寧杞1號枸杞健康株與根腐病患病株的土壤微生物群落和功能差異

賈晨波，郭洋，馬成蓮，蘇建宇，徐春燕

寧夏大學生命科學學院/西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021

枸杞（Lycium barbarumL.）隸屬于茄科枸杞屬，其根系較為發達，抗旱能力強，是寧夏重要的經濟作物。近年來，隨著寧夏枸杞種植規模的不斷擴大，枸杞病害的發生也越來越多，例如白粉病（Wang et al.，2015）、炭疽病（賈倩等，2014）及根腐?。–ariddi et al.，2018）等，這些病害常常會造成枸杞的減收減產，嚴重影響著枸杞產業的發展。其中，根腐病是極為常見的一種土傳病害，多發生在植物根部或莖部，其病原物的生活史的一部分或大部分存在于土壤中。在條件適宜時，病原物萌發并侵染植物根部或莖部導致植物發生病害。已報道枸杞根腐病病原菌種類有腐皮鐮刀菌、同色鐮刀菌、串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、疫霉菌和立枯絲核菌（劉振榮，1980；王國珍等，1994；李暉等，1998）等。根腐病的發生一般從植株根莖附近開始，局部皮層逐漸腐爛并向周圍擴散，輸導組織被破壞，營養物質不能從地下及時足量地運輸到植株地上部分，后期外皮脫落只剩木質部，最終致使全株枯萎死亡，危害嚴重時可毀壞整個果園。

目前國內外對于根腐病的研究較多，涉及大豆、人參和大白菜（Nyandoroet al.，2019；Li et al.，2020；郭梅等，2019）等多種作物上病原菌的分離、鑒定、致病性檢測（伍曉麗等，2020）和根腐病的防治（崔云龍等，1995；陳伶俐，2015）等方面。目前對于枸杞根腐病的研究較少，且主要集中于枸杞根腐病的發生現狀與防治辦法等方面，部分研究報道了枸杞根腐病的致病菌分離、毒力測定及其生物學特性（李捷等，2017），但對枸杞健康株和根腐病患病株的土壤及植物相關部位微生物群落結構的差異研究甚少。土壤微生物是土壤的重要部分（Naet al.，2019），植物土傳病害的發生、發病程度一般與病原菌、益生菌及植物所在土壤生態環境有密切的關系。例如，盧圣鄂等（2021）研究發現，黃精根際土壤真菌群落結構豐富度的降低和具有致病性的真菌相對豐度的增加有可能導致了黃精根際土壤微生物群落結構的改變和根腐病的發生。宋旭紅等（2017）基于高通量測序技術發現細菌種群豐富度和多樣性的顯著降低有可能是造成黃連根腐病的重要原因之一。余金陽等（2020）認為大蒜根腐病發生的主要原因是微生物群落結構失衡?？梢?，許多工作已經在多種植物上證實了根腐病的發生與土壤微生物多樣性及物種組成變化有密切的關系。因此，感染根腐病的枸杞植株與健康枸杞植株之間的土壤微生物群落組成及多樣性有怎樣的差異也值得深入研究。

2019年6月，寧夏中寧縣花豹灣村枸杞園的寧杞1號枸杞遭遇大面積死亡，植株大量干枯，挖出死株可見根部腐爛，經鑒定為根腐病所致。本研究采集了該地患病株和健康株的根表、根際和根圍土壤樣品，提取土壤中的宏基因組DNA，利用Illumina Miseq高通量測序技術對16S rDNA和ITS片段進行測序，對比患病株和健康株根表、根際和根圍土壤中微生物群落結構和功能的差異，該研究有助于我們了解枸杞根腐病發生與微生物群落之間的關系，豐富我們對枸杞根腐病的認識。

