基于網絡藥理學的精覆力骨合劑治療骨質疏松癥的機制研究

閆起，姜北，楊波，梁華，李澤光，趙福紅，陳鑫，鄭時嘉，周忠光※

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱150040；3.牡丹江市第二人民醫院，黑龍江牡丹江157000；4.天問山農業綜合開發股份有限公司，黑龍江哈爾濱150323）

骨質疏松癥（osteoporosis,OP）是一種常見的骨代謝性疾病[1]，會引起骨礦物質與骨基質的丟失，造成骨密度降低、骨微結構損壞，進而導致骨強度下降，骨折風險增加，嚴重影響全球數億患者的生活質量[2]。OP亦是我國老年人常見的主要慢性疾病之一[3]。OP的發生與多種因素相關，如人種、性別、年齡、營養、內分泌和免疫等[4]。病理機制可以歸納為骨重建的平衡失調，出現骨吸收大于骨形成。現階段OP的治療目的是盡可能減少骨吸收、增加骨形成。臨床常用治療手段包括非藥物治療（運動、增加鈣攝入及戒煙酒等）與藥物治療（基礎治療藥物、抗骨吸收藥物、促骨形成藥物、雙重調節藥物及中藥等）[5]。中醫古籍里并沒有記載“骨質疏松癥”這一具體病名，但卻有與其癥狀相類似的“骨極”、“髓枯”和“骨痿”等描述。中醫學認為其病變主臟在腎，疾病性質屬虛證，病機以精血虧虛為主[6]。

黃精獲天地之淳精，自古以來就是益壽遐齡之上品，甚至有“久服成仙”之傳說[7]，更有“仙人余糧”之美譽。現代藥理研究證實，黃精具有調節免疫、提高記憶力、抗氧化、抗衰老、抗疲勞及抗OP等多種作用[8]。精覆力骨合劑源于周忠光教授經驗方，以黃精為君藥，針對OP的中醫病因病機遣藥配伍而成，由黃精、覆盆子、黑芝麻、牡蠣、芡實、黨參和丁香組成，具有補益肝腎、健脾益氣和固本壯骨的功效，用于原發性骨質疏松癥和骨量減少，癥見腰背肢體疼痛、無力，在緩解OP癥狀、控制疾病進展等方面具有較好的療效。但關于精覆力骨合劑治療OP的作用機制尚不明確，需要不斷探索，深入挖掘，所以基于網絡藥理學的科學研究方法，對精覆力骨合劑抗OP作用機制進行探析具有十分重要的意義。

1 資料與方法

1.1 精覆力骨合劑所含活性成分的篩選

TCMSP數據庫內搜索黃精、覆盆子、黑芝麻、牡蠣、芡實、黨參及丁香等中藥所含化合物。根據藥物進入機體內所需經歷的ADME過程，以生物利用度（Oral bioavailability）≥30%，類藥性（Drug-likeness）≥0.18為篩選條件，過濾后獲得活性成分。

1.2 精覆力骨合劑潛在靶標基因與OP相關靶標基因的確定

TCMSP數據庫內檢索和已獲得活性成分相匹配的潛在靶標基因。使用Uniprot數據庫的UniprotKB模塊，限定物種為“human”，對已經獲得的有關蛋白或基因名稱進行校對。使用Genecards與OMIM數據庫，分別進行以“osteoporosis”為主題詞的檢索，獲取OP治療的已知靶標基因。

1.3 精覆力骨合劑活性成分靶標基因與OP已知治療靶標基因相關網絡的構建

將精覆力骨合劑潛在靶標基因與OP已知治療基因相交，兩者的交集即是復方治療OP的靶標基因，而與交集基因相匹配的活性成分即為有效成分。利用Venny在線平臺，同樣將精覆力骨合劑潛在靶標基因與OP已知治療基因相交，繪制韋恩圖。使用Cytoscape3.7.2，構建相互作用網絡。

1.4 蛋白互作網絡的構建與關鍵節點的篩選

在STRING平臺，輸入疾病靶點基因與藥物效用基因，以“Homosapiens”為物種，進行蛋白互作分析，置信度設置為0.4，隱藏游離蛋白，得到PPI圖。對STRING所得PPI網絡文件使用Cytoscape3.7.2做進一步可視化處理，計算節點屬性值，以Degree、combined_score值調節圖中節點、邊的可視化效果（節點由小到大，顏色由暗到亮表示Degree值由小到大；邊由粗到細，顏色由暗到亮表示combined_score值由小到大）。以節點degree值為指標，篩選出關鍵節點核心基因。運行R 4.0.2軟件繪制柱狀圖。

