熱應激對奶牛乳腺功能的影響及機制研究進展

鄭宇慧 歐陽潼 薛圣霖 李勝利

(中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

當環(huán)境溫度升高到一定程度，奶牛產(chǎn)熱大于散熱，進而出現(xiàn)體溫升高、呼吸頻率增加、產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)下降等現(xiàn)象，稱為奶牛熱應激[1]。近年來已經(jīng)證實全球溫度的普遍升高和奶牛產(chǎn)奶量日益增加導致的代謝產(chǎn)熱增加是加劇奶牛熱應激的2個直接誘因[2]。在熱帶及溫帶地區(qū)，奶牛的熱應激問題日益受到關(guān)注[3]，如在德國、意大利和美國的溫帶地區(qū)，熱應激已經(jīng)被認為是影響奶牛產(chǎn)奶、繁殖和健康的重要因素[4-6]。在中國，奶牛主要飼養(yǎng)于北方地區(qū)，其中熱應激對我國奶業(yè)主產(chǎn)區(qū)的河北、山東、河南、陜西和山西奶牛養(yǎng)殖影響較為嚴重[7]。

熱應激會給奶牛生產(chǎn)帶來多方面的不良影響，如熱應激會直接損害奶牛的乳腺健康，導致奶牛乳房炎等疾病的發(fā)病率增加[8-9]，進而影響產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)，降低奶農(nóng)的盈利。因此，關(guān)注熱應激對奶牛乳腺功能的影響及乳腺細胞對熱應激的反應，對于維持奶牛乳腺結(jié)構(gòu)和功能的完整性、更好地采取有效措施緩減熱應激對其乳腺組織的損傷具有重要意義。

1 熱應激對泌乳期奶牛泌乳功能和乳腺健康的影響

1.1 產(chǎn)奶量

熱應激是嚴重影響奶牛生產(chǎn)的因素之一。目前，盡管在奶牛養(yǎng)殖中已經(jīng)廣泛使用遮陽、風扇和噴淋等降溫措施，但是由于熱應激導致的泌乳期奶牛產(chǎn)奶量下降的經(jīng)濟損失仍然十分巨大[10]。熱應激會降低泌乳期奶牛產(chǎn)奶量，且其影響程度與奶牛的泌乳階段密切相關(guān)[3]，熱應激對泌乳早期奶牛的影響明顯高于泌乳中期和泌乳后期[11]。此外，熱應激對泌乳期奶牛產(chǎn)奶量的影響在達到最大之前存在一個延遲期。Spiers等[12]和Bernabucci等[4]的研究均表明，將泌乳初期或泌乳中期奶牛從熱中性環(huán)境轉(zhuǎn)移到熱應激環(huán)境后4 d，其產(chǎn)奶量會降至最低。溫濕度指數(shù)(THI)主要用于反映牲畜的熱應激強度，已被廣泛用于評估奶牛在高溫條件下的熱應激[13]。研究證實，在熱應激條件下，奶牛產(chǎn)奶量隨THI升高呈線性降低，如當THI從60增加到80時，THI每升高1，奶牛日產(chǎn)奶量就會降低0.13 kg[14]；在亞熱帶氣候條件下，當日平均THI從72.1增加到83.6時，THI每增加1，荷斯坦奶牛的日產(chǎn)奶量就會降低0.88 kg[15]。

