毛細管電泳技術在納米材料毒性研究領域的應用進展

張凌燕，黃沛力

1. 首都醫科大學公共衛生學院，北京 100069 2. 包頭醫學院公共衛生學院，包頭 014040

納米材料(nanomaterials, NMs)因其獨特的物理化學性質和良好的生物相容性在電子、催化、農業、紡織、包裝、化妝品、食品和生物醫學等各個領域的應用非常廣泛[1-8]。然而，這也導致了NMs不可避免地釋放到環境中，并通過接觸、吸入、口服給藥甚至注射等途徑造成直接或間接人體暴露。當NMs進入人體的生理環境后，血液、組織液和細胞質中復雜的生物分子混合物都可能與NMs相互作用，形成被稱為“蛋白冠”或“小分子冠”的NMs和生物分子的復合物。這些復合物的形成不僅改變了NMs的組成和聚集狀態，影響其生物分布、細胞攝取和細胞毒性，而且還可能改變生物分子的結構和生物學功能而導致疾病的產生[9-12]。此外，不同組成、尺寸、形狀和表面修飾官能團的NMs與生物分子的相互作用也存在很大差異[13-14]。因此，發展能夠詳細描述NMs、生物分子以及NMs和生物分子相互作用形成的復合物的分析技術不僅可以更好地理解它們在體內的生物學行為和最終命運，而且對NMs的安全性評價、優化NMs設計合成和減輕NMs毒性至關重要。

常用于直接測量NMs和生物分子相互作用的技術包括熒光光譜、表面等離子體共振、等溫滴定量熱法等[15-17]。熒光光譜能夠根據NMs和生物分子相互作用后熒光強度、峰位移和熒光壽命等的改變獲得結合參數信息，但是要求分析物必須有自發熒光或熒光標簽，并需要在實驗過程中排除生物分子自身熒光的干擾和嚴格控制影響熒光穩定性的條件。表面等離子體共振技術可提供NMs和生物分子結合的反應動力學和親和力參數，但需要通過復雜的步驟將NMs或生物分子固定在芯片表面，芯片價格昂貴且不可重復利用，對相對分子質量小的生物分子的檢出限也較高。等溫滴定量熱法能夠給出NMs和生物分子相互作用的熱力學參數，但測定一個樣品所需的滴定時間較長(1.5～4 h)，無法實現高通量檢測。因此，這些方法都難以快速、簡便和靈敏地研究具有廣泛物理化學性質的NMs和生物分子的相互作用，更無法實時監測NMs和生物分子相互作用的動態變化過程[18]。

毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)技術是以高壓直流電場為驅動力，毛細管為分離通道，依據待測樣品中各組分在毛細管內電泳、電滲淌度或分配行為的不同而實現分離的一種新型液相分離技術。作為一種高靈敏、高分辨、高通量、條件溫和以及低消耗的分析技術，CE在表征和分析原始NMs、生物或環境中存在的NMs以及NMs從生物或環境基質中獲得的冠狀物成分方面具有很大潛力[19-22]。隨著近年來高靈敏度檢測器、高性能毛細管柱的研發和儀器聯用技術的應用，CE成為研究NMs與生物分子相互作用的一種重要手段，不僅可以在線監測NMs與生物分子相互作用的動態行為變化，而且能夠收集結合參數信息并評估NMs對生物分子的反應性和親和力[23-25]。本文主要從NMs與蛋白質的相互作用(包括動態行為表征、結合平衡分析、蛋白冠的形成和轉換監測)、NMs與其他生物分子的相互作用這2個方面綜述了近10年來有代表性的CE技術在NMs毒性研究領域的應用及取得的新進展，為了解NMs進入體內后的生物學行為和評價NMs的生物安全性提供新思路。

1 納米材料與蛋白質的相互作用(Interaction between nanomaterials and proteins)

當NMs暴露在復雜的生理環境時，多種生物分子可結合到其表面而形成蛋白冠。蛋白冠決定了NMs在生物體內被細胞識別的方式，并能夠調節NMs的攝入、清除以及在體內的轉運過程[26-27]。CE技術作為描述NMs與蛋白質相互作用過程的有力手段，得到很多研究者的青睞。

1.1 動態行為表征(Characterization of dynamic behavior)

CE技術可以有效考察NMs與蛋白質之間相互作用的動態行為，通過記錄相當長一段時間(24 h或更長)內的遷移時間和峰面積來評估NMs、蛋白質以及NMs和蛋白質形成的復合物的變化。

