能降低鎘和鉛的生物有效性。近年來，通過類似研究，一些物質對重金屬吸收的抑制或促進作用也被陸續(xù)揭示[24-25]。同理，Caco-2模型也能被用于研究重金屬暴露對人體營養(yǎng)物質吸收的影響，不過目前這一領域的研究仍很少。

此外，Caco-2模型還被大量用于重金屬對腸道上皮毒性的研究。腸道屏障的完整性是腸道上皮細胞選擇性吸收物質的前提，重金屬暴露可能破壞腸道屏障的完整性，導致腸上皮細胞旁路途徑轉運通量的增加，使外源有害物質更易進入人體。Luo等[18]利用Caco-2模型發(fā)現(xiàn)鎘暴露導致細胞旁路通透性增強，進一步研究發(fā)現(xiàn)，這是由于鎘暴露引起細胞鈣黏蛋白E和閉鎖蛋白減少，導致腸屏障破壞。許多重金屬能直接或間接誘導細胞產(chǎn)生活性氧，過量的活性氧將導致細胞產(chǎn)生氧化損傷甚至死亡，Sutherland等[26]將Caco-2模型暴露于多種重金屬污染的魚和牡蠣提取溶液，發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶活性被激活，Caco-2細胞發(fā)生氧化應激反應。

Caco-2模型仍存在許多局限性。Caco-2細胞會隨著培養(yǎng)時間和傳代次數(shù)的增加，發(fā)生異質性變化現(xiàn)象，為了減少Caco-2細胞的異質性，目前已從Caco-2細胞系中分離出克隆型，如Caco-2/TC-7、Caco-2/15和Caco-2/AQ等。其中，Caco-2/TC-7細胞保留了親本Caco-2的功能特征，但分化速度更快，且更為均一穩(wěn)定[27]。相較于人真實腸道，Caco-2模型缺乏黏液層，而黏液層是腸道上皮屏障的重要組成部分，為模擬黏液層，研究者采用Caco-2細胞與產(chǎn)生黏液的腸道細胞(如HT29)共培養(yǎng)(co-culture)的方法來建立腸道細胞模型[28]。此外，Caco-2細胞還存在高表達P-糖蛋白(P-gp)和低表達代謝酶的缺陷，因此Caco-2模型仍需更新和改進。

2.1.2 HT29細胞模型

HT29細胞系源自人結腸腺癌，HT29細胞模型同樣可用于生物有效性和細胞機制的研究。不同于Caco-2細胞，HT29細胞的分化不是自發(fā)進行的，而是營養(yǎng)和培養(yǎng)條件驅動的，HT29細胞系被認為是一種多能的細胞系，根據(jù)其培養(yǎng)條件的不同，細胞將會以不同路徑分化[29]。在一定培養(yǎng)條件下(例如高葡萄糖無血清培養(yǎng)條件)，HT29細胞會分化為杯狀細胞樣，具備分泌黏液的能力[29]。Lecoeur等[30]采用HT29細胞建立了單培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)鎘能夠通過Nramp2轉運蛋白進入腸上皮細胞，并證明了鎘在細胞內(nèi)的積累量與金屬硫蛋白的含量部分相關。

除HT29親本細胞以外，較常用的亞克隆細胞系還有HT29-MTX，其通過甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)對HT29細胞進行藥物抗性篩選獲得[31]。與HT29細胞的不同，HT29-MTX細胞能夠自發(fā)分化為杯狀細胞樣細胞[31]，有助于簡化實驗步驟。然而HT29和HT29-MTX細胞生長緩慢，低表達乳糖酶，且細胞間緊密連接性能不足[32]，因此較不適合用于單獨建立細胞模型開展重金屬相關研究，其更多是和Caco-2細胞建立共培養(yǎng)模型。