1.2 乳成分

此前大量研究證實，熱應激與牛奶品質(zhì)下降有關(guān)，主要體現(xiàn)在乳蛋白、乳脂和乳糖含量的降低[16-17]。首先，與其他季節(jié)相比，夏季牛奶的乳蛋白含量降低了6%[16]。在熱應激條件下，奶牛的產(chǎn)奶量降低了40%，牛奶的乳蛋白含量降低了4.8%[18]。干奶期熱應激奶牛與噴淋降溫處理的奶牛相比，下一個泌乳期牛奶的乳蛋白含量顯著降低[19]；其次，脂質(zhì)是牛奶的重要成分之一，乳脂中98%由甘油三酯(TG)組成，以脂肪小球的形式存在[20]，鞘磷脂等極性脂質(zhì)對人體健康也具有減少膽固醇吸收[21]、促進嬰兒認知發(fā)展等有益作用[22]。此前研究發(fā)現(xiàn)，夏季牛奶的乳脂率較低[16,23-24]。通過氣象數(shù)據(jù)與紅外光譜預測的脂肪酸性狀之間的相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)，熱應激會導致牛奶中短鏈和中鏈脂肪酸含量減少。對牛奶的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測結(jié)果顯示：熱應激(THI=84)與含有短鏈和中鏈脂肪酸的TG基團的減少有關(guān)[25]。但是，在干奶期遭受熱應激對奶牛下一泌乳期的乳脂產(chǎn)量無顯著影響[19]；除此之外，乳糖是牛奶中主要的碳水化合物，含量為4.5%～5.0%，約占牛奶能量的30%。乳糖易被人體吸收[26]，具有促進兒童大腦發(fā)育、促進離子吸收和預防糖尿病等慢性疾病的功能。權(quán)素玉[27]的研究顯示，熱應激會降低奶牛乳糖產(chǎn)量。另外，在干奶期遭受熱應激也會降低奶牛在下一泌乳期的乳糖產(chǎn)量[28-29]。

1.3 乳腺健康

乳房內(nèi)感染是奶牛養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失的主要原因之一，主要由葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等病原體誘發(fā)[30]。夏季溫度高且噴淋等降溫措施會增加環(huán)境濕度，為病原菌的生長繁殖提供了較為適宜的條件[15]，且熱應激會損傷動物的免疫功能，進而影響乳腺的局部免疫功能[31]。因此，熱應激會引起奶牛乳房內(nèi)感染發(fā)生率的增加，進而導致其乳汁中體細胞數(shù)(somatic cell count，SCC)升高，甚至誘發(fā)乳房炎，嚴重危害奶牛乳腺健康。研究表明，與其他季節(jié)相比，夏季的牧場大罐奶的SCC明顯升高[32]，奶牛的臨床性乳房炎發(fā)病率顯著上升[33-35]。李建國等[36]也證實，隨外界環(huán)境溫度改變，夏季乳房炎發(fā)病率顯著高于冬季，具體而言，奶牛乳房炎發(fā)病率在1(3.75%)～8月份(18.10%)逐步上升，之后隨氣溫降低逐步下降。THI從65上升至75，荷斯坦奶牛的SCC增幅最大[37]，且其乳房炎的發(fā)病率隨牛舍THI的升高而顯著增加[38]。研究證實，牛奶中的細菌數(shù)與動物乳腺病原體的脫落密切相關(guān)，Hamel等[39]通過對奶牛乳腺細菌脫落模式及不同致病菌脫落強度的研究表明，引起乳房炎的病原體中葡萄球菌的脫落強度低于鏈球菌。熱應激條件下，THI的升高不僅會增加牛奶中的SCC[40]，還會顯著增加引起乳房炎的病原體從被感染的乳腺脫落的風險，因此增加了牛群中新的乳房炎感染風險。

2 熱應激對干奶期奶牛乳腺的影響

2.1 乳腺結(jié)構(gòu)

干奶期是奶牛產(chǎn)前6～8周的非泌乳階段，此時奶牛乳腺會經(jīng)歷退化和再發(fā)育的過程，奶牛衰老的乳腺上皮細胞會被功能齊全的新細胞替代，為下一次泌乳做好準備[41]。熱應激會影響細胞的形態(tài)、凋亡和增殖，包括細胞骨架結(jié)構(gòu)的質(zhì)膜功能、高爾基復合物的破壞、線粒體腫脹和熱休克等[42]。奶牛的產(chǎn)奶量由乳腺上皮細胞的數(shù)量和每個細胞的泌乳能力共同決定，而乳腺上皮細胞的數(shù)量是由細胞增殖與凋亡之間的差異所決定的[43]。在乳腺組織中，熱應激會導致具有抗凋亡作用的熱應激蛋白表達增加[44]，并下調(diào)參與細胞生長的基因表達，促進細胞凋亡、吞噬和存活相關(guān)基因的表達[45]，還會損傷乳腺上皮細胞合成相關(guān)蛋白，改變角蛋白和肌動蛋白的表達，造成乳腺退化。在乳腺再發(fā)育階段，熱應激會導致干奶牛乳腺上皮細胞的增殖受阻[46]，損傷其乳腺的微觀結(jié)構(gòu)，降低奶牛乳腺組織中的腺泡數(shù)量和面積，并增加其結(jié)締組織的比例，進而對奶牛的下個泌乳階段造成不良影響[47-48]。