Li等[28]采用毛細管區帶電泳(capillary zone electrophoresis, CZE)和親和毛細管電泳(affinity capillary electrophoresis, ACE)這2種分離模式分別研究了牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)與超順磁Fe3O4納米顆粒(nanoparticles, NPs)和Au NPs的相互作用。該研究發現，BSA與Fe3O4NPs的相互作用表現為慢速結合動力學，二者需混合孵育過夜后復合物的峰才不再變化，即相互作用達到平衡。隨著BSA濃度的增加，Fe3O4NPs的峰高逐漸降低至最終消失，且在峰左側出現的Fe3O4NPs-BSA復合物峰向左輕微移動，說明每個Fe3O4NPs中BSA分子的數量隨著蛋白濃度的增加而增加，直至由于空間位阻而無法容納更多BSA。而BSA與Au NPs的相互作用表現為快速結合動力學，電泳緩沖液中的BSA與樣品中的Au NPs相遇后即發生相互作用，但該相互作用僅使遷移率發生變化，而未使復合物和游離Au NPs的峰分離。隨著BSA濃度的增加，Au NPs的遷移時間縮短，表明Au NPs粒徑增大，且該變化隨著BSA濃度的增加越來越小，直到BSA達到一定高濃度時遷移率幾乎不再變化。Matczuk等[29]采用毛細管電泳-電感耦合等離子體質譜(capillary electrophoresis coupled inductively coupled plasma mass spectrometry, CE-ICP-MS)研究了檸檬酸鹽修飾的Au NPs與白蛋白(albumin, ALB)、轉鐵蛋白(transferrin, TRF)2種血清蛋白之間的相互作用。該研究發現，在37 ℃條件下，10～50 nm的Au NPs與ALB孵育5 min后游離Au NPs的峰已消失，而5 nm的Au NPs與ALB孵育24 h后仍有5%的游離Au NPs存在。然而，Au NPs與TRF結合達到平衡大約需要5 min，且形成的結合物隨Au NPs粒徑增大而增多，但總量不超過10%，即平衡時主要以未結合的Au NPs為主。

Matczuk等[30]還使用CE-ICP-MS方法觀察了CdSeS/ZnS量子點(quantum dots, QDs)與ALB、TRF這2種血清蛋白結合的兩步動力學機制。在第一階段，只有一小部分QDs(約4%)轉化為蛋白質結合形式，但1 h后在電泳圖中就只觀察到一個單獨的與ALB結合物相對應的Cd或Zn的信號，即CdSeS/ZnS QDs已全部轉化為QDs-ALB結合物形式。而QDs-TRF結合物的形成要快得多(約5 min)，并顯著導致ZnS殼層從CdSeS核上解體。Wang等[31]利用毛細管電泳-熒光(capillary electrophoresis coupled fluorescence, CE-FL)檢測法研究了CdSe/ZnS QDs與多巰基變性BSA(denatured BSA, dBSA)在不同pH和離子強度下相互作用的機理和動力學，發現QDs與dBSA的相互作用動力學表現為兩相動力學，即初始階段為線性，隨后為飽和平衡階段。此外，該研究還發現QDs表面的結合位點有不同的優先級，可以分層組裝配體，且會導致QDs表面多價巰基的低程度取代。當dBSA和QDs混合后，由于形成了多種QDs-dBSA預飽和中間體，在電泳圖中可以分離出從游離QDs到結合QDs的不同形式，且形成的QDs-dBSA配合物的量與混合的物質的量比例和混合時間相關。

1.2 結合平衡分析(Analysis of binding equilibrium)

當NMs表面結合蛋白質的濃度隨時間延長而不再改變時，即達到動態平衡狀態。收集達到平衡時的結合數據對研究NMs與蛋白的相互作用非常重要，它可以為預測細胞系統對不同NMs的吸收所作出的反應提供依據。結合平衡常數(K)以及其他附加親和參數可以用CE內外相互作用模式來測定，如生物分子與每個粒子的結合數、結合協同性以及表觀速率常數等(表1)。當發生快速反應(tbinding<>tCE)，需要將反應混合物孵育一段時間后再進行分析，并分別使用CZE或FACE監測電泳遷移率或峰高的變化來獲得結合參數。Matczuk等[32]利用CE-ICP-MS同時檢測NMs中的金屬元素和蛋白質中的硫元素來確定蛋白冠的化學計量組成。通過計算發現不同粒徑的Au NPs與ALB或人血清相互作用后的蛋白質結合個數非常一致，這可能是由于ALB在血清中占主導地位。Boulos等[33]還利用ACE對具有不同表面電荷的Au納米棒(nanorods, NRs)與BSA的結合進行了定量。通過測量隨著電泳緩沖液中蛋白濃度的增加Au NRs遷移率的改變來測定BSA吸附到每個帶負電和不帶電的Au NRs上的結合平衡常數，發現無論Au NRs表面電荷多少，BSA與所有測試的Au NRs均具有類似的結合親和力。

