水稻氮高效利用的研究進展

唐海浪,程在全,鐘巧芳*,羅 瓊*

(1.云南農業大學 植物保護學院，云南 昆明 650201；2.云南省農業科學院 生物技術與種質資源研究所/云南省農業生物技術重點實驗室/農業部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室，云南 昆明 650205)

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是我國65%以上人口的主要糧食來源[1]。我國作為水稻的主產大國，一直以來都把不斷提高水稻的產量及品質作為一項重要的任務。在20世紀90年代，氮肥的過量投入與利用效率低等問題已經在我國農作物生產上表現出來[2]。我國主要依賴大量的化肥和農藥投入來提高水稻產量。據世界糧農組織(FAO)統計，目前我國單季稻田氮肥施用量為180 kg/hm2，高出世界水稻氮肥平均施用量的75%，而氮肥利用率僅為30%左右[3-5]。據國際肥料工業協會IFA(International Fertilizer Association)預計，未來5年世界化肥需求量將以年均1.5%的速度增長，達到1.99億t，其中氮肥1.12億t[6]。大量施用氮肥帶給土地、環境巨大壓力，不利于農業生產和人類生存。大量的氮素流失不僅造成地下水污染、土壤酸化和板結，還帶來成本增加和病蟲害加劇等問題[7-8]。

大量研究表明，水稻氮素的積累和吸收效率存在明顯的基因型差異，篩選和培育氮高效水稻材料是提高氮肥利用率的重要途徑之一[9-12]。近年來，化肥農藥過量投入所引發的食品安全、環境污染等問題備受關注，這已經威脅到我國水稻農業生產的可持續發展。針對目前我國水稻生產上面臨的各種負面問題，本文主要針對水稻的氮素吸收利用效率、生理機制、減氮減藥的措施及水稻氮高效基因挖掘方面進行綜述，以期為今后更好地開展氮高效水稻農業育種研究工作尋找突破口，并提供理論依據。

1 氮素吸收利用效率的評價

1.1 評價指標

作物氮效率的評價指標有10幾種[13]。通常所說的氮素利用率(Nitrogen Use Efficiency, NUE)指單位可利用的氮所產生的干物質產量或籽粒產量，包括氮吸收效率(Nitrogen Uptake Efficiency, NUpE)和氮利用效率(Nitrogen Utilization Efficiency, NUtE)2個方面，前者反映了水稻從外界吸氮的能力，后者則體現水稻自身氮素的轉化能力。根據研究目的和評價角度的不同，可將NUE指標分為3類。(1)氮肥吸收和利用評價指標：氮肥農學利用率(Agronomic Efficiency of Fertilizernitrogen, AE)、氮肥表觀回收率(Apparent Nitrogen Recovery Efficiency, ANR)、氮肥偏生產力(Partial Factor Productivity of Nitrogen Fertilizer, PFP)和氮素生理利用率(Nitrogenphysiological Use Efficiency, NpUE)[14-15]。這些指標能反映作物對施入土壤中氮的回收利用效率；(2)作物生理評價指標：氮素干物質生產效率(Nitrogen Dry Matter Production Efficiency, NPEd)、氮素籽粒生產效率(Nitrogen Grain Productionefficiency, NPEg)、光合氮素利用率(Photosyntheticnitrogen Use Efficiency, PNUE)和氮利用指數(Nitrogenutilization Index, NUI)，這些指標能反映作物體內氮素的物質生產能力；(3)作物自身氮素的轉移評價指標：氮運輸效率(Nitrogen Transport Efficiency, NTE)、氮收獲指數(Nitrogen Harvest Index, NHI)和氮再轉移效率(Nitrogen Remobilization Efficiency, NRE)，這些指標主要用于評價作物吸收的氮素在器官之間和從營養器官到籽粒的分配和轉移情況。以上指標之間存在密切聯系，徐晴等[16]研究發現NUE與PNUE間存在良好的正相關關系(NUE=NUpE×NUtE)[17]，這給評價作物氮肥利用率提供了快速、簡便的方法。

通過施氮更有利于水稻高產群體的形成，提高水稻干物質的積累和分配、單位面積有效穗數和穎花量，提高籽粒生產效率和收獲指數。且通過氮素的協調分配，有利于提高水稻NUE。