2.2 免疫狀態(tài)

熱應激會對干奶期奶牛的免疫狀態(tài)產(chǎn)生負面影響，如抑制淋巴細胞增殖、降低針對非特異性抗原的抗體水平，還會影響奶牛下一個泌乳期血液中性粒細胞的氧化活性、吞噬作用和破壞病原體的能力[44]。遭受熱應激的奶牛其乳腺相對而言需要更大的免疫細胞浸潤性[49]和礦物質(zhì)利用率[50]以應對局部炎癥，熱應激會導致細胞介導的免疫功能受損[51]，影響乳腺的局部免疫功能[31]，甚至導致全身免疫細胞的功能受損。奶牛乳腺在干奶期的更新過程會導致大量細胞碎片的積聚[43]，這些細胞碎片需要通過巨噬細胞和中性粒細胞等免疫細胞進行清除，因此，此時免疫活性的降低會干擾干奶初期奶牛乳腺的退化。

圍產(chǎn)期免疫功能失調(diào)是導致奶牛在泌乳早期發(fā)病率增加的重要因素，研究表明，干奶期熱應激會加劇圍產(chǎn)期奶牛免疫功能失調(diào)，進而導致其泌乳早期乳房炎、呼吸系統(tǒng)疾病和胎衣不下等的發(fā)病率增加[52]。研究證實，奶牛產(chǎn)前熱應激會減少其血液中能夠觸發(fā)機體免疫應答的CD4+T細胞數(shù)量，導致奶牛外周血中具有吞噬異物產(chǎn)生抗體作用的單核細胞增殖反應減弱以及參與機體炎癥反應的腫瘤壞死因子-α的生成減弱[51]，這可能與熱應激加劇奶牛圍產(chǎn)期免疫功能失調(diào)密切相關(guān)。

2.3 犢牛初生重與初乳質(zhì)量

干奶期不僅是母牛乳腺發(fā)育的關(guān)鍵時期，也是其腹中胎兒快速生長發(fā)育的時期，干奶期熱應激不僅影響胎兒發(fā)育，還會對犢牛未來的生長性能造成持續(xù)性影響。熱應激會縮短奶牛的妊娠期，還會直接導致其干物質(zhì)采食量和體重降低[48]，進而導致奶牛胎兒初生重降低[46,53]，與干奶期未熱應激奶牛相比，妊娠后期奶牛若遭受熱應激，其所產(chǎn)犢牛的平均出生重會降低約4.4 kg[54]。研究證實，干奶期熱應激會降低初乳產(chǎn)量[55]，但對奶牛初乳中免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)含量的影響結(jié)果不一。Nardone等[56]和Adin等[19]的研究均表明，與非熱應激奶牛相比，熱應激會降低奶牛初乳中IgG含量。但也有研究發(fā)現(xiàn)，處于熱應激狀態(tài)的奶牛其初乳中IgG含量與非熱應激奶牛相比無顯著差異[57-59]。因此，干奶期奶牛熱應激被動免疫受損是否會造成初乳中IgG含量的改變有待進一步研究。

