白及組培苗原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)化研究

莫盛龍，黃曄，李才清，黃明進(jìn)，劉紅昌

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州大學(xué)石斛研究院，貴州貴陽550025；3.貴州省中藥材繁育與種植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025；4.鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣科學(xué)技術(shù)服務(wù)中心，貴州鎮(zhèn)遠(yuǎn)557700）

蘭科植物白及[Bletilla striata(Thunb.)Riechb.f.]的干燥塊莖藥用價(jià)值高，具有收斂止血、消腫生肌之功效[1]，是治療內(nèi)外傷出血癥的要藥；現(xiàn)代藥理研究表明，白及還具有抗菌[2]、抗腫瘤[3,4]等作用。現(xiàn)在野生白及資源已枯竭，人工栽培將成為解決資源短缺的有效途徑。但要規(guī)模化種植白及，必須快繁白及種苗，而白及組培苗原球莖的形成和膨大又是白及種苗培育的關(guān)鍵[5]。

白及的人工栽培較晚，白及種苗的人工繁育未獲得成功制約了白及的規(guī)模化種植，分株繁殖系數(shù)低，成活率不高，難以在短時(shí)期內(nèi)解決白及種苗短缺的問題，采用白及種子培育種苗已成為白及種苗快繁的有效途徑[6,7]。目前白及組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，其組培快繁體系一般包括白及種子萌發(fā)及原球莖誘導(dǎo)、原球莖增殖分化、壯苗生根和煉苗移栽4個(gè)階段[8]，普遍認(rèn)為白及煉苗的成活率是白及規(guī)模化生產(chǎn)的關(guān)鍵，煉苗成活率高的白及組培苗大田的栽培成活率高，而白及原球莖的誘導(dǎo)形成則是提高煉苗成活率的根本措施。探究培養(yǎng)基類型（MS、3/4MS和1/2MS）、6-BA濃度、NAA濃度對白及組培苗原球莖誘導(dǎo)的影響，觀測原球莖形成的變化規(guī)律，篩選促進(jìn)原球莖誘導(dǎo)生長膨大的最優(yōu)配方，有效提高白及組培苗的煉苗成活率，從而為白及的工廠化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 蒴果材料

試驗(yàn)材料于2017年10月6日采集自貴州省畢節(jié)市大方縣羊場鎮(zhèn)灣子組——大方縣濟(jì)民林木中藥材種植專業(yè)合作社紫花白及蒴果（栽培品種），蒴果未開裂，果皮淺黃色，自封袋密封后保存于4℃普通冰箱中備用。

1.2 儀器與試劑

高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；直尺；電子天平（0.001g）；75%醫(yī)用酒精；0.1% HgCl2溶液；6-芐基腺嘌呤（6-BA）；萘乙酸（NAA）；土豆；純化瓊脂粉；蔗糖；活性炭等。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 種子培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基，土豆泥80 g L-1，蔗糖28 g L-1，瓊脂6 g/L，NAA 1 mg L-1，活性炭0.1 g L-1。

1.3.2 原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基見表1，其他成分均為蔗糖28 g L-1，瓊脂6 g L-1，活性炭0.1g L-1。

表1 白及原球莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 The orthogonal experimental design of induction culture for PLB of

表1 白及原球莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 The orthogonal experimental design of induction culture for PLB of

處理Treatment培養(yǎng)基類型Type of medium 6-芐基腺嘌呤（mg·L-1）6-BA萘2酸（mg·L-1）NAA 1 MS(1) 0.5(1) 0.1(1)2 MS(1) 1.0(2) 0.5(2)3 MS(1) 0.5(3) 1.0(3)4 3/4MS(2) 0.5(1) 0.5(2)5 3/4MS(2) 1.0(2) 1.0(3)6 3/4MS(2) 0.5(3) 0.1(1)7 1/2MS(3) 0.5(1) 1.0(3)8 1/2MS(3) 1.0(2) 0.1(1)9 1/2MS(3) 0.5(3) 0.5(2)

1.4 白及種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)

將白及蒴果一端剪掉，抖出種子于50mL小燒杯中，用牛皮紙封口，燒杯外壁噴適量75%酒精，用無菌棉花擦拭消毒后轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)中，用75%酒精浸泡30 s，細(xì)胞篩過濾，無菌水清洗3次，再用0.1%HgCl2溶液浸泡10min，細(xì)胞篩過濾，無菌水清洗3次，無菌操作接種到種子培養(yǎng)基中，在25±2℃、光照強(qiáng)度1 500lx、光照時(shí)間10 h/d的條件下培養(yǎng)60 d。