2.1.3 T84細胞模型

來源于人結腸癌(肺轉移)的T84細胞系也能用于構建腸細胞模型。T84細胞培養(yǎng)在Transwell膜上能形成細胞間緊密連接和微絨毛的極化細胞單層，但微絨毛數(shù)量較少，沒有在細胞腸腔側形成明顯的刷狀緣。不同于Caco-2細胞系，T84細胞在分化過程中始終表現(xiàn)結腸細胞特征，在許多研究中作為結腸模型[33-35]。Breton等[33]選用T84細胞于Transwell膜上建立了細胞模型，用CdCl2和PbCl2分別暴露細胞模型的腸腔側24 h，其中20 μmol·L-1CdCl2誘導T84模型發(fā)生可逆的屏障損傷，而68 μmol·L-1CdCl2則對屏障造成不可逆損傷，而1 000 μmol·L-1PbCl2并不誘導屏障損傷，這表明重金屬對腸上皮單層滲透性的影響取決于元素種類、暴露時間和暴露濃度。不過目前基于T84模型的重金屬研究仍然較少，作為結腸模型的T84細胞模型更多被用于電解質轉運機制的研究[36]和與腹瀉有關的Cl-分泌研究[34-35]。可見T84模型在開展重金屬暴露下的結腸電解質紊亂和腹瀉方面的研究具有一定潛力。

綜上所述，腸細胞單培養(yǎng)模型在重金屬研究領域的應用十分廣泛。但隨著研究的不斷深入，許多報道證實，單培養(yǎng)模型結構單一，難以完全模擬體內(nèi)腸道細胞的生理功能，包括多種關鍵代謝酶和部分轉運蛋白的低表達、黏液層的缺失等[20, 37](表2)，因而很難滿足人體腸道暴露重金屬的精確研究。鑒于此，研發(fā)生理功能更為接近體內(nèi)腸道的模型成為研究者們努力的新方向。

2.2 腸道細胞共培養(yǎng)模型

生理狀態(tài)下的腸道上皮層通常由多種細胞類群組成，不同細胞相互協(xié)作，共同組成了腸道上皮層的結構與功能。因此，研究者們提出，可以利用不同種類腸道細胞，借鑒細胞共培養(yǎng)技術在體外構建功能化的腸道細胞模型[26]。目前的腸道細胞共培養(yǎng)模型多是在Caco-2模型的基礎上發(fā)展起來的，共培養(yǎng)模型整合了2種或2種以上細胞，相比于細胞單培養(yǎng)模型，其能更好地模擬復雜的腸道上皮組織結構。

2.2.1 Caco-2/HT29細胞共培養(yǎng)模型

在人腸道上皮中，分泌黏液的杯狀細胞占到了10%～25%，黏液是人腸道屏障的重要組成部分，起著應對外源有害物質威脅的作用。Caco-2模型缺乏分泌黏液的能力，無法模擬人腸道黏液層，這一缺陷可以通過建立Caco-2/HT29細胞共培養(yǎng)模型來克服，在此模型中Caco-2細胞提供屏障功能和作為吸收性腸細胞，而HT29細胞作為生成黏液的杯狀細胞。但是，在模型建立過程中，HT29細胞向杯狀細胞樣分化需要設置特定的培養(yǎng)條件，這導致實際步驟較為繁瑣，還易分化形成異質細胞[31]，因此實際研究中較多選擇HT29-MTX細胞用于Caco-2/HT29共培養(yǎng)模型的構建。Caco-2/HT29模型在腸腔側覆蓋的黏液層通常被認為是腸道接觸或吸收重金屬的重要屏障。另外，黏液層也能影響外源物質在腸壁上的停留時間[38]。Vázquez等[38]基于Caco-2/HT29-MTX模型研究Hg2+和甲基汞的轉運，結果表明共培養(yǎng)模型對Hg2+和甲基汞的轉運能力弱于Caco-2模型，這一現(xiàn)象被解釋為Hg2+和甲基汞被保留在了黏液層中。