3 熱應激影響奶牛乳腺功能的潛在機制

3.1 采食與代謝

恒溫動物通過保證熱量獲得和熱量損失之間的平衡來維持體溫，其中獲得的熱量是體內(nèi)新陳代謝產(chǎn)生的熱量和環(huán)境中積累的熱量總和。在泌乳奶牛中，代謝產(chǎn)熱與產(chǎn)奶量密切相關(guān)[60]。產(chǎn)奶量為31.6 kg/d的奶牛代謝率比產(chǎn)奶量為18.5 kg/d的奶牛高17%[61]。隨著產(chǎn)奶量的增加，奶牛采食量和相關(guān)的消化產(chǎn)熱增加，導致其代謝產(chǎn)熱增加，故高產(chǎn)奶牛在熱應激時更難保持熱量平衡。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)奶量從35 kg/d增加到45 kg/d，導致奶牛熱應激的空氣溫度閾值降低5 ℃[62]，因此，近年來奶牛產(chǎn)奶量的增加導致其代謝產(chǎn)熱增加，進一步加劇了奶牛的熱應激。

人們一直認為熱應激引起的干物質(zhì)采食量降低是導致產(chǎn)奶量減少的主要原因[63]，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在高環(huán)境溫度下奶牛的生理狀態(tài)和新陳代謝發(fā)生明顯變化，這可能才是影響奶產(chǎn)量及乳成分的關(guān)鍵所在。熱應激奶牛的分解代謝與熱中性條件下限飼誘導的分解代謝有本質(zhì)區(qū)別。在熱中性限飼條件下，奶牛依靠脂肪組織中脂肪酸的長期氧化來維持生命功能，并將葡萄糖用于乳糖合成。因此其典型特征是血漿非酯化脂肪酸(NEFA)和β-羥基丁酸濃度升高及血漿葡萄糖濃度降低[64]。而在熱應激條件下，血漿NEFA濃度沒有增加[65]，但肝臟葡萄糖輸出量大于牛奶乳糖輸出量。此前研究證實，在熱應激條件下，泌乳期奶牛機體更偏好碳水化合物而非脂質(zhì)氧化，而在熱應激的泌乳早期和泌乳中期奶牛中，優(yōu)先使用葡萄糖作為外周組織的主要能量底物是以犧牲產(chǎn)奶量為代價的[66-67]。但是，不同于泌乳早期和泌乳中期奶牛，在熱應激條件下，妊娠后期奶牛的血漿NEFA濃度顯著增加，血漿葡萄糖濃度顯著降低，表明此階段奶牛的耐熱性更強[68]。這可能與其代謝產(chǎn)熱較低有關(guān)，因為妊娠后期奶牛的能量需要僅相當于產(chǎn)奶量為3～6 kg/d的泌乳期奶牛[69]。因此，熱應激條件下奶牛特殊的分解代謝可能是降低奶牛產(chǎn)奶量的關(guān)鍵所在，此外，這也可能是影響熱應激條件下奶牛乳腺吸收與利用營養(yǎng)物質(zhì)的重要因素。