當研究毛細管內相對快速達到結合平衡的相互作用時，可采用電泳介導的微分析(electrophoretically mediated microanalysis, EMMA)方法。例如，Wang等[34]采用EMMA法研究QDs和dBSA在毛細管內的自組裝動力學，將QDs和dBSA連續注入毛細管，在恒定電場作用下，由于QDs的遷移速度比dBSA慢(dBSA第2位置注入)，二者會發生局部微混合。通過該方式將不同物質的量比例的QDs和dBSA在毛細管內混合后觀察其相互作用。此過程中QDs-dBSA結合物的峰隨著dBSA濃度的增加而增加，而QDs的峰逐漸減小，直到dBSA∶QDs的物質的量比為32∶1時達到平衡狀態。通過Hill方程可計算QDs和dBSA相互作用的解離常數(KD)和結合協同性(binding cooperativity, BC)。而當QDs作為背景電解質組分時，還可以監測其與2個不同生物分子的結合順序[35-36]。

表1 毛細管電泳技術(CE)研究納米材料和蛋白質相互作用的結合信息Table 1 Binding information of the interactions between nanomaterials and proteins obtained by capillary electrophoresis (CE)

當研究的NPs和蛋白質之間的相互作用相對較弱時，可以采用毛細管電泳電動力學Hummel-Dreyer方法(CE-HD)。例如，Ramírez-García等[37]在研究PEG功能化的ZnGa1.995Cr0.005O4NPs(ZGO-PEG NPs)與BSA之間的非特異性相互作用時，首次嘗試使用該方法測定了不同離子強度下的結合常數和結合位點數。該方法對結合參數的微小變化非常敏感，能夠反映帶相反電荷的離子在NPs表面的凝結，表明ZGO-PEG NPs與BSA之間存在靜電相互作用。

1.3 蛋白冠的形成和轉換監測(Monitoring of formation and transformation of protein corona)

在生理環境如血清中，NMs會遇到復雜的蛋白質組，因而會形成隨時間動態變化的蛋白冠。蛋白冠的形成和組成受多種參數控制，如NMs的大小、形狀和修飾官能團，蛋白質的豐度、與NMs的結合親和力，血清基質成分等。采用CE-ICP-MS技術可以在復雜的基質中對含有可檢測元素的NMs及其蛋白冠的形成和轉換過程進行定性和定量監測。

Matczuk等[29]利用CE-ICP-MS檢測Au、Fe和S元素，發現血清中的全鐵轉鐵蛋白(holo-transferrin, holo-TRF)、脫鐵轉鐵蛋白(apo-transferrin, apo-TRF)和ALB與Au NPs的結合狀態會隨時間延長而發生改變。在與血清相互作用2 min后，Au NPs就會轉化為ALB和TRF結合物的形式。然而，當Au NPs在血液中的循環時間延長至4 h后，2種形式的TRF峰均消失，即ALB完全取代了2種形式的TRF，成為蛋白冠中唯一的平衡成分。此外，Au NPs的尺寸影響蛋白冠的形成，不同大小的Au NPs表面形成蛋白冠的相對含量和吸附平衡時間存在差異，如5 nm和50 nm的Au NPs分別在20 min和24 h達到吸附平衡。而當NMs表面化學性質不同時，其結合行為也存在差異。例如，將人血清和Au NRs混合后，Au NRs-PEG-COOH和apo-TRF立刻形成吸附層，成為主要的蛋白冠，該過程大約40 min完成；而Au NRs-PEG-NH2則首先形成ALB結合物，但這種軟冠中的ALB會逐漸被其他不太豐富的蛋白取代，說明這些蛋白對胺化表面具有更高的親和力[38]。