1.2 高效氮水稻的定義

水稻高效氮的研究主要包括品種的耐低氮性和耐肥性，前者更具實際的應用價值。一般來說，氮高效水稻的篩選指標主要包含生理生化指標、形態指標以及綜合指標。不管是低氮還是高氮條件下，氮高效水稻都擁有較高的產量、生理利用率和農學利用率[18]。目前國內外主要從3個方面定義氮高效水稻。第一，在氮素吸收和轉運量方面。氮高效水稻具有吸氮量大和氮素累積量大等特征。戢林等[19]研究顯示，氮高效基因型能保持較高的產量和氮素利用效率，產量是低效基因型的1.75倍，氮肥利用率高達50.9%，氮素轉運效率可達60%左右。孫永健等[20]也發現，氮高效品種具備優良的結實期莖鞘高氮素轉運、高總穎花數及結實率。提高水稻抽穗期至成熟期氮累積量，就能促進莖鞘氮素運轉效率，實現高產與氮高效利用的同步提高。產量的高低主要是由氮素利用率的不同所致，而高效氮水稻往往具有很強的吸氮和很高的氮素轉運能力。第二，在植株農藝生理性狀方面。氮高效水稻的重要特征應具備良好的根系形態和生理活性[21]。吸氮能力強的水稻在形態上表現為根系長度、體積、分布密度和有效吸收面積較大，在生理生化特性上表現為根系氧化力強，脫氫酶活力、細胞色素氧化酶活力強及ATP含量高，傷流液中氨基酸含量高、種類多，對NH4+的親和力較大等特點[22-24]。Yang等[25]研究表明，根系生長和代謝活性越強，水稻對氮的吸收和同化能力也越強，從而提高NUE。第三，在產量方面。Ladha等[26]研究發現，不管土壤肥力如何，水稻的產量均高于相同生育期水稻平均產量的可定義為氮高效基因型水稻。反之，為氮低效基因型水稻。樸鐘澤等[27]研究表明，產量和收獲指數都高的水稻品種為氮高效品種。可見，產量是水稻最主要的農藝性狀，它可描述為水稻成熟期氮素吸收量與產谷利用效率的乘積。在理想狀態下，氮高效水稻同時兼具高效吸收能力和高效利用能力，但目前還未找到這樣的理想基因型水稻品種。

1.3 氮高效水稻氮素吸收的源庫關系

源庫關系是衡量水稻群體質量的重要指標，對植株養分吸收、器官生長和產量的形成十分重要。干物質生產是水稻庫容量和產量形成的基礎，庫容量是反映水稻植株儲藏灌漿同化物能力的指標。水稻產量水平與庫容量大小密切相關，大庫容量的水稻具有較高的產量潛力。產量的形成受源庫互作的影響，而產量的高低主要因由源向庫轉化的差異所致[28]。隨著研究的深入，已有大量研究報道，作物的源庫關系與氮素吸收利用密切相關。有研究表明，水稻植株葉面積和莖鞘干質量等較高時,光合物質生產能力也越強[29]。水稻的庫容量越大，齊穗期葉面積系數和結實期凈同化率也越高[30]。陳琛等[31]研究表明，相比氮低效水稻，氮高效水稻品種在不同施氮水平下的源、庫及其相關指標等都具有明顯的優勢，庫容量的作用大于葉面積系數。氮高效吸收秈稻品種在抽穗期的葉面積系數、綠葉質量和比葉質量比氮低效型有更明顯優勢。董桂春等[32]研究表明，吸氮量與庫容量呈極顯著線性正相關，且氮高效水稻庫容量明顯高于氮低效品種。單位葉面積穎花數的提高有利于同化物向穗部的轉運，從而形成實際產量。因此，協調好水稻的源庫關系，對水稻氮素吸收利用效率的研究意義重大。作物的產量與氮吸收利用效率呈極顯著正相關，可將氮吸收量和氮利用率可作為篩選和改良氮高效谷子品種的2個獨立性狀指標。

2 水稻氮高效吸收利用的生理機制

2.1 氮相關轉運蛋白與氮肥吸收利用

植物主要依靠根系吸收無機氮(包括硝酸鹽、銨鹽)和有機氮(包括氨基酸、多肽等)來維持自身的正常生長發育。針對其復雜的生存環境，植物進化出了多種復雜的氮吸收轉運系統。國內外學者大量研究表明，不同基因型水稻品種在氮素吸收利用方面均存在明顯差異，而且這種差異主要由基因型不同引起[33-35]。在模式植物擬南芥中共鑒定了4類主要的硝酸鹽轉運蛋白：NRT1s、NRT2s、CLC和SLAC/SLAHs。將它們統一命名為NPF(NRT1/PTR)家族成員，已經證實了12個家族成員參與了硝酸鹽轉運過程[36]。根據硝酸鹽轉運蛋白活性，可將其分為高親和性、低親和性兩類。CHL1(AtNPF6.3或AtNRT1.1)是第1個在植物中被鑒定的，且是目前重要的NPF家族成員，它的功能不僅是對根部硝酸鹽的吸收和地上部轉運，還作為感受器參與硝酸鹽的應答反應，它又兼具雙親活性[37]。