3.2 乳腺營養(yǎng)物質(zhì)吸收

乳腺的血液流動在提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)支持乳成分合成方面起著關(guān)鍵作用，但關(guān)于動物在熱應激下乳腺營養(yǎng)物質(zhì)吸收的研究相對較少。研究發(fā)現(xiàn)，相較未熱應激組，熱應激會降低處于泌乳中期奶山羊的乳腺血流量，還有降低其葡萄糖動靜脈濃度差的趨勢，進而導致乳腺葡萄糖的凈吸收量降低[70]；泌乳早期的家兔暴露于急性熱應激時其乳腺血流量減少了35%[71]。熱應激期間奶牛乳蛋白合成減少的機制主要包括以下幾點：1)乳腺血流量減少導致乳蛋白合成前體受限；2)乳腺蛋白合成活性的特定下調(diào)[72]；3)蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)增加，酪蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白合成競爭氨基酸；4)瘤胃蛋白質(zhì)代謝的變化限制熱應激期間牛奶蛋白質(zhì)前體的可用性[73]；5)奶牛暴露于嚴重的熱應激后，熱休克蛋白(HSP)表達的增加可能會降低用于乳蛋白合成的循環(huán)氨基酸的利用率[72]；6)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑的激活減少[74]；7)調(diào)節(jié)奶牛的激素水平影響泌乳基因的表達[75]，增加機體發(fā)生氨基酸分解代謝提供能量，進而導致蛋白質(zhì)合成前體供應不足[76]。關(guān)于熱應激影響奶牛乳脂合成機制的研究表明[77]，乳脂合成受到抑制的途徑主要有2個：一個是在熱應激狀態(tài)下，瘤胃中不飽和脂肪酸的氫化路徑改變，產(chǎn)生如共軛亞油酸的不飽和中間體，這些中間體被吸收后，會抑制乳腺細胞中合成乳脂基因的表達，從而影響乳脂率；另一個是在熱應激情況下，脂多糖通過“腸漏”進入循環(huán)系統(tǒng)，刺激胰腺產(chǎn)生胰島素，導致動物體脂動員減少，乳脂率下降。此外，研究表明，造成乳糖產(chǎn)量下降的原因可能是熱應激激活了奶牛的免疫系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)激活后轉(zhuǎn)向利用葡萄糖，且腸道滲漏導致葡萄糖更多地進入血液被利用，使得乳糖合成前體供給減少[77]。此外，Wang等[78]通過KEGG富集分析表明，血小板反應蛋白受體36(CD36)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)的基因表達在熱應激條件下奶牛乳脂的合成中發(fā)揮著重要作用。

目前，由于乳腺活檢得到的是不同類型細胞的勻漿，包括免疫細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、乳腺上皮細胞等，熱應激如何影響體內(nèi)乳腺上皮細胞的營養(yǎng)吸收尚未完全明確。因此，未來研究可以關(guān)注熱應激對乳腺上皮細胞營養(yǎng)物質(zhì)吸收及熱應激對奶牛不同泌乳階段乳腺營養(yǎng)物質(zhì)代謝的影響。

3.3 內(nèi)分泌變化

除血流量外，熱應激誘發(fā)的機體內(nèi)分泌的改變由于能導致全身性代謝變化進而影響泌乳，也引發(fā)了人們的關(guān)注。如生長激素和胰島素樣生長因子-1含量在熱應激條件下的減少，表明機體新陳代謝和營養(yǎng)分配發(fā)生了變化，這可能是導致熱應激狀態(tài)下產(chǎn)奶量下降的重要因素[18,79]。此外，下丘腦-垂體軸在抗逆性和泌乳調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，下丘腦是調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和自主神經(jīng)系統(tǒng)的重要大腦區(qū)域，能夠?qū)囟刃畔⑥D(zhuǎn)化為機體的穩(wěn)態(tài)反應[80]。垂體被認為是奶牛體內(nèi)最重要的內(nèi)分泌腺，分泌催乳素(PRL)和生長激素(GH)，在乳腺發(fā)育、乳汁形成和乳脂合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[47]。Han等[81]研究顯示，下丘腦、垂體和乳腺的轉(zhuǎn)錄變化可能會影響小鼠在熱應激條件下的泌乳性能，其潛在機制為：1)熱應激導致下丘腦食欲相關(guān)肽表達降低，導致牛奶合成的底物供應不足；2)熱應激增加神經(jīng)元死亡并減少神經(jīng)遞質(zhì)的合成，導致神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能障礙和垂體激素(PRL和GH)含量的下降，降低奶產(chǎn)量。因此，后期試驗可進一步以奶牛為試驗動物開展相關(guān)研究。

