自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤在納米氧化鋁致斑馬魚幼魚早期神經毒性中的作用

黃濤，王艷紅，陳金，范蓉，尚楠，高曉誠，張蘭，牛僑，張勤麗

山西醫科大學公共衛生學院勞動衛生教研室，太原 030001

納米材料是指結構單位的尺寸介于1～100 nm之間的超微粒材料[1]，具有體積效應、表面效應、量子尺寸效應和量子隧道效應等4個基本效應，使其在磁、光、電、生物和醫學等各個領域均可發揮作用[2]。研究提示，納米材料具有穿透血腦屏障[3]、血氣屏障[4]和胎盤屏障[5]的能力，與同一物質的較大顆粒相比，它們具有更高的毒性潛能[6]，能在不同的器官和組織中積累并發揮其毒性作用[7]。納米氧化鋁(aluminum nanoparticles, AlNPs)占全球商業生產納米顆粒市場的20%，廣泛應用于醫藥、電子和化妝品等領域[8]。而中樞神經系統是AlNPs的潛在靶點，有研究表明，AlNPs可以通過血腦屏障進入大腦，損害動物的中樞神經系統，并且影響學習和記憶能力[9]。

自噬是普遍存在于真核細胞內的一種溶酶體依賴性的細胞降解途徑，是進行自我保護、維持細胞存活、更新、物質再利用和內環境穩定的重要機制。近年來，自噬作用正逐漸成為神經系統疾病研究中的熱點，并且已被報道參與許多神經退行性疾病的病理變化，包括阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病和肌萎縮性側索硬化癥[10-11]。而自噬抑制劑又被認為是探究疾病與自噬相關性以及開拓疾病新的治療措施的關鍵點[12]。自1982年Seglen和Gordon[13]首次發現3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3MA)可以作為自噬的抑制劑之后，3MA被廣泛應用于自噬的機制研究。而納米粒子是一類新型的自噬誘導劑，目前已有針對量子點、水溶性富勒烯、稀土金屬氧化物等納米材料誘導細胞自噬的研究[14]。本課題組前期的體外研究結果提示AlNPs致神經細胞死亡方式有凋亡、壞死和自噬，其中主要方式為自噬[15]，體內研究結果提示13 nm粒徑的AlNPs對斑馬魚幼魚早期的學習和記憶能力產生毒作用[16]，但其毒性機制尚不清楚。為進一步闡明AlNPs的毒作用機制，本研究加入自噬抑制劑后，采用形態學、行為學、生化指標以及基因改變相結合的方法，初步探討自噬在AlNPs誘導的神經毒性中的作用。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑和儀器

1.1.1 主要試劑

13 nm粒徑AlNPs(貨號718475-100G)購自美國Sigma公司(分析純)，3MA購自美國MCE公司(純度：99.83%)，分析純二甲基亞砜(DMSO)購自天津市恒興試劑公司(中國)，超氧化物歧化酶(貨號A001-3-2)試劑盒、乳酸脫氫酶(貨號A020-2-2)試劑盒購自南京建成生物有限公司(中國)，BCA(bicinchonininc acid)蛋白定量(貨號A045-4-2)試劑盒、超純RNA提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司(中國)，反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自普洛麥格生物技術有限公司(中國)，基因引物序列購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.2 主要儀器

SB25-12DTDN超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司，中國)，nano-ZS90納米粒度儀(Malvern Panalytical，英國)，OLYMPUS BX51熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，Image-pro plus圖像分析軟件(Media Cybernetics，美國)，EthoVison XT動物運動跟蹤系統(Noldus Information Technology，荷蘭)，DanioVision斑馬魚幼魚行為軌跡跟蹤系統(Noldus Information Technology，荷蘭)，ZXSR-1090真彩觸摸屏生化培養箱(上海智城，中國)，SpectraMaxM 2全自動酶標儀(美國Biotek Instruments公司)，QuantStudio 3實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，JEM-100CX透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。