1.5 網絡拓撲分析

將交集基因導入Cytoscape3.7.2，使用軟件中的Bisogenet及CytoNCA插件進行網絡拓撲分析，對所得網絡計算所有節點Degree中位數，以＞2倍中位數為篩選條件，得到Hithubs網絡。進一步分別計算Hithubs網絡中節點Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、Information、LAC和Network中位數，以＞1倍中位數為篩選條件，得到核心子網絡。

1.6 Gene Ontology分析及KEGG通路富集分析

使用R 4.0.2軟件中的Bioconductor包進行Gene Ontology（BP、MF和CC）分析及KEGG通路富集分析，以P≤0.5、q≤0.5為具有統計學意義，經過篩選后輸出結果，進行條形圖與氣泡圖的可視化繪制。

2 結果

2.1 精覆力骨合劑活性成分與潛在靶標基因

經篩選后得到12個黃精的活性成分及149個成分-基因對應關系；7個覆盆子的活性成分及286個成分-基因對應關系；7個黑芝麻的活性成分及48個成分-基因對應關系；2個芡實的活性成分及23個成分-基因對應關系；21個黨參的活性成分及214個成分-基因對應關系；6個丁香的活性成分及309個成分-基因對應關系。復方中有不同藥物包含相同活性成分的情況，去重后保留49種活性成分（見表1）。對已經獲得的有關基因名稱進行校對后，得到905個成分-基因對應關系，有不同活性成分對應于同一個靶基因的情況，去重后保留220個靶標基因。

表1 精覆力骨合劑活性成分Table 1 Active ingredients contained in the Jing Fu Ligu Mixture

續表1

2.2 OP治療靶標基因

使用Genecards與OMIM數據庫分別進行以“osteoporosis”為主題詞的檢索，獲取OP治療的已知靶標基因共4 133個，剔除重復者，最后保留4 122個。

2.3 精覆力骨合劑活性成分靶標基因與OP已知治療靶標基因交集

將220個靶標基因與4 122個治療基因相交，得到的153個交集即是精覆力骨合劑治療OP的靶標基因，見表2；與之相匹配的39個活性成分即是復方治療OP的有效成分，見表3。利用Venny在線平臺繪制韋恩圖，見圖1。

圖1 精覆力骨合劑-OP交集基因韋恩圖Fig.1 The Venn map of the Jing Fu Ligu Mixture-osteoporosis intersection gene

表2 精覆力骨合劑治療OP的靶標基因Table 2 The intersection gene of Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

表3 精覆力骨合劑治療OP的有效成分Table 3 Effective ingredients of Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

續表3

2.4 精覆力骨合劑-OP靶標相關網絡

使用Cytoscape3.7.2軟件，輸入數據文件，構建相互作用網絡，見圖2。圖2的中間位置藍色三角形代表靶基因，橢圓形代表藥物活性成分，紅色表示多味藥物，黃色表示黃精，綠色表示覆盆子，灰色表示黑芝麻，橙色表示黨參，粉色表示芡實，紫色表示丁香。

圖2 精覆力骨合劑-OP可視化網絡Fig.2 The JingFuLiguMixture-osteoporosisvisualization network

2.5 蛋白互作網絡

所得PPI共有153個節點、2 924條邊，平均節點度為38.2，平均局部聚類系數為0.62，見圖3。對PPI網絡文件使用Cytoscape3.7.2做進一步可視化處理，計算節點屬性值，以Degree、combined_score值調節圖中節點、邊的可視化效果（節點由小到大，顏色由暗到亮表示Degree值由小到大；邊由粗到細，顏色由暗到亮表示combined_score值由小到大），見圖4。以節點degree值為指標，篩選出前30個關鍵節點核心基因，運行R 4.0.2軟件繪制柱狀圖，見圖5。Degree值排名前30位的核心節點分別為AKT1、IL6、ALB、VEGFA、JUN、CASP3、MAPK8、EGF、MMP9、PTGS2、MAPK1、EGFR、MYC、ESR1、FOS、CCND1、IL1B、MMP2、CCL2、MAPK14、HSP90AA1、AR、ERBB2、CAT、CYCS、RELA、MTOR、BCL2L1、CTNNB1和PPARG，這些蛋白是精覆力骨合劑治療OP的關鍵蛋白。