1 材料與方法

1.1 采集地概況

2019年 8月于寧夏回族自治區中寧縣花豹灣（37°17′N，105°39′E）采集樣品。中寧縣屬溫帶大陸性季風氣候，境內光照充足，日照時間長，年均日照時數 2855.0—3219.7 h，年均氣溫 8.3—11.0 ℃，地勢南高北低，平均海拔1140—1600 m，年均降水量78.5—335.0 mm（雷蕾等，2020）。該縣地勢平坦，土層深厚，得益于黃河與清水河的交匯灌溉，土壤富含各種礦物質和微量元素，為枸杞種植提供了得天獨厚的土壤條件。

1.2 樣品采集

所選樣地的枸杞栽培種為寧杞1號，根據枸杞植株莖葉的形態選出待采樣的植株，挖出整個植株的根。根據根的形態判斷植株是否患病，共選擇 3株患根腐病的病株和3株健康植株分別采集樣品，健康株隨機選擇，一般距離患病株10 m以內，所有患病株與健康株均選自同一塊種植地。以植株主干為中心，圍繞植株每120°為一份，按距離枸杞根部由遠及近的方法，依次采集根圍、根際土壤和根組織樣品。3份土壤樣品等比例混勻，分別獲得根圍樣品BZGW1和根際樣品BZGJ1。3個方向采集到的根組織進行混合，用于制備根表樣品BZGB1。同樣的方法獲得第2株和第3株患病株根組織及根圍樣品 BZGW2和 BZGW3、根際樣品 BZGJ2和BZGJ3，根組織用于制備根表樣品 BZGB2和BZGB3。使用同樣的方法采集健康株的根表組織、根際土壤、根圍土壤樣品各3個。將根上的土壤抖落，然后用毛刷小心刷下的土壤用 20目標準篩除去根等雜物后即為根際土壤樣品，大約20 g左右；距根須1 cm以外一圈采集的土壤用20目標準篩除去根等雜物后即為根圍土壤樣品，大約100 g左右；根組織帶回實驗室處理得到根表樣品。所有樣品采集后均迅速低溫保藏并及時帶回實驗室，于?20 ℃暫存。

1.3 根表樣品的制備

取根組織浸沒于無菌PBS溶液，于4 ℃下180 r·min?1。低溫孵育 20 min，保留洗滌液；取出植物組織在同樣的條件下再次孵育20 min，合并兩次洗滌液并于 10000 r·min?1低溫離心 10 min，收集的沉淀物即為根表樣品。

1.4 DNA抽提和PCR擴增

根據 DNeasy PowerSoil Pro Kit（QIAGEN’s Second-generation Inhibitor Removal Technology?）分別抽提患病株的九個樣品和健康株的九個樣品土壤微生物總DNA，檢測合格后送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行16s rDNA和ITS片段的高通量測序。使用 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAG CAG-3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCT AAT-3′）對16S rRNA基因“V3+V4”區進行PCR擴增，使用 ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAG TAA-3′）和 ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGA TGC-3′）對ITS1區進行PCR擴增，檢測合格后利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序。

1.5 數據處理

使用 Trimmomatic軟件對原始測序序列進行質控，使用FLASH軟件進行拼接，過濾reads尾部質量值20以下的堿基，過濾質控后50 bp以下的reads，根據PE reads之間的overlap關系，將成對reads拼接成一條序列，最小overlap長度為10 bp；拼接序列的overlap區允許的最大錯配比率為0.2。使用的UPARSE軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/)，根據97%的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) 對每條序列進行物種分類注釋，比對 Silva數據庫和（https://www.arb-silva.de/）和 Unite數據庫（https://unite.ut.ee/），設置比對閾值為70%。所有的分析都基于抽平后的數據，采用Excel 2016和SPSS 17.0進行數據統計和分析，根據單因素方差分析檢驗顯著性，所有數據均用“平均值±標準差”表示，展示數據時分別將相應樣品名合并為BZGB、BZGJ、BZGW和JKGB、JKGJ、JKGW。