3.4 自由基穩(wěn)態(tài)失衡與氧化應激

熱應激會導致機體自由基穩(wěn)態(tài)失衡，產(chǎn)生氧化應激和免疫失衡與炎癥反應失控的聯(lián)動反應，如不及時干預，就會使機體多種生理功能，包括乳腺功能和健康狀況惡化。正常情況下，氧自由基能被機體清除系統(tǒng)及時清理。體內(nèi)自由基的清除系統(tǒng)由酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)2部分組成，酶促系統(tǒng)主要依靠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)發(fā)揮作用。SOD主要作用為將氧自由基歧化分解成水，GSH-Px主要通過其中的巰基和活性氧結(jié)合清除自由基。熱應激條件下，動物的交感-腎上腺系統(tǒng)刺激增強，腎上腺髓質(zhì)部分泌大量兒茶酚胺類激素，其中的去甲腎上腺素作用會促進氧自由基的產(chǎn)生，若此時酶與非酶類抗氧化物數(shù)量或活性不足會導致機體酶促與非酶促系統(tǒng)功能下降，使自由基無法被及時清除[82]。活性氧和氧自由基大量累積會引起脂質(zhì)過氧化，生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸將被氧化為不穩(wěn)定的脂質(zhì)過氧化物，如丙二醇(malondialdehyde，MDA)。MDA具有細胞毒性，可通過交聯(lián)作用破壞細胞膜蛋白分子構(gòu)象，導致細胞解體、損傷甚至死亡[83]。前人研究表明，熱應激會使雛雞、小鼠[84]和豬[85]的機體代謝過程紊亂，氧自由基含量顯著上升，且抗氧化酶活性顯著下降，導致自由基無法及時被清除[86]。在熱應激條件下，奶牛血清中SOD、GSH-Px活性顯著降低[87-88]，活性氧和MDA含量極顯著升高，總抗氧化能力顯著降低[89]。綜上所述，熱應激會導致奶牛機體自由基穩(wěn)態(tài)失衡，從而使機體產(chǎn)生氧化應激。

熱應激條件下機體免疫功能和炎癥反應失控可能與抗氧化酶參與了誘導奶牛淋巴細胞凋亡的過程有關(guān)[87]。研究證實，熱應激會降低奶牛血清SOD和GSH-Px活性，進而導致奶牛外周血淋巴細胞凋亡率顯著升高[90]，且在體外條件下，熱應激也會使淋巴細胞的增殖減弱[91]。熱應激誘發(fā)淋巴細胞凋亡的機制為：熱應激刺激動物下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸，促進糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)分泌。GC能夠抑制淋巴細胞的DNA合成和細胞分裂，對巨噬細胞、漿細胞都有一定程度的損傷，進而影響機體免疫過程[92-93]。此外，熱應激還會導致抑制抗原遞呈和抗體活化，使得奶牛機體特異性免疫功能下降，介導炎癥反應的能力下降。

4 奶牛乳腺細胞對熱應激的反應

熱應激時，奶牛的核心體溫升高[94]、乳溫升高[15]會直接或間接導致乳腺內(nèi)部溫度升高[95]。近年來，關(guān)于乳腺細胞對熱應激的反應，主要圍繞HSP、細胞凋亡和乳腺上皮屏障的改變展開。