在屏障功能上，Caco-2/HT29模型緊密連接性能不如Caco-2模型緊密，但與人體腸道實際情況更為接近，這使得細胞旁路途徑轉運通量增加[28]。此外，關于轉運蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，Caco-2/HT29模型中二價金屬轉運蛋白DMT1的表達高于Caco-2或HT29細胞單培養(yǎng)模型[39]。目前Caco-2/HT29模型在重金屬的生物有效性研究方面應用較多[28, 38]。Lv等[28]分別使用Caco-2/HT29模型和Caco-2模型研究了煮熟大米中鎘的生物有效性，發(fā)現(xiàn)Caco-2/HT29模型對鎘的吸收轉運活性高于Caco-2模型。但目前該細胞模型的建立存在一些難點，如在建立該模型的過程中2種細胞的生長速度不一，導致模型穩(wěn)定建立時2種細胞比例偏離預期，目前主要采用根據(jù)實際情況摸索并調(diào)整Caco-2/HT29細胞比例的方法解決[40]。

2.2.2 Caco-2/免疫細胞共培養(yǎng)模型

常見的腸道細胞模型主要采用上皮細胞，卻忽視免疫細胞是腸道上皮中的第二大細胞類群，免疫細胞在腸道細胞間通訊、炎癥反應和分化控制中發(fā)揮著重要作用。研究者理解并利用腸道上皮細胞與免疫細胞之間的關聯(lián)性，建立了以Caco-2模型為基礎的Caco-2/免疫細胞共培養(yǎng)模型，該模型能夠為研究重金屬引起的腸道上皮炎癥和腸道細胞-免疫細胞間通信提供有效工具。目前，常用以建立此模型的免疫細胞主要有人外周血單核細胞(PBMC)、人髓系白血病單核細胞(THP-1)和人Burkitt’s淋巴瘤細胞(Raji B)等。目前比較主流的Caco-2/免疫細胞模型是在Transwell膜上培養(yǎng)腸道細胞，待其形成完整單層后(約14 d)，在膜的下側培養(yǎng)免疫細胞，2種細胞并不直接接觸。然而一些研究采用了較為特殊的建立方法，Susewind等[41]將2種細胞培養(yǎng)在同一腔室中，使兩者直接接觸；還有的研究則采用3 μm孔徑Transwell建立Caco-2/免疫細胞共培養(yǎng)倒置模型，用于考察免疫細胞在腸上皮層的遷移[42]。

Caco-2/免疫細胞模型目前多用于納米顆粒毒性、微生物對腸道炎癥的影響和細胞間通信研究[43-44]，在重金屬領域的研究較少。不過近幾年陸續(xù)有研究采用此模型開展金屬毒性的相關研究。K?mpfer[45]建立了Caco-2/THP-1共培養(yǎng)模型研究氧化銅(CuO)納米顆粒(nanoparticles, NPs)對腸道炎癥反應和通透性的影響。Calatayud等[46]報道了無機三價砷和2種有機三價砷MMA(Ⅲ)和DMA(Ⅲ)在Caco-2/PBMC共培養(yǎng)模型中的促炎癥作用，并檢測到釋放到基底側的炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8大幅增加。