1.2 納米顆粒的表征

將AINPs溶于斑馬魚胚胎培養液(5 mmol·L-1NaCl、0.17 mmol·L-1KCl、0.33 mmol·L-1CaCl2和0.33 mmol·L-1MgSO4·7H2O，pH為7.2)，懸濁液經過30 min超聲混勻后，吸取10 μL滴到有炭膜的銅網上，待銅網干燥后，在透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)下觀察粒子分散情況，加速電壓為80 kV。用圖像分析軟件對AINPs懸濁液的TEM結果進行平均粒徑分析；在25 ℃左右，用納米粒度儀檢測超聲混勻的AINPs懸濁液的Zeta電位。

1.3 神經毒性試驗

1.3.1 實驗動物及分組

選擇健康野生型TU品系斑馬魚，購于武漢國家斑馬魚資源中心，飼養在斑馬魚養殖系統中。溫度控制在28 ℃±0.2 ℃，光照周期為光照∶黑暗=14 h∶10 h，將pH調至7.2，電導率為500～550 μS·cm-1，每天規律喂食孵化出的豐年蝦2次。實驗前一天將親魚按比例(雌∶雄=1∶2)放入交配缸中，里面加入養殖系統中的水。第2天早晨拿走擋板，使雌魚和雄魚自然交配。將6 hpf(hours post-fertilizaiton)的魚卵置于光學顯微鏡下觀察，確定其發育階段，并選擇正常的胚胎分成4組，每組30顆置于6孔板，一共暴露6 d，每天更換溶液，每組設置3個平行。4組分別為對照組、3MA組、AlNPs組(100 mg·L-1)和AlNPs+3MA(用0.025%(V/V)的DMSO溶解3MA，3MA濃度為2.5 mmol·L-1)組，4組加入同等濃度的DMSO溶液。

1.3.2 斑馬魚幼魚一般毒性試驗

在6 hpf時開始進行暴露，分別在12、24、48、72、96、120和144 hpf記錄斑馬魚卵和幼魚的死亡數、孵化數和畸形數，并在顯微鏡下拍照。

1.3.3 行為學分析

黑暗狀態下的運動行為及趨觸性檢測：將不同暴露組中的斑馬魚胚胎養至144 hpf，每個濃度組隨機選取24條幼魚放置到24孔板中，然后將24孔板放入Noldus幼魚運動行為儀中，設置觀察區域和檢測程序，采集3 min的幼魚運動視頻。用EthoVision XT軟件導出運動速度、移動距離和外圈累計時間百分比等參數，其中以外圈累積時間百分比為指標來表示幼魚的趨觸性程度[17]。

對強光刺激的驚恐逃避反射試驗：將不同暴露組中的斑馬魚養至144 hpf，每個濃度組隨機選擇24條幼魚放置到24孔板中，開啟斑馬魚幼魚行為軌跡跟蹤系統，設置觀察區域和檢測程序，黑暗3 min-光照1 min-黑暗3 min。應用Ethovision XT軟件導出各個時間段運動速度等參數。

1.4 氧化應激實驗

收集144 hpf的30條斑馬魚幼魚后用生理鹽水制備勻漿上清液，BCA法進行蛋白定量，按試劑盒說明書測定組織超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脫氫酶(LDH)的活性，重復測定3次。

1.5 熒光定量PCR檢測

暴露結束后，每組取60條幼魚置于2 mL的Ep管中，使用Trizol法提取斑馬魚RNA，再用反轉錄試劑盒合成cDNA，按照熒光定量PCR試劑盒的操作步驟進行基因定量。引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列信息Table 1 The sequence information of gene primer

1.6 統計學分析

2 結果(Results)

2.1 AlNPs的表征

如圖1所示，AlNPs經超聲混勻30 min后，13 nm粒徑AlNPs在電子顯微鏡(×80 000)下沒有明顯的聚集，平均粒徑為20.90 nm±9.51 nm。用納米粒度儀檢測納米氧化鋁平均水合粒徑為86.89 nm±10.87 nm，平均Zeta電位是49.43 mV±2.21 mV。