1.5 培養(yǎng)基類型、6-BA和NAA濃度誘導(dǎo)白及原球莖及組培苗形成

待種子萌發(fā)長出小苗至2～3 cm后，無菌轉(zhuǎn)接到原球莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，試驗(yàn)采用L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素為培養(yǎng)基類型（A）、6-BA（B）、NAA（C）。培養(yǎng)基類型：A1、A2、A3分別為MS、3/4MS、1/2MS；6-BA濃度：B1、B2和B3分別為0.5mg/L、1.0mg/L和2.0 mg/L；NAA濃度：C1、C2和C3分別為0.1 mg/L、0.5 mg/L和1.0 mg/L。本試驗(yàn)每個(gè)組合培養(yǎng)16瓶，每瓶20株，設(shè)3個(gè)重復(fù)，采用返置抽簽法每次定期各取3瓶。將已培養(yǎng)0 d、20 d、40 d、60 d、80 d和100 d的白及幼苗取出，觀察其生長情況，用自來水清洗后，再用吸水紙將表面的水分吸去，選擇長勢較一致的幼苗，原球莖取下稱量其重量，培養(yǎng)100 d時(shí)，除稱量原球莖重外，還對組培苗的生長情況，包括整株重，株高，根系數(shù)和根系長度進(jìn)行測定。

1.6 公式與計(jì)算

2 結(jié)果

2.1 白及組培苗原球莖重動(dòng)態(tài)分析

各處理原球莖重在80 d內(nèi)均呈現(xiàn)上升趨勢，處理1在20～60 d時(shí)上升速較慢，僅為0.66 mg d-1；在61～100 d之間時(shí)上升速度最快，為0.71 mg d-1，呈線性增長，且在100 d時(shí)數(shù)值最大，為88.28 mg/株；處理8在20～80 d時(shí)上升速度穩(wěn)定，80 d后平緩；處理3在20～40 d上升速度最快，41～80 d上升平緩，81～100 d速度變快，100 d時(shí)僅次于處理1；處理7在20～40 d之間時(shí)上升速度最快，為1.14 mg d-1，在100 d時(shí)出現(xiàn)下降趨勢；處理9原球莖重變化趨勢與處理3類似，但到100d時(shí)，其原球莖重較低，僅為42.89mg/株（圖1）。

圖1 100天內(nèi)白及組培苗原球莖重動(dòng)態(tài)分析Fig.1 The dynamic analysis of the PLB weight of Bletilla striata tissue cultured seedlings within 100 days

2.2 100 d時(shí)白及組培苗原球莖重正交分析

通過直觀分析[9]（表2），比較各因素極值排出影響因素大小（R越大的因素越重要）：NAA＞培養(yǎng)基＞6-BA，選取較好的水平組合，3因素應(yīng)選k值最大的水平：A1、B1、C1。

表2 100 d時(shí)白及組培苗原球莖重正交試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算表Table 2 The calculation table of orthogonal test results of the PLB weight of tissue cultured seedlings at 100 days

表2 100 d時(shí)白及組培苗原球莖重正交試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算表Table 2 The calculation table of orthogonal test results of the PLB weight of tissue cultured seedlings at 100 days

處理Treatment因素A（培養(yǎng)基）Factor A(medium)因素B（6-BA）Factor B(6-BA)因素C（NAA）Factor C(NAA)指標(biāo)總和Sum 1（1） （1） （1）2（1） （2） （2）3（1） （3） （3）4（2） （1） （2）5（2） （2） （3）6（2） （3） （1）7（3） （1） （3）8（3） （2） （1）9（3） （3） （2）K1 184.70 183.61 193.05 479.61 K2 154.79 147.99 137.04 K3 140.12 148.01 149.52 k1 61.57 61.20 64.35 k2 51.60 49.33 45.68 k3 46.71 49.34 49.84極值（R） 14.86 11.87 18.67

經(jīng)方差分析[9]（表3），A、B、C三因素的F值均小于F0.05(2,2)，因此3個(gè)水平白及組培苗原球莖重差異均不顯著，所以選擇平均數(shù)大的作為最優(yōu)組合，即A1、B1、C1。

表3 100 d時(shí)白及組培苗原球莖重方差分析表Table 3 The variance analysis table of the PLB weight of tissue cultured seedlings at 100 days

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2.3 100 d時(shí)白及組培苗生長情況分析

經(jīng)過方差分析（表4），處理1的原球莖重、整株重和株高均最大分別為88.28 mg/株、421.29 mg/株以及6.12 cm，除整株重與處理3差異不顯著外，與其他處理差異極顯著，根系數(shù)和根系長度分別為6和3.29 cm，處理3原球莖重次之為54.36 mg/株，與處理1差異顯著，與其他處理差異不顯著，整株重為396.50 mg/株，與處理1和處理7差異不顯著，與其他處理均差異顯著，根系數(shù)為8，與其他處理均差異極顯著，根系長度最低為2.19 cm，與處理7差異極顯著，而處理2除株高和根系長度不是最低外，在各個(gè)方面均表現(xiàn)最差。

表4 100 d時(shí)白及組培苗生長情況Table 4 The growth oftissue culture seedlings at 100 days

表4 100 d時(shí)白及組培苗生長情況Table 4 The growth oftissue culture seedlings at 100 days

注：采用字母標(biāo)記法對數(shù)據(jù)的顯著性進(jìn)行標(biāo)記，大寫字母表示極顯著（P＜0.01），小寫字母表示顯著（P＜0.05）。Note:The significance of data is marked by letter marking.Capital letters are extremely significant(P＜0.01)and lowercase letters are significant(P＜0.05).