在各種Caco-2/免疫細胞模型中，Caco-2/Raji B模型是較為特殊的一種。據(jù)報道，來源于人淋巴瘤的Raji B細胞能夠誘導Caco-2細胞分化為M細胞表型[41]。在人體實際環(huán)境中，M細胞通過在腸腔側的內(nèi)吞作用和基底側的胞吐作用跨腸上皮轉運多種物質(尤其是顆粒性物質的轉運)。利用Caco-2/Raji B模型，Ude等[47]評估了CuO NPs和CuSO4對腸道上皮屏障和炎癥因子分泌的影響，發(fā)現(xiàn)CuO NPs和CuSO4誘導的銅毒性水平相似，結合Caco-2/HT29-MTX模型的對比實驗發(fā)現(xiàn)，Caco-2/Raji B模型對CuO NPs和CuSO4的轉運效率更高，且對兩者的毒性更為敏感。此外，Huang等[48]進行了稀土金屬鑭的吸收轉運機制研究，氯化鑭和檸檬酸鑭在體外消化后>99.9%的鑭發(fā)生了沉淀，形成了粒徑200～600 nm的顆粒，Caco-2模型和Caco-2/Raji B模型的轉運實驗顯示M細胞是轉運磷酸鑭顆粒的主要途徑。這都表明Caco-2/Raji B模型在(重)金屬及其納米顆粒在人體暴露風險方面的研究具有一定潛力，盡管如此，該模型依然忽視了黏液和基質細胞的作用。

2.2.3 Caco-2/HT29/Raji B細胞共培養(yǎng)模型

綜合考慮上述各模型的優(yōu)缺點，一些研究者將Caco-2/HT29模型和Caco-2/Raji B模型結合，開發(fā)了囊括多種類型腸道細胞的Caco-2/HT29/Raji B細胞三重共培養(yǎng)模型[49]。該模型利用多種細胞各自的特征和共培養(yǎng)時的行為，以求在單層水平上更大程度地模擬人腸道上皮(圖2(c))。類似于Caco-2/免疫細胞模型，Caco-2/HT29/Raji B細胞共培養(yǎng)模型目前也多見于金屬納米毒理學的研究。Sohal等[49]建立Caco-2/HT29/Raji B共培養(yǎng)模型以研究Fe2O3NPs和ZnO NPs對腸道上皮的影響，發(fā)現(xiàn)ZnO NPs的毒性較強。此外，該研究還通過與Caco-2模型的對比實驗發(fā)現(xiàn)Caco-2/HT29/Raji B模型在研究金屬NPs毒性方面具有較高的生理相關性，顯著優(yōu)于Caco-2模型。

此外有研究者將納米顆粒毒性研究與金屬生物有效性研究相結合，深入研究了納米顆粒暴露對腸道吸收金屬元素或營養(yǎng)元素的影響。Mahler等[50]對比了腸道細胞模型與動物實驗的結果，證實了Caco-2/HT29/Raji B模型在金屬生物有效性和納米毒性交叉研究方面的潛力。該研究采用膳食性攝入的方式將三細胞模型暴露于聚苯乙烯納米顆粒，分析了聚苯乙烯納米顆粒暴露下的腸道模型對鐵的吸收與轉運，以及納米顆粒的跨腸上皮轉運，發(fā)現(xiàn)腸細胞模型對大粒徑(>200 nm)聚苯乙烯顆粒的轉運是主動耗能的過程，Raji B細胞誘導分化的M細胞在大粒徑顆粒物轉運中起重要作用，小粒徑氨基化聚苯乙烯納米顆粒則能夠增強腸道細胞對鐵的吸收與轉運。

盡管Caco-2/HT29/Raji B三細胞模型在重金屬相關領域的研究中鮮有應用，但不可否認的是，其在其他領域的研究方法和經(jīng)驗對重金屬研究極具參考價值。隨著實驗室硬件條件的改善和實驗技術的發(fā)展，這一更具生理相關性的細胞模型在重金屬領域具有廣闊的應用前景。

2.2.4 Caco-2細胞/靶細胞分層共培養(yǎng)模型

重金屬經(jīng)腸道上皮吸收轉運進入人體血液循環(huán)，最終到達相應的毒性靶器官，并對其產(chǎn)生毒害作用。因此，研究者將腸道細胞與不同器官來源的細胞共同建立了Caco-2/靶細胞分層共培養(yǎng)模型(圖2(d))，以期同時進行重金屬的生物有效性與生物毒性研究，并為重金屬細胞毒性參數(shù)和生物代謝轉化研究提供一種具有潛力的評估工具。該模型常見的共培養(yǎng)體系有Caco-2/肝細胞、Caco-2/血管細胞和Caco-2/神經(jīng)細胞等，這些共培養(yǎng)體系已被證明具有類似器官系統(tǒng)的功能，以及不同器官來源細胞之間的相互作用，并能夠用以檢測化學物質的吸收轉運和轉化代謝過程。