2 結果與分析

2.1 α多樣性比較

所有樣品測序共產生 1131102條真菌有效序列，聚類為1603個OTUs；產生479376條細菌有效序列，聚類為6704個OTUs。根表、根際和根圍土壤的真菌和細菌群落測序覆蓋度（Coverage）分別高于0.99和0.96（表1），表明樣品測序深度基本能夠反映微生物的真實情況。健康株根表真菌群落的Sobs指數、Shannon指數、Shannoneven指數均顯著大于患病株（P<0.05），即健康株根表真菌群落的豐富度、多樣性和均勻度均顯著大于患病株（P<0.05）。健康株根圍土壤真菌的多樣性和均勻度也顯著大于患病株（P<0.05）。健康株根表、根際和根圍土壤真菌之間的群落豐富度差異顯著（P<0.05），健康株根表和根際土壤真菌均勻度差異也很顯著（P<0.05）；患病株根表、根際土壤真菌與根圍土壤真菌的群落豐富度差異顯著（P<0.05）。綜上，寧杞1號枸杞健康株根表真菌群落的α多樣性顯著高于患病株，而健康株的3個樣品中，根際土壤真菌群落的豐富度和多樣性最高。健康株和患病株之間，根表、根際和根圍土壤的細菌群落Sobs指數、Shannon指數和Shannoneven指數均無顯著差異（P<0.05），即健康株和患病株之間各部位樣品中細菌豐富度、多樣性和均勻度指數均無顯著差異。此外，健康株的根表與根際、根圍土壤的細菌群落豐富度、多樣性和均勻度指數均有顯著差異（P<0.05），患病株的根表與根際、根圍土壤的細菌群落豐富度、多樣性和均勻度指數也均有顯著差異（P<0.05）。

表1 微生物群落的Alpha多樣性指數Table 1 Alpha diversity index of the microbial communities

2.2 OTU水平的Venn圖比較

健康株和患病株各樣品中16S rDNA“V3+V4”區和ITS1片段的OTU分析結果顯示（圖1）：健康株的根表和根際土壤中特有的真菌 OTU數目多于患病株，根圍土壤中特有的真菌 OTU數目少于患病株；健康株根表特有的細菌 OTU數目多于患病株，根際和根圍土壤中特有的細菌 OTU數目少于患病株。綜上，患病株根表特有的真菌和細菌OTU數目均少于健康株，該結果表明患病株根表微生物類群少于健康株根表，患病株根表的微生物多樣性減少。

圖1 基于OTU水平的Venn圖Fig. 1 Venn diagram based on OTU levels

2.3 基于OTU水平的主成分分析

基于 bray_curtis計算距離的 PCoA分析（圖2A）檢測到寧杞1號各樣品真菌群落之間的總差異為 37.69%，健康株根表、根際和根圍土壤的真菌群落距離較近，表明健康株根表、根際和根圍部位的物種組成趨于相似，而患病株根表的真菌群落距根際和根圍真菌群落較遠，即物種組成有一定的差異性。此外，健康株和患病株各相同部位的群落組成也有一定的差異性。由此可見，健康株的各部位土壤真菌群落組成較為相似，根腐病患病株不同部位群落的組成具有一定的差異性。細菌群落之間的總差異為 51.32%（圖2B），健康株與患病株根表的細菌群落結構差異較大，根際和根圍的細菌群落間坐標距離較近，表明其健康株與患病株根際和根圍部位的細菌群落組成基本一致或相似。由此可見，根腐病患病株和健康株各部位的真菌群落結構差異更大，而患病株和健康株各部位的細菌群落結構總體差異較小，二者細菌群落的差異主要在根表部位。