4.1 HSP

當牛乳腺上皮細胞暴露于較高的溫度(42 ℃)時，其基因表達譜顯示，與應激反應和蛋白質(zhì)修復相關(guān)的基因表達上調(diào)，與細胞代謝、形態(tài)變化和乳腺上皮細胞特異性生物合成功能相關(guān)的基因下調(diào)[96]。在熱應激條件下，細胞可以形成高度調(diào)節(jié)的應激反應能力，熱休克信息在幾分鐘內(nèi)就會傳遞至細胞質(zhì)中，并立即啟動HSP的合成翻譯，通過修復蛋白質(zhì)損傷和促進細胞正常生長條件來保護細胞免受熱應激的損傷[97]。其中，HSP是細胞應對熱應激反應的主要產(chǎn)物，并在細胞應對熱應激反應的調(diào)節(jié)因子中發(fā)揮重要作用[98]，應激誘導的HSP能夠通過預防蛋白質(zhì)變性和修復變性蛋白質(zhì)保護細胞免受損傷，以便細胞能恢復其生物學功能。細胞會通過熱激轉(zhuǎn)錄因子-1(HSF-1)調(diào)節(jié)熱應激誘導的HSP基因的表達，還會刺激HSF-1的激活并與熱應激元件(HSE)結(jié)合以誘導HSP的表達[98]。在正常條件下，細胞中存在一定量的HSP70，并且在細胞質(zhì)中與沒有DNA結(jié)合活性的HSF-1單體形成復合物[99]。熱應激條件下，機體對細胞的保護可能是通過增加HSP70和其他HSP的合成來介導的。Wang等[100]認為，HSP70的表達動力學可能是保護細胞損傷的重要原因，在細胞水平上，HSP70與應激耐受性密切相關(guān)[101]。Hu等[102]研究發(fā)現(xiàn)，熱應激狀態(tài)下奶牛乳腺上皮細胞中HSP70快速特異性合成，其轉(zhuǎn)錄量和蛋白表達量分別是非熱應激組的14和3倍，證實在奶牛體內(nèi)，HSP70對溫度升高極為敏感，是負責保護細胞免受熱應激的主要蛋白之一。胡菡等[103]在對奶牛乳腺上皮細胞進行42 ℃熱處理0.5 h后，發(fā)現(xiàn)細胞中HSF-1、HSP27、HSP70和HSP90幾個熱休克家族標志性基因的mRNA表達量顯著上調(diào)，且隨熱處理時間延長先持續(xù)上調(diào)，保持一段時間后降低。這些基因表達量的增加表明奶牛乳腺上皮細胞應對熱應激做出了自我快速保護反應，先增后降的趨勢說明細胞對高溫應激產(chǎn)生了耐受。

細菌入侵導致乳腺正常的分泌功能被破壞，HSPmRNA表達量升高，酪蛋白mRNA表達量降低[104]；3種最豐富的乳蛋白包括酪蛋白、β乳球蛋白和α乳白蛋白的mRNA表達量降低[105]。這些結(jié)果表明熱應激會破壞乳腺正常的分泌功能并增加HSP的合成，以保護和維持細胞活性。Hu等[101]研究發(fā)現(xiàn)，熱應激會誘發(fā)奶牛乳腺上皮細胞HSPmRNA表達量升高和酪蛋白mRNA表達量降低，證實熱應激下奶牛乳腺會減少乳蛋白的合成以增加HSP的合成，進而增強細胞自身的防御能力。

4.2 細胞凋亡

細胞凋亡或程序性細胞死亡能讓生物體在發(fā)育過程中去除不需要的細胞和維持組織穩(wěn)態(tài)，通常發(fā)生在發(fā)育和衰老過程中，是維持組織中細胞數(shù)量的一種穩(wěn)態(tài)機制。此外，一些生理和病理的原因也是引起細胞凋亡的重要因素。熱應激是一種重要的誘導凋亡的應激，它可以影響凋亡蛋白-1(Fas，又稱Apo-1)介導的細胞凋亡[106]，其中，F(xiàn)as最早于1989年被發(fā)現(xiàn)可誘導多種人體細胞凋亡[107]，它是一種跨膜蛋白，屬于死亡受體亞家族，可以被凋亡相關(guān)因子配體(FasL)刺激，招募不同的接頭蛋白，激活啟動因子含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-8和Caspase-3，從而啟動凋亡[108]。Cai等[109]研究證實，F(xiàn)as在熱應激誘導的奶牛乳腺上皮細胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

線粒體是雙膜結(jié)合的亞細胞細胞器，通過呼吸和調(diào)節(jié)細胞代謝產(chǎn)生心肌腺苷三磷酸(adenosine triphosphoric acid，ATP)，是細胞能量的主要來源，其形態(tài)和數(shù)量由其連續(xù)的分裂和融合動態(tài)變化決定[110]。研究報道，熱應激與線粒體腫脹及其嵴斷裂、基質(zhì)密度低、心肌ATP含量降低有關(guān)，表明熱應激會導致細胞線粒體功能損傷[111]。Chen等[112]研究證實，熱應激通過破壞線粒體裂變和融合的平衡而導致線粒體破碎，從而導致線粒體疾病和功能障礙，進而誘發(fā)奶牛乳腺上皮細胞凋亡和乳腺功能障礙，其潛在機制如圖1所示。