2.2 斑馬魚幼魚一般毒性試驗

將6 hpf后的斑馬魚胚胎暴露于不同暴露組溶液中，統計各組胚胎144 hpf的孵化率、死亡率和畸形率。結果如表2所示，各組間的孵化率、死亡率和畸形率無統計學差異(P>0.05)。

由圖2可知，對照組和3MA組的斑馬魚受精卵在12 hpf有明顯的體節生成(圖2(a)，紅色箭頭)，而AlNPs組和AlNPs+3MA組暴露12 hpf后出現發育遲緩現象，無明顯的體節生成；在24 hpf，與對照組和3MA組相比，AlNPs組發育依然遲緩，AlNPs+3MA組明顯好轉，表現為明顯的尾部延伸(圖2(b)，藍色箭頭)，未見水腫或者固縮現象。其他時間段內未發現明顯差異。

2.3 AlNPs暴露對幼魚自發運動的影響

不同組幼魚在144 hpf后的運動行為如圖3所示。經單因素方差分析，對照組、3MA組、AlNPs組和AlNPs+3MA組平均速度不同，具有統計學意義(F=10.273,P<0.001)；移動距離不同，具有統計學意義(F=9.414,P<0.001)；趨觸性能力不同，具有統計學意義(F=4.303,P=0.007)。AlNPs組與對照組、3MA組和AlNPs+3MA組相比，平均速度降低(P<0.001,P<0.001,P=0.001)，移動距離減少(P<0.001,P<0.001,P=0.001)，趨觸性能力降低(P=0.002,P=0.005,P=0.034)。圖4為幼魚自發運動軌跡圖，對照組與3MA組斑馬魚幼魚運動軌跡規則，大多圍繞孔板周圍運動，而AlNPs組幼魚運動軌跡雜亂，在孔板中做無規則運動。加入3MA后，平均速度和趨觸性能力升高，移動距離增加，但運動軌跡依然比較雜亂。

圖1 納米氧化鋁顆粒(AlNPs)溶液超聲后透射電鏡(TEM)下觀察分散情況Fig. 1 Dispersion of alumina nanoparticles (AlNPs) solution under a transmission electron microscope (TEM) after sonication

表2 斑馬魚幼魚孵化率、死亡率和畸形率Table 2 Hatching rate, mortality rate and deformity rate of zebrafish larvae

圖2 不同時間段胚胎/幼魚的形態學變化注：(a) 12 hpf；(b) 24 hpf；(c) 48 hpf；(d) 72 hpf；(e) 96 hpf；(f) 120 hpf；(g) 144 hpf；紅色箭頭標示體節；藍色箭頭標示尾部。Fig. 2 Morphological changes of embryos and larvae in different periods of timeNote: (a) 12 hpf; (b) 24 hpf; (c) 48 hpf; (d) 72 hpf; (e) 96 hpf; (f) 120 hpf; (g) 144 hpf; red arrow indicates somite; blue arrow indicates tail.

圖3 斑馬魚幼魚的運動行為及趨觸性行為注：a表示與對照組相比，P<0.05；b表示與3MA組相比，P<0.05；c表示與AlNPs+3MA組相比，P<0.05。Fig. 3 The motor behavior and thigmotaxis of zebrafish larvaeNote: a, compared with control group, P<0.05; b, compared with 3MA group, P<0.05; c, compared with AlNPs+3MA group, P<0.05.

圖4 斑馬魚幼魚自發運動行為軌跡圖Fig. 4 Trajectory of spontaneous movement behavior of zebrafish larvae

2.4 AlNPs暴露對幼魚驚恐逃避反射的影響

斑馬魚驚恐逃避反射實驗結果(圖5)表明，各組幼魚在光照期的速度不同，具有統計學意義(F=5.249,P=0.003)，AlNPs組與對照組、3MA組和AlNPs+3MA組相比，速度明顯降低，具有統計學意義(P=0.003,P=0.001,P=0.007)，提示加入3MA后減輕了AlNPs對斑馬魚應激能力的損傷。

圖5 斑馬魚幼魚光照驚恐逃避反射速度變化注：a表示與對照組相比，P<0.05；b表示與3MA組相比，P<0.05； c表示與AlNPs+3MA組相比，P<0.05。Fig. 5 Changes of panic escape reflex velocity of zebrafish larvae under illuminationNote: a, compared with control group, P<0.05; b, compared with 3MA group, P<0.05; c, compared with AlNPs+3MA group, P<0.05.