圖2 真菌和細菌OTU水平的PCoA分析Fig. 2 PCoA analysis of OTU levels in fungi and bacteria

2.4 微生物群落組成分析

2.4.1 真菌群落組成分析

門水平上，真菌群落中子囊菌門（Ascomycota）在所有樣品中均是優勢門，平均占比達75.7%，且患病株不同部位樣品中的豐度均大于健康株的相應樣品，其中在患病株根表上豐度最大（94.4%）；被孢霉門（Mortierellomycota）豐度占第二，平均占比14.4%，健康株不同部位樣品中的豐度大于患病株（圖3A），且在根表上的差異最大，健康株根表為24.8%，患病株根表僅為3.6%。屬水平上（圖3B），將每個樣品中低于1%的物種歸為others，與unclassified和norank一并剔除掉，豐度高于1%的明確物種占47.3%—66.5%。健康株根表的優勢真菌依次為Mortierella（24.8%）、Fusarium（11.3%）、Alternaria（7.4%）和Plectosphaerella（2.5%），患病株根表的優勢真菌依次為Fusarium（31.5%）、Plectosphaerella（10.1%）、Alternaria（7.2%）和Mortierella（3.6%）?？梢娊】抵旰突疾≈旮淼膬瀯輰俳M成無較大差異，但優勢屬豐度差異較大?；疾≈旮鞰ortierella的豐度比健康株根表低85.48%，Fusarium的豐度高1.79倍，Plectosphaerella高3.04倍，Alternaria的豐度無較大差異。健康株根際土壤中的主要真菌依次為Mortierella（17.8%）、Fusarium（6.2%）、Metarhizium（6.8%）和Lophiotrema（4.9%），患病株的根際土壤中主要真菌為Fusarium（27.3%）、Mortierella（14.2%）、Clonostachys（6.9%）和Plectosphaerella（3.2%），說明健康株和患病株根際土壤中的優勢屬組成和豐度差異均較大，患病株根際土壤中Fusarium的豐度比健康株高3.4倍，Mortierella的豐度低20.22%。健康株根圍土壤中的主要真菌為Mortierella（20.9%）、Fusarium（15.7%）、Acaulium（4.9%）和Alternaria（4.5%），患病株根圍土壤的主要真菌為Alternaria（14.1%）、Fusarium（8.6%）、Metarhizium（5.4%）和Mortierella（5.2%），可見健康株和患病株根圍土壤中的優勢屬組成無較大變化，但優勢屬豐度差異較大。患病株根圍土壤中Mortierella和Fusarium的豐度分別比健康株低75.12%和45.22%，而Alternaria的豐度高2.13倍。健康株和患病株根表的優勢真菌占比不同，但其種類未發生改變；而根際和根圍土壤中的優勢真菌占比和種類均有差異。作為優勢屬的Fusarium在患病株根表和根際的豐度均高于健康株；Mortierella在健康株根表、根際和根圍的豐度均高于患病株；Alternaria在健康株和患病株根表的豐度幾乎無差別，而在患病株根際和根圍中的豐度均大于健康株；Plectosphaerella在患病株根表和根際土壤中的豐度顯著大于健康株。綜上，門水平上寧杞1號枸杞根表部位Ascomycota和Mortierellomycota豐度的變化及屬水平上根表部位Fusarium、Mortierella和Plectosphaerella三類重要真菌豐度的變化可能與其根腐病的發生有重要的關聯。

圖3 門水平和屬水平上真菌群落的相對豐度Fig. 3 Relative abundance of fungal communities at the phylum and genus level