B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)家族蛋白是位于線粒體上的跨膜蛋白，可以與其他跨膜蛋白協(xié)同作用，影響線粒體膜通透性和調(diào)控線粒體膜電位，從而在細胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[113]。Bcl-2家族蛋白分為2類，一類包括抗凋亡因子，如Bcl-2、重組人B細胞淋巴瘤因子2xL(Bcl-xL)和骨髓細胞白血病蛋白-1(Mcl-1)等，并且可以通過Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)起到封閉孔形成的作用，從而防止線粒體釋放凋亡因子細胞色素C并阻斷細胞凋亡或阻止鈣離子(Ca2+)的釋放，阻斷Caspase級聯(lián)反應并抑制細胞凋亡；另一類包括促凋亡因子，例如Bax、Bcl2關(guān)聯(lián)死亡啟動子(Bad)和Bcl-2蛋白拮抗劑(Bak)等，它們可插入線粒體外膜形成通道，釋放凋亡活性物質(zhì)[113]。這2種蛋白通過一個二聚物網(wǎng)絡相互作用，不同的二聚體之間的平衡決定了細胞的凋亡，因此Bax與Bcl的比例越高，細胞凋亡的發(fā)生率就越高[114]。研究證實，熱應激會通過提高Bax與Bcl的比例以誘發(fā)奶牛乳腺上皮細胞的凋亡[115]。

4.3 乳腺上皮屏障

熱應激會對上皮屏障的完整性產(chǎn)生負面作用，在先前的報道中，熱應激在體外條件下增加了犬[116]和豬[117]腎上皮細胞以及人結(jié)腸和腎上皮細胞形成的上皮連接的通透性[118]。同樣，在體內(nèi)條件下，熱應激也會損害豬、嚙齒動物和猴子腸道上皮的完整性[119-121]。然而，關(guān)于熱應激對哺乳動物乳腺上皮組織通透性的影響研究較少，最近的一項研究探討了給泌乳中后期奶牛降溫和不降溫對奶牛乳腺上皮完整性的影響，結(jié)果表明，熱應激狀態(tài)下奶牛的乳腺能夠保持其上皮的整體完整性，但是急性熱應激會暫時導致奶牛乳腺上皮屏障的滲漏[122]。在哺乳動物乳腺中，熱應激會誘導廣泛的蛋白質(zhì)變性和降解[123-124]，因此，熱應激可能導致上皮連接相關(guān)蛋白的凈損失，而熱應激乳腺通過增加這些蛋白的基因表達來盡力保持其上皮的完整性，后期研究可關(guān)注乳腺緊密連接蛋白的表達情況。Collier等[96]研究表明，奶牛乳腺上皮細胞在熱應激條件下，有關(guān)細胞結(jié)構(gòu)、新陳代謝、生物合成和細胞內(nèi)運輸相關(guān)的基因下調(diào)，而HSP70表達量下降到基礎(chǔ)水平后，參與細胞修復、蛋白質(zhì)修復降解和熱耐受喪失后凋亡的基因表達量顯著增加。因此，乳腺可能通過合成更多的蛋白質(zhì)來補償熱應激導致的蛋白質(zhì)損失。這些結(jié)果的確切機制目前尚不明確，但可能代表一種乳腺的適應性機制，即動物機體以犧牲乳汁的合成為代價，轉(zhuǎn)移能量和營養(yǎng)以支持乳腺的關(guān)鍵功能如維持上皮的完整性等。

5 小 結(jié)

熱應激是影響奶牛乳腺健康和生產(chǎn)性能的重要因素，不僅會導致奶牛產(chǎn)奶量及乳品質(zhì)的下降，還會影響奶牛乳腺健康，導致乳房炎發(fā)病率的增加，了解熱應激對奶牛乳腺功能的影響及其潛在機制，明確乳腺細胞對熱應激的反應，能為養(yǎng)殖中緩減奶牛熱應激提供理論依據(jù)。