在水稻的生長過程中，硝酸鹽轉運蛋白對其氮素吸收和轉運起到重要作用。已知，在水稻中一共有93位NPF(NRT1/PTR family)成員，但是功能得到鑒定的卻很少[38]。OsNRT1(OsNPF8.9)是水稻中第1個被鑒定的低親和硝酸鹽轉運蛋白，它主要負責對根部硝酸鹽的吸收[39]。不同品種水稻在硝酸鹽吸收和轉運方面差異顯著。氮高效利用水稻在生理活性上表現為功能葉氮、碳同化代謝中的硝酸還原酶(NR)、谷氨酸合酶(GOGAT)和核酮糖二磷酸羧化酶(RuBP-Case)的活力與地上部干物質生產量較高。阮新民等[40]研究表明，氮高效利用水稻在低氮條件下具有較高的谷氨酸(Glu)、α-酮戊二酸(2-OG)和蔗糖含量。水稻氮高效高產品種在有效分蘗臨界階段的無效分蘗發生少，拔節后的分蘗穩定，因此成穗率相對較高。氮素利用效率較高的植株往往具有較高的葉綠素含量[41]，這主要因為植株葉片的持綠性與植株的氮素利用效率有密切聯系。胡雅杰等[42]研究發現，不同穗型水稻品種的氮肥偏生產力和氮素收獲指數表現為大穗型>中穗型>小穗型，而周磊等[43]研究表明，高產氮高效型秈粳雜交稻具有較大的群體穎花量，生育中后期能保持較高的葉面積指數，花后莖鞘、葉片氮素轉運量高，光合生產能力強且持久，穗部氮素積累多和氮素吸收速率高，農學利用率、生理利用率和氮素收獲指數高等特征。余華清等[44]研究表明，花前過高的養分積累可能對產量的提高起消極作用，但適當地提高花后養分的積累，能明顯提高產量。水稻種植中要充分發揮水肥互作優勢及養分協同轉運特性，實現水肥利用效率和產量的同步提升。

2.2 根系生長與氮肥吸收利用

根系是水稻吸收水分和養分的主要器官，還是多種激素、有機酸和氨基酸等物質合成與轉化的重要場所，其形態和生理特征對地上部生長發育、產量和品質形成有著重要影響[45-46]。不同的根系形態會導致水稻對氮素吸收的差異，直接影響生育期水稻的生長發育和成熟期的籽粒大小和品質[47]。

水稻吸氮形態主要以銨態氮為主，不同水稻間的氮吸收利用效率存在顯著差異，而水稻根系的形態性狀和生理活性的差異會直接影響水稻對氮素的吸收和利用。陳晨等[48]研究顯示，在NH4+-N培養下的水稻營養指標與根系形態指標的相關性要高于其在NO3--N下的相關性，水稻苗期總根體積、總根面積、總根長、分枝數可作為水稻氮高效評價的重要指標。李娜等[49]研究表明，水稻抽穗期根系形態與產量關系非常密切，氮高效品種抽穗期粗分枝根長度的增長和氮低效品種細分枝根表面積的增大均能提高產量。氮高效利用水稻有良好的根系形態和生理活性等重要特征，特別在是拔節期和抽穗期，氮高效基因型粗分枝根的根長、表面積和體積均顯著大于氮低效型。葉利庭等[50]研究不同氮效率水稻生育期氮素積累轉運特征發現，氮高效水稻主要在齊穗期以后表現出強的氮素吸收或者轉運能力，以滿足籽粒形成期植株對氮素的利用。尤其在低氮條件下，更深的根分布和更高的根活力均可以作為篩選高產且氮高效水稻品種的標準。Ju等[51]研究表明，在相同施氮條件下，氮高效利用水稻品種根系扎根較深，在10～20 cm根層具有較大的根系生物量，并且在抽穗期根系氧化力要明顯高于氮低效水稻品種。于小鳳等[52]通過分析不同粳稻品種吸氮能力根系性狀的差異，結果顯示，根干重、冠根比、單株不定根總長、單條不定根重是影響粳稻品種吸氮能力的主要根系性狀。