2.5 斑馬魚幼魚氧化應激水平

斑馬魚幼魚的SOD活性如圖6(a)所示，經單因素方差分析，對照組、3MA組、AlNPs組和AlNPs+3MA組的SOD活性不同，差異具有統計學意義(F=11.664,P=0.003)，與對照組、3MA組和AlNPs+3MA組相比，AlNPs組的SOD活性降低，具有統計學意義(P=0.001,P=0.007,P=0.001)。各組幼魚的LDH活性如圖6(b)所示，對照組、3MA組、AlNPs組和AlNPs+3MA組的LDH活性不同，差異具有統計學意義(F=5.760,P=0.011)。與對照組、3MA組和AlNPs+3MA組相比，AlNPs組的LDH活性升高，具有統計學意義(P=0.004,P=0.027,P=0.003)。

2.6 斑馬魚幼魚自噬相關基因變化

熒光定量PCR結果顯示，對照組、3MA組、AlNPs組和AlNPs+3MA組的beclin1基因表達差異有統計學意義(F=13.855,P=0.002)，與對照組、3MA組和AlNPs+3MA組相比，AlNPs組的beclin1基因表達升高(P<0.001,P=0.003,P=0.002)，如圖7(a)所示；各組間vps34基因表達差異有統計學意義(F=15.477,P=0.001)，AlNPs組的vps34基因與對照組、3MA組和AlNPs+3MA組相比表達升高(P<0.001,P<0.001,P=0.002)，如圖7(b)所示；各組間lc3Ⅱ基因表達差異有統計學差異(F=14.929,P=0.001)，AlNPs組的lc3Ⅱ基因較對照組、3MA組和AlNPs+3MA組表達升高(P<0.001,P=0.002,P=0.001)，如圖7(c)所示。

圖6 斑馬魚幼魚氧化應激結果注：(a)超氧化物歧化酶(SOD)活性；(b)乳酸脫氫酶(LDH)活性；a表示與對照組相比，P<0.05；b表示與3MA組相比，P<0.05； c表示與AlNPs+3MA組相比，P<0.05。Fig. 6 Results of oxidative stress in zebrafish larvaeNote: (a) the activity of superoxide dismutase (SOD); (b) the activity of lactate dehydrogenase (LDH); a, compared with control group, P<0.05; b, compared with 3MA group, P<0.05; c, compared with AlNPs+3MA group, P<0.05.

圖7 斑馬魚幼魚體內自噬相關基因表達情況注：a表示與對照組相比，P<0.05；b表示與3MA組相比，P<0.05；c表示與AlNPs+3MA組相比，P<0.05。Fig. 7 Expression of autophagy related genes in zebrafish larvaeNote: a, compared with control group, P<0.05; b, compared with 3MA group, P<0.05; c, compared with AlNPs+3MA group, P<0.05.

3 討論(Discussion)

斑馬魚具有胚胎透明，胚胎早期發育快，易于大量獲得樣品，養殖花費少等優點，這使斑馬魚胚胎在評估納米毒性方面具有更大的優勢[18]。有研究表明，AlNPs可以穿透生物屏障，在多個器官中積累并導致神經毒性[19]、免疫毒性[20]和遺傳毒性[21]。本課題組前期研究發現，AlNPs在體內外均可引起神經毒性[22-23]，然而對于AlNPs的神經毒性機制的研究還很有限。本實驗以斑馬魚胚胎和幼魚為研究對象，進一步闡明AlNPs的毒作用機制。