Caco-2/肝細胞共培養(yǎng)模型是一類典型的Caco-2/靶器官模型，肝細胞的引入能夠使模型在研究腸道吸收轉運和毒性效應的同時，開展腸細胞/肝細胞相互作用、肝毒性和肝臟代謝轉化的研究。Scheers等[51]在Caco-2細胞模型的基底側孔底培養(yǎng)了HepG2肝細胞，建立的Caco-2/HepG2模型被同時用于研究腸道對鐵的吸收轉運和肝細胞分泌的鐵調(diào)素(hepcidin)對腸道鐵吸收轉運的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，在鐵的腸道吸收轉運過程中，HepG2細胞通過分泌鐵調(diào)素與Caco-2細胞產(chǎn)生相互作用，Caco-2/HepG2細胞共培養(yǎng)模型增加了Caco-2細胞中的鐵蛋白水平，這也表明在研究中需考慮肝臟對腸道鐵吸收轉運的調(diào)節(jié)作用。此外，Sutherland等[26]采用Caco-2/肝HepaRG細胞共培養(yǎng)模型評估了人腸道細胞和肝臟細胞對多種有機污染物和重金屬污染的魚和牡蠣提取物的抗氧化反應，還通過單培養(yǎng)與共培養(yǎng)模型的比較研究提出，Caco-2/HepaRG共培養(yǎng)模型可能更適用于重金屬復合污染的毒性研究。這種共培養(yǎng)模式在研究重金屬或其他污染物對人類健康方面的影響尤為重要，因為肝臟是代謝最活躍的器官，負責外源性物質的解毒。

除上述模型外，一些研究者建立了Caco-2/血管內(nèi)皮細胞(如EA.hy926細胞)分層共培養(yǎng)模型，用于研究食品活性成分對炎癥反應和心血管疾病發(fā)展的影響[52-53]。另有研究者建立了Caco-2/神經(jīng)細胞(如PC12細胞)分層共培養(yǎng)模型，以研究腸上皮細胞與腸神經(jīng)細胞之間的相互作用，如Satsu等[54]研究Caco-2/PC12細胞共培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)Caco-2細胞合成分泌的神經(jīng)生長因子能夠促使神經(jīng)PC12細胞分化為交感神經(jīng)樣細胞，并促進神經(jīng)細胞軸突分支和生長。雖然這些模型目前應用的主要領域在食品科學和生命科學方面，但其可以推廣至包括重金屬在內(nèi)的污染物毒性研究中，如Caco-2/血管內(nèi)皮細胞模型可用于研究重金屬在被腸道吸收后引起的炎癥反應或對心血管疾病發(fā)展的影響，Caco-2/神經(jīng)細胞模型可評估重金屬吸收后對人體產(chǎn)生的神經(jīng)毒性。

腸細胞共培養(yǎng)模型雖說增加了腸道細胞類群，在一定程度上提高了生理擬真性，但共培養(yǎng)模型缺乏細胞與基質的相互作用，不能完全重建組織結構，一些癌癥來源的細胞系也與真實腸道細胞存在表達譜差異。但迄今為止共培養(yǎng)模型仍是研究重金屬跨腸道細胞吸收轉運和毒性機制的有利工具(表2)。為了開發(fā)更接近真實生理狀態(tài)的腸細胞模型，近年來干細胞、類器官和微流控芯片技術興起，這為3D化腸道細胞模型提供了新方向。

3 腸細胞模型體外功能化培養(yǎng)優(yōu)化研究(Optimization of functional culture of intestinal cell model in vitro)