圖3 精覆力骨合劑-OP的PPI核心網絡（置信度＞0.4）Fig.3 The core net work of interaction between the Jing Fu Ligu Mixture and osteoporosis protein

圖4 精覆力骨合劑-OP的PPI核心網絡Cytoscape可視化（置信度＞0.4）Fig.4 The core net work Cytoscape visualization of interaction between the Jing Fu Ligu Mixture and osteoporosis protein

圖5 核心蛋白柱狀圖Fig.5 The core protein histogram

2.6 網絡拓撲分析

共得到7 352 Nodes、162 016 edges。經過＞2倍中位數篩選后，得到2 082 Nodes、85 445 edges即為Hithubs網絡。進一步經過＞1倍中位數篩選后，得到655 Nodes、29 560 edges即為核心子網絡，見圖6。靠前的節點即為精覆力骨合劑治療OP的核心靶基因，degree值排名前30的靶基因依次為APP、NTRK1、EGFR、CUL3、XPO1、HSP90AA1、TP53、ESR1、MCM2、UBC、FN1、CDK2、HSP90AB1、COPS5、RNF2、MYC、CUL7、CUL1、SIRT7、GRB2、CAND1、OBSL1、NPM1、YWHAZ、ITGA4、VCP、CCDC8、CDC5L、FBXO6和TRAF6。

圖6 網絡拓撲分析Fig.6 The network topology analysis

2.7 Gene Ontology分析

經BP、CC和MF分析后各得到2 070條、71條和141條結果，選擇其中較關鍵者進行分析，進行前20個條目的條形圖與氣泡圖的可視化繪制，見圖7。GO Biological Process（BP）主要涉及細胞對化學應激的反應、對類固醇激素的反應、對脂多糖的反應、對細菌起源分子的反應、對氧化應激的反應、對營養水平的反應、對金屬離子的反應、對活性氧的反應、對抗生素的反應和細胞對氧化應激的反應等。GO Cellular Component（CC）主要涉及膜筏、膜微區、膜區、轉錄調節復合物、囊泡腔、分泌顆粒腔、細胞質囊泡腔、核染色質、RNA聚合酶II轉錄調節復合物和小窩等。GO Molecular Function（MF）主要涉及核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、類固醇激素受體活性、DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子結合、DNA結合轉錄激活劑活性、RNA聚合酶II特異性、DNA結合轉錄激活因子活性、血紅素結合、四吡咯結合及磷酸酶結合等。

圖7 精覆力骨合劑治療OP關鍵靶點的BP分析barplot與dotplot圖Fig.7 The barplot and dotplot diagrams of the GO Biological Process analysis of key Targets of the Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

圖8 精覆力骨合劑治療OP關鍵靶點的CC分析barplot與dotplot圖Fig.8 The barplot and dotplot diagrams of the GO Cellular Component analysis of key Targets of the Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

圖9 精覆力骨合劑治療OP關鍵靶點的MF分析barplot與dotplot圖Fig.9 The barplot and dotplot diagrams of the GO molecular Function analysis of key targets of the Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

2.8 KEGG分析

經過篩選后輸出結果，共得到145條結果，選擇其中較關鍵者進行分析，進行前20個條目的條形圖與氣泡圖的可視化繪制，結果見表4、圖10和圖11。

圖10 精覆力骨合劑治療OP關鍵靶點富集信號通路barplot與dotplot圖Fig.10 The barplot and dotplot diagrams of the signal pathway of the key target enrichment of the Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

表4 精覆力骨合劑治療OP的關鍵信號通路Table 4 The key signaling pathways of the Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