3 提高水稻氮高效吸收的途徑

提高氮素利用效率的方法有很多，例如選育氮高效品種，主要提高水稻自身的氮素吸收潛力，可以減少氮素的投入量。我國目前的氮肥施用量處于超飽和狀態，通過適當地減少施氮，不僅能減少病蟲害的發生，而且增加水稻的抗倒伏能力。也可以采用實地養分管理新技術(SSNM)，即通過對輸入的土壤和作物的相關數據進行綜合分析后為農戶提供更為科學、經濟和有效的施肥方式。李艷等[53]研究顯示，推廣測土配方施肥技術，采用有機和無機肥料配施可有效提高水稻土有機碳含量和固碳速率，并能顯著提高水稻產量。柳瑞等[54]研究表明，與常規施氮相比，適量減施氮肥對地上部水稻氮吸收量無顯著差異，且減氮配施生物炭可顯著促進水稻對氮素的吸收，增幅為34.8%～52.4%。田昌等[55]研究發現，采用控釋氮肥減量的施肥模式，不僅能保證水稻的高產，還能有效減少氮素徑流損失，并提高水稻對氮素的吸收利用率。段然等[56]研究發現，采用緩釋肥料配合側條施肥技術能減少氮肥施用量，且能提高早(晚)稻的產量，肥料利用率是尿素常規施肥的1.7倍。秸稈還田也是一種提高氮利用效率和改善農田環境的重要措施。秸稈還田不僅提高土壤中可吸收氮素含量，也能促進土壤氮循環和礦化，減少氮素損失和改善土壤結構[57]。鴨-稻共育種植模式也能提高土壤有機質含量、水稻地上部和地下部生物量，同時能提高水稻的抗倒伏能力和減輕病蟲草害的發病指數，對保護生態具有積極作用[58]。土壤干濕交替也是提高氮素利用效率的重要栽培措施，干濕交替能促進氮素礦質化作用來提高土壤氮含量。有研究表明，在高氮條件下，結實期輕干濕交替相較于常規灌溉顯著提高了水稻的結實率和產量，并提高了其農學和生理利用效率[59]。張自常等[60]研究也表明，畦溝灌溉和干濕交替灌溉條件下較常規灌溉條件下,水稻增產幅度在6.16%～11.60%。

以上結果表明，氮肥調控水稻產量的生理機制是一個十分重要又復雜的過程，清楚掌握水稻生育期內的營養吸收特性，指導農民科學的施氮施藥和田間管理，提高水稻氮素吸收利用，保證水稻高產、穩產。

4 水稻氮高效基因的克隆與應用

水稻氮高效基因型通常在植株表型和生理性狀上表現獨特，這為氮高效水稻篩選提供了重要的理論依據。近年來，隨著分子標記技術、功能基因組學及分子生物學的發展。研究者們利用遺傳群體和突變體的方法克隆了許多產量性狀基因，包括Gnla、GS3、GW2、GHD7、GIF1、GW5、SP1、DEP1、IPA1、GS5、GW8、qGL3和TGW6等[61-65]。