2.4.2 細菌群落組成分析

變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）是細菌群落中的優勢門（圖4A），平均占比達86.5%，變形菌門和放線菌門在根表的豐度大于根際和根圍，而綠彎菌門、酸桿菌門和芽單胞菌門在根表的豐度小于根際和根圍。屬水平上，將細菌群落每個樣品中豐度均低于1%的物種歸為others，與unclassified和norank一并剔除掉，豐度高于1%的明確物種占15.6%—43.4%（圖4B），其中健康株根表的主要細菌為Arthrobacter（12.5%）、Mycobacterium（4.9%）、Lelliottia（4.3%）和Stenotrophomonas（2.1%），患病株根表的主要細菌為Arthrobacter（20.9%）、Lelliottia（4.2%）、Allorhizobium（2.7%）和Mycobacterium（1.9%）?？梢?，健康株和患病株的根表優勢細菌組成和豐度差異較大?；疾≈旮鞟rthrobacter的豐度比健康株根表高67.20%，Mycobacterium的豐度低61.22%，Lelliottia的豐度無較大差異。健康株的主要根際細菌有Arthrobacter（8.7%）、RB41（3.8%）、Blastococcus（1.8%）和Nitrospira（1.4%），患病株的主要根際細菌有Arthrobacter（8.2%）、RB41（2.2%）、Nitrospira（1.7%）和Blastococcus（1.3%）?？梢娊】抵旰突疾≈旮H的主要優勢屬組成一致，但各豐度稍有差異，患病株根際土壤中RB41的豐度比健康株根際低42.11%，Blastococcus的豐度低27.78%，Nitrospira的豐度高21.43%，Arthrobacter的豐度差異較小。健康株根圍土壤的主要細菌有Arthrobacter（4.7%）、RB41（1.9%）、Sphingomonas（1.3%）和Nitrospira（1.2%），患病株根圍土壤的主要細菌有Arthrobacter（6.8%）、Sphingomonas（1.9%）、Nitrospira（4.8%）和MND1（1.4%）?？梢?，健康株和患病株的根圍優勢細菌組成無較大差異，優勢屬豐度差異較大。患病株根圍土壤中Arthrobacter的豐度比健康株根圍高 30.9%，Nitrospira的豐度高3倍，Sphingomonas的豐度高46.15%。健康株和患病株的根際優勢細菌占比稍有不同，組成基本一致；健康株和患病株根表與根圍的優勢細菌組成和占比均不一致。細菌群落中，健康株和患病株根表優勢屬Arthrobacter和Lelliottia的豐度遠大于根際和根圍，且Arthrobacter在患病株根表的豐度顯著大于健康株，提示根表Arthrobacter豐度的變化可能與寧杞 1號枸杞根腐病的發生也有一定的關系。

圖4 門水平和屬水平上細菌群落的相對豐度Fig. 4 Relative abundance of bacterial communities at the phylum and genus Level

2.5 屬水平上LEfSe物種差異分析

LEfSe使用 non-parametric factorial Kruskal-Wallis sum-rank test（非參數因子克魯斯卡爾—沃利斯秩和驗檢）檢測具有顯著豐度差異特征，然后進行線性判別分析（LDA）來明確具有顯著豐度差異特征的物種。真菌群落（圖5A）的LDA分析（LDA>3，P<0.05） 表 明 unclassified_f_Didymellaceae、Ilyonectria、Mortierella、Lophiotrema和unclassified_k_Fungi的豐度分別對患病株根表、根際和健康株根表、根際、根圍差異效果影響最大。細菌群落（圖5B）的LDA分析（LDA>3.5，P<0.05）表明Allorhizobium、g_unclassified_f_Enterobacteriaceae、MND1、RB41、norank_f_Gemmatimonadaceae、norank_c_Gitt_GS_136的豐度分別對患病株根表、健康株根表、患病株根際、健康株根際、健康株根圍差異效果影響最大。屬水平上，患病株和健康株的各樣品中存在顯著豐度差異的物種各不相同，其中，優勢屬Mortierella是健康株根表具有顯著豐度差異特征的物種。

圖5 屬水平的LDA判別結果圖Fig. 5 LDA discriminant result chart of genus level

2.6 微生物功能預測

為探究患病株和健康株的微生物群落在功能分布上的差異，利用PICRUSt2對細菌群落進行功能預測（圖6），將預測結果與 KEGG數據庫對比發現，所有的細菌群落功能預測共有新陳代謝、環境信息處理、遺傳信息處理、細胞過程、有機系統和與人類疾病有關的六大類。其中，屬于新陳代謝的功能豐度占比最大，主要以碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝、核苷酸代謝、脂類代謝為主。其次為屬于環境信息處理的膜運輸和信號傳導，以及屬于遺傳信息處理的翻譯、復制和修復機制等?；疾≈旰徒】抵旮淼墓δ茇S度大于根際和根圍，且患病株根表的功能豐度大于健康株，這可能與根表微生物靠近植株、微生物與植株之間的相互作用較多有關。