3 討論

黃精自古以來就被奉為抗衰扶羸之圣藥，以“九蒸九曬”的炮制方法使用最為廣泛，增其厚重之氣，克其濕膩之性，強其補益之效[9]，達增效、減毒、緩性之目的[10]。具有補氣養陰，健脾，潤肺，益腎之功[11]。可療諸虛，止寒熱，安五臟，補五勞七傷，填精髓，助筋骨。臨床應用廣泛，亦是諸多中醫經典方劑的重要組成藥物。雖然目前已有相關研究證實或間接證實黃精具有抗OP作用，但是以黃精作為君藥的中藥復方制劑治療OP的研究尚未見報道。周忠光教授遵循中醫理論，啟迪于經典名方，傳承精華，守正創新，以黃精為君藥，針對OP的病因病機，施以補腎健脾，益氣生血，養陰助陽之法，創制中藥復方——精覆力骨合劑，用于OP的治療。該方由黃精、覆盆子、黑芝麻、牡蠣、芡實、黨參和丁香組成。方中黃精性平，味甘，歸腎、脾、肺經，補諸虛，填精髓，益脾胃，潤心肺，使五勞七傷得補，筋骨得健，肌肉得充，為君藥。臣以覆盆子、黑芝麻和牡蠣。覆盆子性微溫，味甘酸，入肝腎經，固精縮尿，益肝腎明目，以其溫補之性益肝補腎，強筋壯骨，使精血旺盛，骨得髓養，筋得血濡，經脈得充，筋骨堅強。黑芝麻味甘，性平，入肝腎大腸經，功能補益精液，潤肝臟，養血舒筋，益氣力，長肌肉，填腦髓。牡蠣味咸，性微寒，入肝腎膽經，潛陽補陰，收斂固澀，以補腎正氣，除虛勞乏損。三藥相須為伍，效力陡增，使肝腎得補，腎精得固，以治病求本。佐以芡實、黨參、丁香三藥。芡實味甘、澀，性平，歸脾、腎經，益精氣，固腎氣，且能健脾除濕以止瀉。黨參味甘，性平，歸脾、肺經，補中益氣，補血，生津。丁香味辛，性溫，歸脾、胃、肺、腎經，辛溫芳香，以行氣滯，療腎氣，暖腰膝，壯陽，起痿。縱觀全方，組方精當，配伍嚴緊，標本兼顧，使肝腎之精血得補，氣血營衛得充，筋脈骨骼得利，骨痿之諸癥得愈。

精覆力骨合劑治療OP的有效成分有39個，如Quercetin、DFV（liquiritigenin）、beta-sitosterol、diosgenin和kaempferol等。Quercetin屬于天然黃酮類物質，具有廣泛的生物活性。Sok Kuan Wong等[12]對Quercetin的骨保護作用進行回顧性綜述，指出Quercetin可以對由RANKL介導的OC分化、OB凋亡、氧化應激及炎癥反應等具有抑制作用，對成骨、血管生成、抗氧化、脂肪細胞凋亡和OC凋亡等具有促進作用。其所涉及的機制包括對Wnt、NF-B、Nrf2、SMAD、MAPK以及凋亡相關信號轉導途徑的調節。Shashi chauhan等[13]研究提示，beta-sitosterol可以影響體外OB的活性與增殖，在體內可以通過雌激素的調節而改善OP狀態。另外，beta-sitosterol還能增加OB的骨保護素（OPG）表達，同時減少核因子-B受體活化因子配體（RANKL）的表達，使OPG/RANKL的比值提高，產生骨保護的功能[14]。Zhang zhiguo等[15]研究發現，diosgenin可以通過介導Wnt，PI3K，RANK/RANKL或破骨因子途徑中重要分子的表達，抑制OC生成，從而影響骨代謝。Liu Hao等[16]研究證實，kaempferol可以提高因去卵巢導致的骨丟失模型大鼠的骨密度，并且能促進BMSCs的成骨分化，上調RUNX2、Osterix和CXCL12的表達，下調miR-10a-3p表達，發揮抗OP的作用。