此外，研究發現，ALB與CdSeS/ZnS QDs表面的結合在1 h后完成，且沒有明顯破壞QDs的核殼結構；而TRF與之結合后則會導致ZnS外殼的解離[30]。該研究還發現，CdSeS/ZnS QDs在真實血清環境中同樣也會失去外殼，但并不是因為與主要轉運蛋白結合，而是與ALB和TRF以外的血漿蛋白相互作用，表明一些較小的血漿蛋白可能對QDs表面有更高的親和力。該結果有助于闡明QDs向機體目標區域傳遞的機制，但不能明確CdSeS/ZnS QDs失去外殼是否會產生特定類型的NMs毒性。

2 納米材料與其他生物分子的相互作用(Interaction between nanomaterials and other biomolecules)

CE評價NMs與生物分子之間的相互作用并不局限于蛋白質，在生物基質中存在的其他小分子如寡核苷酸、病毒、DNA、適配體和多肽等也可能和NMs相互作用形成冠。

Alsudir和Lai[40]利用毛細管電泳-紫外(capillary electrophoresis coupled ultraviolet, CE-UV)檢測法分析了TiO2NPs與單鏈DNA和雙鏈DNA的相互作用，發現TiO2NPs與單鏈DNA結合后涂上PEG涂層可精確測定分散TiO2NPs的濃度，分析靈敏度提高10倍～16倍。該研究發現單鏈DNA是一種比雙鏈DNA更有效的吸附劑，可以通過其糖-磷酸骨架與TiO2NPs發生更強的相互作用。Stanisavljevic等[41]采用CE-UV和毛細管電泳-激光誘導熒光(capillary electrophoresis coupled laser-induced fluorescence, CE-LIF)方法證實了鏈霉親和素(streptavidin, strep)修飾的MPA-CdTe QDs與所選寡核苷酸之間存在相互作用，可用于標記檢測生物素化寡核苷酸癌序列BCL-2和乙型肝炎病毒癌序列，該檢測可能有助于此類疾病的快速診斷。該研究團隊還利用CE-LIF和凝膠電泳發現CdTe QDs與雞基因組DNA和500 bp DNA片段之間的相互作用依賴于CdTe QDs尺寸與DNA之間的匹配度[42]。

Girardot等[43]利用微芯片毛細管電泳模式(microchip capillary electrophoresis format, FACMCE)評估了不同性質和組成的電泳緩沖溶液中適配子(aptamer)標記的Fe2O3NPs與溶菌酶(aptamer靶標)之間的關聯強度。該技術能夠測定溶菌酶上的結合位點數和二者解離常數，從而證明溶菌酶aptamer與NPs結合后仍然保留靶向功能。

Grela等[44]研究了在毛細管電色譜中聚合物NPs作為偽固定相與多種生物活性肽的相互作用，發現聚合物NPs與黃體生成素釋放激素和緩激肽有很強的相互作用，并通過改變顆粒的大小研究其對肽電色譜行為的影響。Wang和Xia[45]利用CE-FL檢測配體與QDs之間的熒光共振能量轉移，并結合熒光峰遷移時間的改變，共同證明了在復雜的結合溶液(細胞裂解液)中多組氨酸肽聚合物與QDs的相互作用。Brambilla等[46-47]通過CE-LIF和輔助技術研究了聚氰基丙烯酸烷酯NPs和聚乳酸NPs對濃度接近生理條件的單體和可溶性低聚物形式的Aβ1-42肽的動電學行為的影響。

3 展望(Prospect)

NMs憑借其優越性能成為眾多領域最具吸引力和發展最迅速的革命性材料，其種類和產量的迅速增加使其不可避免地在環境中累積，并最終進入人體。因此，深入研究NMs與生物分子的相互作用有助于揭示NMs可能的毒性效應和內在機制。在眾多研究NMs和生物分子相互作用的方法中，毛細管電泳技術不僅可以與各種檢測器聯用監測NMs與生物分子相互作用的動態變化，還可以收集結合參數信息并評估NMs對蛋白質及生物小分子的反應性和親和力。然而，由于復雜的生物系統中存在眾多蛋白質和生物小分子，利用常規CE技術對多種生物分子進行精確定性和定量仍然存在很大挑戰。近年來，隨著CE和分子質譜的蛋白質組學技術及電噴霧電離質譜(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)的聯用[48]、金屬穩定同位素標記生物分子技術的發展[49]、集成芯片形式的轉變[43]以及毛細管涂層和電極修飾技術的改善[50-51]，CE技術可能成為深入了解NMs和生物分子相互作用機制和預測NMs在生物系統中分布和傳遞的一項前沿技術。