在水稻中已經發現了參與調控水稻氮代謝的多數基因，包括GS、NR、AMT、GOGAT、NRT等[66-67]。研究者們通過過表達這些基因，希望可以提高水稻的氮素利用效率，但效果甚微[68-71]。Hu等[72]研究發現，NRT1.1B是控制水稻氮素吸收與利用的關鍵基因，在秈稻中該基因發生了一個SNP(980C>T)位點的變異，導致秈粳稻攜帶不同NRT1.1B等位基因，從而導致其氮素利用效率差異顯著。通過將秈稻中OsNRT1.1B導入粳稻后，在低氮水平下，與對照相比,氮肥利用效率提高30%，產量增加30%～33%。由此可見，該基因對提高氮素利用效率有重要利用價值。目前，在水稻中，DEP1與Gnla、DEP1與IPA1間的互作研究已有相關報道。Huang等[73]研究發現，等位基因dep1能使Gnla編碼的OsCKX2表達量下調，從而有利于每穗粒數的提高。Li等[74]研究發現，水稻中DELLA蛋白不僅控制株高，還控制著氮素的吸收和同化。該研究進一步表明，水稻生長調節GRF4可與GIF1結合，并激活下游氮素吸收和氮同化相關基因的表達。它也能與DELLA蛋白互作，且該互作對于前者的互作具有競爭作用。當因子GRF4參與了植物的碳氮代謝過程，通過調控碳氮平衡以提高水稻產量和氮素利用效率。它也是赤霉素信號傳遞途徑的一個關鍵元件，可與DELLA蛋白積累時，GRF4與GIF1的結合就會被抑制。因此，氮素的吸收和同化也會降低。最近，傅向東課題組在水稻赤霉素與氮素響應方面取得新的重要進展。他們利用EMS化學誘變和遺傳篩選，從攜帶基因sd1的水稻高產品種9311中篩選到一個產量性狀對氮素響應不敏感的突變體ngr5(nitrogen-mediated tiller growth response 5)，該突變體的分蘗數和產量不隨氮水平的不同發生顯著變化，這表明NGR5負責氮促進水稻分蘗的調控。Wu等[75]進一步研究發現，NGR5是植物響應氮素的正調控因子。它可與PRC2蛋白復合物互作，通過介導組蛋白H3K27me3甲基化修飾水平來調節靶基因的表達，促進了植物在生長發育中對土壤氮素水平的響應。并且，NGR5也是赤霉素信號傳導途徑的一個新的關鍵元件，參與GA信號負向調控。赤霉素受體GID1蛋白通過與NGR5互作，促進NGR5蛋白降解，導致表觀遺傳修飾降低，進而促進靶基因表達，實現赤霉素抑制植物分枝生長發育。上述結果表明，存在一條依賴于NGR5的新重要GA信號調控通路，這對于全面挖掘GA信號和氮利用偶聯因子有重要應用意義。Zhang等[76]通過圖位克隆和遺傳互補試驗，發現了一個控制產量的關鍵基因DEP1(Dense and Erect Panicles 1)，它位于氮介導生長的一個數量性狀基因座qNGR9，因此施用適當水平的氮肥就能提高收獲指數和產量。隨著測序技術的發展和自然群體的應用，利用多個回交群體制定水稻分子遺傳育種策略已經初步成功。這些與氮吸收相關基因的克隆對未來水稻氮高效分子育種有重要的利用價值。

5 展望

水稻高產、穩產關系著國家的糧食安全。目前，除了繼續深入挖掘水稻中的高產基因，還應該明確這些基因的作用機理及如何更加有效選擇和利用這些基因來提高水稻育種效率。對水稻氮肥利用效率的研究主要有以下幾個方面。

(1)分析氮高效水稻品種的營養吸收特性和形態生理特征，構建氮高效水稻理想模式。氮高效水稻品種通常具備根系活力強、碳氮代謝旺盛、較大的群體穎花量、結實期養分累積量大等特征。因此，深入分析氮高效基因型品種的形態生理特征，將有助于明確氮素在植物體內的高效吸收、運轉和再分配的生理機制。

(2)氮高效基因的遺傳分析和定位。目前，關于水稻氮高效基因的基因定位方面，已經克隆了一些水稻氮素利用效率基因，并闡明了它們的分子作用機制。但水稻對氮素的吸收和利用是一個十分復雜的過程，營養元素的轉運蛋白是進行農作物養分高效利用遺傳改良的重要靶點，深入了解相關轉運蛋白和轉錄因子在氮素吸收中作用機制。并通過基因聚合手段促使作物協同高效吸收和利用氮素，對于農作物品種的氮高效遺傳改良是十分必要的。關于水稻的氮高效形成機制、遺傳調控網絡和關鍵調控過程還不是特別清晰，有待更深入的研究。

(3)加強新肥料的研發與生產技術的不斷改進，能夠有效減緩或控制肥料的溶解和釋放速度，減少氮肥的損失，從而大大提高氮肥的吸收利用效率，提高產量。建立起新肥料特點與品種、氣候、土壤等相匹配的因肥栽培技術。

(4)提高我國現代化水稻生產技術，特別是協調好高產和氮素高效利用的有效措施，重點發展機械化作業和水肥藥一體化研究。保證肥料投入的均勻度，提高氮肥的利用效率。

(5)深入挖掘在不同氮肥水平和不同氮源條件下控制氮肥利用效率的關鍵調控基因及優異等位變異，以期為氮高效分子育種提供更多的候選基因位點，定向改良特定的作物亞種或創制優異新品種。