由于建立腸道細胞模型一般需要維持21 d的培養(yǎng)以實現(xiàn)細胞的分化和緊密連接，較長的培養(yǎng)時間易使模型受到微生物污染而導致實驗失敗，因此許多研究者嘗試縮短腸道細胞模型建立所需時間。

生長因子是調(diào)節(jié)細胞的生長和分化的重要生物分子，馬美湖和黃晶[58]向Caco-2細胞培養(yǎng)基中添加生長因子抗壞血酸，模型完整建立的時間縮短為9 d。細胞外基質(ECM)是腸道上皮細胞的主要微環(huán)境成分，其中含有膠原、生長因子等生物分子，Li等[59]通過還原腸道細胞ECM的方式，將Caco-2細胞培養(yǎng)于小腸粘膜下層水凝膠之上，用時7 d即成功建立Caco-2細胞模型，同時添加ECM也是腸道細胞模型3D化的一種嘗試。此外，一些化學物質也能夠促進Caco-2細胞的生長與分化，例如在細胞培養(yǎng)基中添加細胞分化誘導劑丁酸，11 d內(nèi)建成模型[28]。

盡管快速建立法能大幅縮短模型建立所需的時間，減少實驗成本，但目前對待Caco-2快速建立模型的態(tài)度仍需謹慎，有研究發(fā)現(xiàn)通過快速方法建立的Caco-2模型的細胞外排蛋白表達較少，影響了物質的跨上皮轉運[60]。

4 腸道細胞模型的驗證評價方法(Validation methods of intestinal cell model)

驗證腸道細胞模型是否成功建立，需要對模型的完整性、分化特征和腸道功能進行檢測。測量細胞層的跨膜電阻值(transepithelial electrical resistance, TEER)是驗證模型完整性最為簡單易行的方法。隨著腸細胞的生長匯合以及緊密連接的加強，多孔膜上的孔隙不斷被細胞封閉，其TEER也不斷提高，因此運用跨膜電阻儀檢測模型的TEER即可快速檢驗細胞模型的完整性。通常，細胞間緊密連接性能越強，測得的模型TEER值就越高。在一項食品中重金屬生物有效性的研究中，研究者在進行轉運實驗前對模型進行驗證，檢測到TEER值達到520～610 Ω·cm2，高于設備參考值的250 Ω·cm2[55]。此外，細胞間緊密連接直接影響細胞旁路途徑轉運量。一些分子(如熒光黃、FITC標記的葡聚糖和甘露醇等)通過細胞旁路途徑實現(xiàn)跨腸道上皮轉運，因此當細胞間緊密連接性能越強、模型完整性越高時，此類分子越難以通過，借助這一現(xiàn)象也能夠驗證模型的完整性。例如，Lv等[28]通過檢測熒光黃的轉運量來驗證模型完整性，基于熒光黃的轉運量計算滲透系數(shù)，間接反映了模型的完整性。

表2 腸道細胞模型的優(yōu)缺點及其在重金屬研究領域的應用范圍Table 2 Advantages and limitations of each intestinal cell model and its application in the research areas of heavy metals

圖2 腸道細胞模型示意圖注：(a) Transwell小室；(b) Caco-2單培養(yǎng)模型；(c) Caco-2/HT29/Raji B細胞模型；(d) Caco-2/毒性靶細胞模型。Fig. 2 Illustration of intestinal cell modelsNote: (a) Transwell chamber; (b) Caco-2 cell model; (c) Caco-2/HT29/Raji B cell model; (d) Caco-2/target cell model.