不同種類的納米金屬顆粒對于斑馬魚胚胎及幼魚有著不同程度的影響，例如，納米銀暴露會導致斑馬魚存活率降低[24]，納米二氧化鈦暴露不僅導致顯著的死亡率，還造成發育遲緩、畸形和DNA損傷[25]。本研究發現，暴露于AlNPs后，斑馬魚胚胎在12 hpf和24 hpf出現發育遲緩的現象，加入3MA后，在24 hpf情況明顯好轉。大多數胚胎在72 hpf左右孵化，各處理組間孵化率、死亡率和畸形率無顯著性差異。

有研究表明，其他納米顆粒對斑馬魚幼魚存在神經毒性，行為評估主要研究幼魚的運動行為，幼魚的運動行為屬于神經行為的研究范疇[26]。幼魚在早期就可以表現出各種神經行為，如黑暗狀態下的運動速度和移動距離，表現焦慮緊張的趨觸性行為和先天具有的對強光刺激的驚恐反射[27]。本研究發現，AlNPs組幼魚在黑暗狀態下的運動速度、移動距離和趨觸性反應明顯降低，對強光刺激的驚恐反射能力和強光刺激后的黑暗逃避反射能力均下降，加入抑制劑3MA后，幼魚的速度、移動距離、趨觸性以及光刺激條件下的驚恐反射能力提高，提示AlNPs可能具有神經毒性，而3MA在一定程度上抑制了AlNPs的毒作用，對幼魚的神經行為起到保護作用。

自噬是一個進化上高度保守的降解過程。在自噬過程中，細胞內容物被稱為自噬小體的雙膜囊泡吞噬，隨后被傳遞到溶酶體進行降解[28]。有實驗數據支持自噬和神經退行性疾病之間的直接聯系[29]。自噬的發生依賴于一系列的自噬相關基因(autophagy related genes, Atg)，beclin1基因是酵母Atg6的同源基因，也是哺乳動物自噬的特異基因，而vps34作為Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的催化亞基，最初是在酵母突變體中發現的，也是酵母中唯一發現的PI3K[30]。Beclin1-vps34復合物是一種PI3K，被認為是自噬的正調節因子，主要參與自噬體形成的起始階段。3MA是PI3K的抑制劑，通過抑制beclin1-vps34復合物的形成，來抑制胞漿可溶性形式lc3Ⅰ向自噬體膜結合形式lc3Ⅱ轉化[12]。

自噬的目的是回收細胞成分和受損細胞器，以應對各種應激條件，越來越多的證據表明氧化應激是這些刺激的匯聚點[31]。氧化應激不僅是許多退行性神經疾病的早期特征[32]，而且是納米顆粒發揮生物毒效應的重要機制[33]。SOD具有特殊的生理活性，是許多生物體內各種組織的主要自由基清除劑[34]。而LDH是細胞膜通透性的標志，在多種神經性疾病中發生改變，通過檢測LDH的活性來評估細胞膜受損的程度[35]。本研究中發現AlNPs組斑馬魚體內SOD的活性降低，LDH的活性升高，表明AlNPs暴露可能導致氧化應激的發生。基因beclin1和vps34是自噬開始和進行的關鍵調節基因[36-37]，lc3Ⅱ是促進囊泡形成的必需物質[38]。本研究中發現beclin1、lc3Ⅱ和vps34的表達明顯上調，表明斑馬魚體內神經細胞可能發生過度自噬導致幼魚的神經行為受到損傷。加入自噬抑制劑3MA使得AlNPs對幼魚氧化損傷減輕，自噬基因表達下調，提示自噬可能在AlNPs致斑馬魚幼魚神經毒作用機制中有著重要的作用。

綜上所述，斑馬魚幼魚在早期神經發育階段暴露于AlNPs可能通過誘導氧化應激和自噬的過度發生而導致神經毒性。自噬抑制劑3MA可以降低AlNPs所引起的氧化損傷，下調beclin1、lc3Ⅱ和vps34基因的表達，明顯改善AlNPs暴露對幼魚所致的早期神經毒性。