圖6 細菌群落的功能預測Fig. 6 Function prediction of bacterial community

根據 FUNGuild功能預測可獲得樣品中真菌的功能分類及各功能分類在不同樣品中的豐度信息（圖7）。根據營養獲取方式將真菌分為三大類：病理營養型、共生營養型和腐生營養型，基于這 3種營養方式，將對環境資源的吸收利用采取相似方式的劃分為同一個guilds。屬于Animal Pathogen-Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph和Plant Pathogen這兩個類群的功能豐度較高，這兩個類群分別屬于腐生營養型和病理營養型，其中Animal Pathogen- Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph對應的真菌只有Fusarium，Plant Pathogen對應的真菌有Plectosphaerella、Clonostachys、Lectera等。兩個類群在患病株根表的功能豐度（26223）和根際的功能豐度（21779）遠遠大于健康株根表的功能豐度（8330）和根際的功能豐度（4547），在患病株根圍部位的功能豐度（5174）的豐度小于健康株的根圍功能豐度（9445）。

圖7 真菌群落的功能預測Fig. 7 Function prediction of fungal community

3 討論

土壤中的微生物與植物的土傳病害關系密切（Bakker et al.，2010；郭瑞英等，2005），微生物群落失衡會導致植物感病，植株在感染病原菌后，微生物群落結構也會發生變化（Jeannotte et al.，2005）。本研究發現，患病株根表的真菌群落多樣性低于健康株，這與根腐病引起的三七根際土壤真菌多樣性變化一致（Wuet al.，2015）；健康株和患病株根表、根際和根圍細菌群落的豐富度、多樣性和均勻度均無顯著差異，而針對黃芪根腐病的研究發現，發病程度與根圍土壤細菌群落的多樣性呈正相關（閆歡等，2020），由此可見，根腐病發生與土壤微生物群落之間的關聯不僅和植物類型有關，也可能與發病程度有關。一些研究表明病原真菌的積累是黃連根腐病發生的重要原因之一（陳姍姍等，2018），此外，建立在土壤和植物根系上的真菌群落似乎更容易受到隨機因素的影響（Ylvaet al.，2011；Wanget al.，2013；Peayet al.，2010）。根系分泌物是植物與土壤微生物群落相互作用的關鍵介質（Vives-Periset al.，2020），健康株和患病株根表的真菌群落多樣性差異大可能是根系分泌物所引起的。根系分泌物為植株和植物根系共生微生物形成了獨特的生存微環境，這些微生物相當于植物與土壤的聯系紐帶，當靠近植株的微生物群落發生變化的時候，植株首先會感知到并釋放分泌物，不同微生物會對植物根系釋放的化合物有不同的反應（Bertrandet al.，2001）。