對于模型細胞分化特征的驗證，最直觀的方法是用電子顯微鏡或原子力顯微鏡觀察腸道細胞形態(tài)。一項研究中采用的方法是將多孔膜從小室取下，將多孔膜上的細胞固定化后，經(jīng)包埋切片置于投射電子顯微鏡下成像，觀察細胞是否出現(xiàn)極化，細胞間的緊密連接、橋粒和細胞頂側的刷狀緣是否形成，以此作為細胞分化的依據(jù)[28]。除此以外，還可以通過免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)對不同細胞的特異性細胞標志物進檢測，如Caco-2細胞的P-糖蛋白(P-gp)、HT29-MTX的黏液蛋白(MUC)等。Mahler等[50]為驗證Caco-2/HT29/Raji B模型出現(xiàn)M細胞樣分化，對其特異性標志物整聯(lián)蛋白β1和Sialyl Lewis A antigen進行了免疫熒光染色，由此證明模型部分細胞出現(xiàn)M樣細胞分化。此外，為了衡量建成模型的腸道轉運功能，對轉運蛋白的活性進行檢測，如用模型單位時間內(nèi)對地高辛(digoxin)的轉運量驗證P-gp的轉運活性[61]，用5(6)-羧基-2’,7’-二氯熒光素(CDCF)檢測多藥耐藥相關蛋白(MRP2/3/5)的轉運活性[62]等。

5 展望：腸道細胞模型的3D化嘗試(Prospects: 3D modeling of intestinal cell model)

腸道細胞模型作為動物模型的替代，在重金屬暴露風險評估與毒性機制研究方面具有重要作用。從最初簡單的2D腸道細胞單培養(yǎng)模型，發(fā)展到多種細胞的2D共培養(yǎng)模型，再到3D腸道類器官模型，雖然腸道細胞模型已經(jīng)得到了一定發(fā)展，但在增加模型的生理相關性和重金屬研究應用方面仍有許多工作要做。目前，大多數(shù)腸道細胞模型仍然以2D形式構建，盡管2D模型尚存局限性，但其提供了一種比動物實驗更經(jīng)濟和道德的選擇，且與重金屬領域研究結合最緊密，并取得了不少有意義的研究結果，未來還能繼續(xù)在重金屬研究領域發(fā)揮其應有的作用。此外，近年出現(xiàn)了以微流控芯片、腸道類器官為代表的3D腸道細胞模型，有著更高的生理相關性與復雜性，是腸道-重金屬研究的良好改進方案，為未來的發(fā)現(xiàn)提供前所未有的機遇，但其挑戰(zhàn)在于目前高昂的研究成本和技術難度。

5.1 腸道類器官

由于腸道細胞模型所采用的永生或癌癥細胞系中的信號通路和核心代謝有所改變，動物模型也與人體實際腸道存在物種差異。為了更好地重現(xiàn)腸道上皮的復雜性，還原人腸上皮組織結構，研究者基于誘導分化培養(yǎng)或多能干細胞(pluripotent stem cells, PSCs)、胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)和腸干細胞(intestinal stem cells, ISCs)開發(fā)構建了人類腸道類器官(intestinal organoids，又稱mini-gut)[63]。在近年來對已知的發(fā)育線索和生長發(fā)育因子的理解基礎上，干細胞可以在人工ECM上誘導產(chǎn)生類似腸道器官的絨毛樣三維細胞結構，干細胞誘導分化形成多種腸道上皮細胞(包括腸干細胞、腸上皮細胞、杯狀細胞、潘氏細胞和內(nèi)分泌細胞) (圖3)，能夠實現(xiàn)人體腸道吸收轉運、屏障和分泌等多種功能[64]。

根據(jù)細胞的來源不同，腸道類器官分為HIOs(human intestinal organoids)和HIEs(human intestinal enteroids)2種類型。多能干細胞或胚胎干細胞來源的HIOs除腸道上皮外還可能具有間質，因為材料細胞的稀缺和干細胞培養(yǎng)的高成本，目前在腸道生理學或病理學研究中應用較少。HIEs是從腸隱窩組織中的腸干細胞發(fā)育而來的腸道類器官，能夠長期維持其原始的生理和遺傳特征[65]。然而，在ECM凝膠中培養(yǎng)的腸類器官是封閉的管腔結構，使得在實際研究中很難進行腸腔重金屬暴露或取樣操作。為了增強腸類器官的應用場景和可操作性，研究者將培養(yǎng)于ECM上的HIEs移植至平板或Transwell膜上用以開展獨立的腸道上皮暴露研究[66]。