精覆力骨合劑治療OP的核心靶點基因眾多，如VEGFA、MMP9、ESR1、FOS、MMP2、RELA和TRAF6等。VEGF是調節血管發育和血管生成的重要生長因子[17]。由于骨骼是高度血管化的器官，血管生成在成骨中起著重要作用，因此VEGF也影響骨的發育與修復。Watson E C等[18]指出血管內皮細胞具有重要的信號傳導功能，可以控制周圍組織及器官的生長、穩態與再生。對于骨骼系統，其可以通過為造血干細胞提供血管壁來調節骨的發育、再生。ESR1/ER是雌激素發揮骨代謝調節作用的重要介質，在骨組織中廣泛表達[19]。通過ESR1的介導，雌激素可以作用于OB、OC，促進OB的增殖與分化，抑制OC活性并促進凋亡[20]。MMP在ECM和組織重構、器官發生發育、血管形成、免疫炎癥、細胞遷移、增殖和細胞凋亡等生理和病理過程中發揮重要作用，而骨基質中存在的MMP與骨的生長、發育和重建密切相關[21]。在骨代謝中，首先由MMP2啟動骨轉換，隨后激活MMP9，在MMP2及MMP9的作用下水解部分降解的Ⅰ型膠原及其他多種骨基質蛋白，骨鹽因失去依附而丟失，發生OP[22]。RELA（P65）屬于NF-B家族的一員，NF-B家族共有5個成員：NF-B1（P50）、NF-B2（P52）、RelA（P65）、RelB和c-Rel。RelA可以與P50通過Rel同源域（RHD域）相互作用，形成二聚體，激活NF-kB信號通路，參與OC分化過程[23]。

精覆力骨合劑治療OP所涉及的信號通路有IL-17信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、破骨細胞分化、MAPK信號通路、NF-B信號通路、VEGF信號通路和Wnt信號通路等。IL-17作為炎性因子能夠對T細胞、巨噬細胞等多種不同細胞進行誘導而直接產生RANKL，亦或是通過刺激相關細胞使IL-1、IL-6及TNF-等分泌增加，間接促進RANKL的產生[24]，通過RANKL-RANK的信號轉導，調控OC的增殖與分化，其還可以抑制OPG的表達，使RANKL/OPG值升高，打破骨代謝的平衡狀態，促進骨吸收[25]。TNF（腫瘤壞死因子）在免疫及炎癥性骨破壞中發揮重要作用。通常作用于OC以外的其他細胞類型，或與RANKL協同作用以間接促進OC生成和骨吸收[26]。HIF1信號轉導可以誘導血管生成-骨生成偶聯，HIF1可以上調VEGF的表達，增加骨組織內的血管生成，促進血管網絡發育，使局部微循環血供豐富，調節骨代謝[27]。破骨細胞分化途徑十分繁雜，其中包含由RANKL介導的多條經典信號途徑，如OPG/RANKL/RANK、RANKL/TRAF6/NF-B、RANKL/TRAF6/MAPKs和JAK2/STAT3/RANKL等。另外如IL-1、TNF-等炎性細胞因子、M-CSF等均參與到OC的分化過程中[28]。MAPK信號轉導的特點是經過MAPKKK-MAPKK-MAPK三級激酶磷酸化反應，參與細胞增殖、分化、凋亡以及細胞相互傳導功能等進程，包含ERK1/2/5、JNK、p38等多條轉導途徑[29]，其中以ERK1/2和p38MAPK信號轉導與OB增殖、分化關系最為密切，向下影響Runx2以及成骨相關基因的表達[30,31]。Wnt信號通路包括經典的Wnt/-catenin信號轉導以及非經典的Wnt/Ca2+信號轉導和Wnt/Planar cell polarity信號轉導。經典的Wnt/-catenin能夠促進OB的增殖、分化，而且對于OPG/RANKL/RANK信號通路亦有調控作用，通過抑制RANKL的表達、上調OPG的表達，間接影響OC的功能[32]。Wnt/-catenin還可以促進MSCs向OB分化，激活轉錄因子Osterix的表達，促進成骨[33]。

綜上所述，精覆力骨合劑能夠通過抗炎、改善骨微環境、調節成骨與破骨平衡、抑制OB凋亡和促進OC凋亡等多種機制調節骨代謝，發揮治療OP的作用。本研究依托“網絡靶標”理論，從網絡藥理學角度探析精覆力骨合劑的有效成分及作用靶點，結合生信數據分析，借助現代科學研究工具，對所得數據進行統計分析與可視化，契合中醫藥研究所具有的非線性的開放性復雜體系特點，探討精覆力骨合劑治療OP的多靶點整體調節作用機制，分析潛在效用靶點及信號通路，為臨床應用黃精及以其為君藥的復方-精覆力骨合劑治療OP提供理論支持，為拓展傳統保健中藥黃精的臨床新用奠定基礎，同時也為進一步的實驗研究提供依據與思路。