分析門水平和屬水平上真菌和細菌群落結構組成發現，真菌群落中子囊菌門是絕對的優勢門，Fusarium、Mortierella和Alternaria是主要的優勢屬，其中Mortierella在患病株 3個部位的平均豐度（7.67%）小于健康株（21.19%）。Mortierella是土壤中常見的有益微生物，與土壤肥力密切相關，能夠產生多種生物活性物質，改善土壤健康狀況，并有效促進植株的生長（Liet al.，2018），可能具有生防功能。這可能是Mortierella在健康株中的豐度較高的原因之一。Fusarium是子囊菌門的一類，是苜蓿（楊劍鋒等，2020）、豌豆（Chittem et al.，2015）、大豆（Arias et al.，2013）和馬鈴薯（楊波等，2019）等多種作物根腐病的致病菌，李捷（2017）在甘肅枸杞根際土壤中也分離到了Fusarium且確定為致病菌。枸杞是多年生作物，產業化種植過程中，土壤一般都是單作土壤，極其容易造成土壤的同質性，這樣就更容易導致更多潛在病原菌的累積，例如隸屬于子囊菌門的Fusarium，本研究結果提示鐮刀菌可能也是寧夏枸杞根腐病的主要致病菌之一。Alternaria同樣被認為是造成作物病害的一種病原菌（高芬等，2008），多在植株葉斑或果實（Song et al.，2020；王彩霞等，2019；周園園等，2019）上分離得到，在枸杞上主要會引起枸杞干果霉變（岳苑等，2019），但還未有研究證實其為枸杞根腐病的致病菌。Arthrobacter是土壤中較為常見的細菌，其作為優勢屬在根表豐度最大且患病株根表的豐度大于健康株，在西洋參根腐?。ㄊY景龍等，2018）相關的群落變化研究中同樣發現Arthrobacter節桿菌為優勢屬，與本研究有結果一致，推測其與寧杞1號根腐病的發生有一定的相關性。健康株和患病株的各樣品有顯著豐度差異的物種均不相同，產生這種差異的原因以及該差異與植株的關系值得研究。本研究中真菌群落結構的變化比細菌群落更為顯著，而造成根腐病的主要病原菌多為真菌，因此，盡量限制真菌的傳播，構建穩定的真菌群落非常重要，有利于從源頭上控制根腐病的發生，益生微生物之間還可以相互“配合”，通過協同作用最大限度地獲取土壤以及宿主體內的養分，促進植物的生長。

PICRUSt2分析得到新陳代謝、環境信息處理、遺傳信息處理等六大類功能以及 46個二級功能，其中新陳代謝類的功能豐度較大，這與楊盼等（2020）對苜蓿根際土壤細菌群落功能預測分析的研究結果一致，這可能與植株的分泌物有關（Shiet al.，2011）。利用FUNGuild預測真菌群落的功能，結果表明屬于腐生營養型的 Animal Pathogen-Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph和Plant Pathogen這兩個類群的功能豐度較高，其中Fusarium較高的功能豐度與其在群落組成中較高的豐度相對應，且患病株根表和根際的豐度大于健康株，功能分析進一步說明Fusarium可能是枸杞的關鍵致病菌。Plectosphaerella在三七（Hanet al.，2020）中首次被證明為致病菌，其會不會引起枸杞根腐病的發生有待進一步驗證；而有益菌屬Mortierella在健康株根表、根際和根圍土壤的豐度均高于患病株，且并未在腐生營養型這個分類中，說明真菌群落組成和結構差異可能引起了其功能上的差異，進一步引起群落結構的失衡，最終可能導致寧杞1號根腐病的發生。

4 結論

患病株根表的真菌多樣性顯著低于健康株，而健康株和患病株根際、根圍土壤的真菌多樣性及根表、根際和根圍土壤的細菌多樣性差異不顯著。Fusarium、Alternaria與Mortierella為寧杞1號枸杞根表、根際和根圍土壤中的主要真菌群落，其中患病株根表和根際的Fusarium豐度最大，患病株根圍的Mortierella豐度最大，健康株各部位的Mortierella豐度較大。細菌群落中變形菌門、放線菌門、綠彎菌門豐度較高，優勢屬Arthrobacter在患病株根表的豐度顯著高于健康株。真菌群落中Fusarium的功能豐度最高，且Fusarium在患病株根表和根際的功能豐度大于健康株，與相應的物種組成豐度相一致，說明Fusarium可能是枸杞根腐病的關鍵致病菌。細菌群落中參與新陳代謝的功能豐度最大，患病株根表細菌的功能豐度大于健康株根表?；谌郝浣M成與功能預測的分析共同說明了寧杞1號根腐病患病株根表的真菌多樣性顯著低于健康株，子囊菌門的Fusarium是患病株根表和根際的優勢類群且功能豐度最大。