不同于細胞模型和動物模型，腸道類器官培養(yǎng)反映了人體腸道上皮的細胞異質性，因此腸道類器官提供了一個全新的高生理相關性體外平臺，這個平臺為重金屬暴露風險研究帶來了新機遇。但不可否認的是，腸道類器官的取材存在著倫理問題，此外高成本、高人力的現(xiàn)狀也使得腸道類器官模型只在高水平研究中有應用空間。

5.2 “腸道芯片”模型

器官芯片(Organ-on-a-Chip)是一種微流控細胞培養(yǎng)裝置，重現(xiàn)人體活體器官的關鍵功能和微環(huán)境，為研究器官結構和功能提供了另一種途徑。它最初借鑒了計算機微電子芯片的制造方法(如光刻等)，它的主體結構為流體連續(xù)灌流的腔室，里面培養(yǎng)有用以模擬組織和器官的細胞(圖4)。目前常見的商業(yè)化腸道細胞模型平臺，如Transwell小室，上下腔室的培養(yǎng)液是靜止的，而在人體實際腸道環(huán)境中，腸道上皮承受著腸腔內(nèi)食糜的流動和剪切應力的作用。鑒于此，人體腸道微流控芯片又稱為腸道芯片(Gut-on-a-Chip)已被開發(fā)并應用于腸道生理學和病理學研究中。

已有研究團隊報道了基于聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)設計和制造的腸道微流控芯片的器件，微流控芯片系統(tǒng)為腸道細胞提供支持、流體持續(xù)灌注和實時監(jiān)控[67]。Bein等[68]報道，在Caco-2細胞和腸道來源的其他上皮細胞構建的腸道芯片中，同時施加腸腔側和基底側的流體灌流，能刺激腸細胞模型形成腸絨毛樣結構，絨毛生長高度可達上百微米，并增加腸道特異性功能的表達，包括黏液的分泌等。為更好重建腸道類器官的隱窩與絨毛結構，Shin等[69]結合生物來源的腸道類器官構建了腸道類器官-微流控芯片模型。近年來，腸道芯片模型的工程復雜性逐步增加，研究者通過流體管道連接不同器官微流控芯片陸續(xù)建立起腸道-血管芯片[67]、甚至腸道-多器官芯片模型，如腸-肝-皮膚-腎四器官芯片模型[70]等。

圖3 人腸道類器官的2種形式(HIEs和HIOs)注：PSCs為多能干細胞；ESCs為胚胎干細胞；ISCs為腸干細胞。Fig. 3 Illustration of two forms for human gut organoids (HIEs and HIOs)Note: PSCs means pluripotent stem cells; ESCs means embryonic stem cells; ISCs means intestinal stem cells.

圖4 腸道細胞微流控芯片[69, 71] 注：(a)微流控芯片實物；(b)微流控芯片剖面圖。Fig. 4 Illustration of intestinal cell microfluidic chip[69, 71]Note: (a) Microfluidic chip; (b) Section view of microfluidic chip.

許多微流控芯片研究團隊采用的是自制芯片，這就使得不同實驗室間的芯片參數(shù)與功能不盡相同，并且不是每個實驗室都有條件制造此類芯片。盡管目前已有商業(yè)化芯片的推出，使得不具備制造芯片條件的實驗室也能夠采用這一技術，但高昂的售價讓許多研究者望而卻步。未來，隨著腸道微流控芯片模型發(fā)展完善，腸道芯片能夠為研究包括重金屬在內(nèi)的污染物人體暴露風險評估提供新的技術方案，對于揭示重金屬等污染物人體暴露風險具有重要意義。