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經(jīng)相關(guān)分析（表5），原球莖重與整株重，整株重與株高均為顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.694和0.704，原球莖重與株高相關(guān)性達(dá)到極顯著，相關(guān)系數(shù)為0.887，而株高與根系長度以及根系數(shù)與根系長度，存在較弱的負(fù)相關(guān)。

表5 100 d時(shí)白及組培苗生長情況相關(guān)性分析Table 5 The correlation analysis of the growth oftissue culture seedlings at 100 days

表5 100 d時(shí)白及組培苗生長情況相關(guān)性分析Table 5 The correlation analysis of the growth oftissue culture seedlings at 100 days

注：采用星號(hào)標(biāo)記法對數(shù)據(jù)的顯著性進(jìn)行標(biāo)記，**表示極顯著（P＜0.01），*表示顯著（P＜0.05）。Note:The asterisk marking method was used to mark the significance of the data.**was extremely significant(P＜0.01),and*was significant(P＜0.05).

項(xiàng)目Project相關(guān)系數(shù)r Correlation coefficient概率（p）Probability原球莖重與整株重 0.694* 0.038原球莖重與株高 0.887** 0.001整株重與株高 0.704* 0.034株高與根系長度 -0.188 0.628根系數(shù)與根系長度 -0.466 0.211

圖2 不同培養(yǎng)基類型、6-BA濃度和NAA濃度條件下培養(yǎng)100 d時(shí)的白及組培苗原球莖圖Fig.2 Procorms of PLB induction of tissue culture seedlings at different medium types,6-BA concentration and NAA concentration at 100 days

3 討論

通過研究白及組培苗培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基類型、6-BA濃度和NAA濃度對其原球莖及幼苗的影響，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，從而得出結(jié)論：影響原球莖形成和膨大因素的重要順序?yàn)镹AA濃度＞培養(yǎng)基類型＞6-BA濃度，同時(shí)在6-BA、NAA濃度降低且6-BA與NAA的比值大時(shí)，有利于誘導(dǎo)白及組培苗原球莖的膨大，濃度增大或比值降低時(shí)，則表現(xiàn)為緩慢增長。篩選出白及原球莖誘導(dǎo)較好的水平組合為MS+6-BA0.5 mg L-1+NAA 0.1 mg L-1，在20～60 d時(shí)上升速度一般，僅為0.66 mg d-1，在61～100 d時(shí)上升速度最快，為0.71 mg d-1，呈線性增長，且在100 d時(shí)數(shù)值最大，為88.28mg/株，與其他處理均差異極顯著，并且植株長勢良好，株高、根系數(shù)量及根系長度適中。

朱玉球等[10]較早采用黃花白及種子作為外植體材料，先誘導(dǎo)原球莖的形成，再將原球莖進(jìn)行切割，誘導(dǎo)生根，培育成苗，該研究為白及種苗生產(chǎn)提供了一定借鑒，但沒有進(jìn)行大田生產(chǎn)實(shí)踐，更沒有提到白及種球莖的形成在白及種苗生產(chǎn)中的關(guān)鍵作用，相反作者還將球莖切割成塊再誘導(dǎo)成苗，沒有考慮到田間生產(chǎn)對白及種苗的要求；之后，彭麗麗[11]、余朝秀[12]、袁寧[13]、管常東[14]等也對白及組培快繁技術(shù)進(jìn)行了相關(guān)研究，研究內(nèi)容都重點(diǎn)放在白及增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)方面，為白及種苗生產(chǎn)研究進(jìn)一步提供了參考，但也沒有提出種苗球莖的形成在白及種苗生產(chǎn)中的重要作用；李慧敏等[5]在白及瓶內(nèi)假鱗莖誘導(dǎo)研究中明確提出了假鱗莖是白及組培苗成功的關(guān)鍵。王高鵬等[15]以改良白及組培苗增殖的最好培養(yǎng)基配方及育苗進(jìn)程為重點(diǎn)，確立了白及快繁組織培養(yǎng)體系；史俊等[16]利用液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)的方式，探究影響誘導(dǎo)白及原球莖形成的因素。以上這些研究方法和研究結(jié)果對白及種苗繁育提供了重要的參考資料。縮短培養(yǎng)時(shí)間和減少人工成本是白及組培快繁的目的之一，因此篩選更加適宜誘導(dǎo)營養(yǎng)莖形成和膨大的培養(yǎng)基以及減少繼代次數(shù)可能會(huì)成為研究的重要內(nèi)容。