青蒿提取物對泌乳奶牛瘤胃發酵參數及微生物區系的影響

余詩強 熊安然 潘予琮 汪 悅 張亞靜 蔣林樹* 熊本海*

(1.北京農學院動物科學技術學院，奶牛營養學北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193；3.河北省高碑店市職教中心，保定 074000)

奶牛瘤胃是一個大型生物反應器，瘤胃中的微生物能夠幫助奶牛將大量不能被宿主直接利用的物質轉化成能被利用的高質量的營養素，如消化宿主動物不能消化的纖維素、半纖維素等物質，顯著增加飼糧中總能的可利用程度；同時宿主-瘤胃-微生物相互作用參與機體許多重要的生理過程，因此瘤胃微生物區系的組成與結構影響宿主對飼糧營養物質的消化與吸收[1-2]。長期以來，大量研究一直致力于改善飼糧配方和使用飼料添加劑來優化、調節瘤胃的菌群結構，以此促進瘤胃發酵，提高飼糧中營養物質的利用效率[3]。植物提取物作為新型飼料添加劑，具有綠色、無毒、無殘留等優點，能解決抗生素帶來的藥物殘留等問題，是替代抗生素優選物質[4]，同時，植物提取物可以調節反芻動物瘤胃菌群結構，改善瘤胃發酵、減少甲烷排放、提高動物的飼糧利用率和生產性能[5]。

青蒿(ArtemisiaannuaL.)，又名草蒿、香蒿等，是菊科艾屬一年生草本植物，其富含植物營養活性物質，例如單萜、倍半萜和酚類等化合物，生物學功能廣泛[6]。青蒿在世界各地分布廣泛，可以被動物食用，具有改善畜產品品質，增強動物機體抗菌、抗炎、抗氧化和免疫調節能力[7-8]。青蒿是一種非常規飼料，其無毒無害、無耐藥性，在畜牧生產上應用廣泛，是營造動物安全養殖環境的理想飼料資源[9]，飼糧中添加適量青蒿提取物能調節機體免疫功能，提高腸道消化酶活性，增強機體抗病能力，提高動物的生產性能[10]。在奶牛飼糧中添加120 g/d的青蒿提取物能顯著改善奶牛機體的脂質代謝途徑，提高乳腺上皮細胞活性，激活腺苷酸活化蛋白激酶-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(AMPK-mTOR)信號通路，促進奶牛乳汁中乳脂合成[11]，其能提高奶牛體外發酵試驗中瘤胃液氨態氮(NH3-N)濃度和干物質消化率，降低中性洗滌纖維含量和乙丙比，并抑制甲烷產生[12]。青蒿提取物能改善反芻動物瘤胃發酵，促進短鏈脂肪酸(SCFA)生成，提高代謝能(ME)、泌乳凈能(NEL)和有機物消化率，在抑制甲烷產生方面具有積極作用[13]。但目前青蒿提取物對奶牛瘤胃發酵的影響尚未見報道。因此，本試驗擬通過飼養試驗深入研究青蒿提取物對瘤胃發酵參數和微生物區系的影響，以期為青蒿提取物在奶牛生產實踐中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的青蒿提取物為棕黃色粉末，選購自陜西某天然制品有限公司，其主要成分和含量如下：青蒿素39.0%，粗灰分13.0%，粗纖維27.9%，粗蛋白質6.3%，水分5.0%，多糖8.3%，揮發油0.5%。

1.2 試驗動物及飼養管理

選取健康、泌乳中期、體況相似、胎次為2～4胎、日產奶量為(33.0±3.9)kg/d的荷斯坦奶牛20頭為試驗動物。試驗牛采用散欄帶臥床式飼養，每天07:00、13:00和18:00對奶牛進行投料，09:30、15:30、21:30進行擠奶。試驗期間奶牛自由采食，自由飲水，牛舍每天清掃、清糞。基礎飼糧參照NRC(2001)奶牛飼養標準配制，以全混合日糧(TMR)形式飼喂，基礎飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.3 試驗設計

本研究于2019年5—7月在奶牛營養學北京市重點實驗室延慶基地進行。試驗牛隨機分為4組(1個對照組和3個試驗組)，每組5頭，對照組飼喂基礎飼糧，試驗組飼喂在基礎飼糧中分別添加0.25%[50 g/(d·頭)]、0.50% [100 g/(d·頭)]、0.75% [150 g/(d·頭)]青蒿提取物的試驗飼糧。試驗期45 d，其中預試期10 d，正試期35 d。

1.4 樣品采集與測定

1.4.1 瘤胃液的采集

在正試期的第35天，于晨飼前1 h經口腔采集瘤胃液，使用滅菌的4層紗布進行過濾分裝于15 mL離心管和5 mL凍存管中，保存于-80 ℃備用，用于NH3-N、揮發性脂肪酸(VFA)濃度和瘤胃菌群的測定。

1.4.2 樣品測定

pH：使用PHS-10型便捷式pH計測定。

NH3-N濃度：參照王加啟[14]的比色法測定。

VFA濃度：采用內標法測定。使用安捷倫7890B型號氣相色譜儀測定。色譜條件為FID檢測器，流速為30 mL/min的N2作為載氣，空氣發生器提供流速為40 mL/min的氫氣，空氣流速400 mL/min，總流量為54 mL/min，吹掃流量3 mL/min，分流比50∶1，線速度為27.8 cm/s，DB-FFAP(15 m×0.32 mm×0.25 μm)填充柱，柱溫180 ℃，檢測溫度280 ℃，進樣口溫度250 ℃，進樣量2 μL。

1.4.3 瘤胃菌群多樣性

1)將-80 ℃下保存的瘤胃液樣品置于無菌操作臺，并放入冰水混合物中解凍后，根據Power Soil DNA Isolation Kit試劑盒說明書進行總DNA提取。

2)使用細菌V3～V4區域引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)、806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)進行PCR擴增。具體PCR反應體系及反應條件見表2。為避免試驗誤差，檢測的瘤胃液樣本均設3個重復，并將重復樣本的PCR擴增得到的產物混勻，進行凝膠電泳定量質檢。

表2 PCR反應體系及反應條件Table 2 PCR reaction system and reaction conditions

3)構建瘤胃細菌區系16S rRNA基因文庫，為目的DNA片段兩端加上特定的接頭序列。

4)基于Illumina平臺的Hiseq雙端測序，Illumina HiSeq測序得到的原始圖像數據文件，經堿基識別(base calling)分析轉化為原始測序序列(sequenced reads)，結果以FASTQ(fq)文件格式存儲，其中包含測序序列(reads)的序列信息以及其對應的測序質量信息。

5)根據PE reads之間的Overlap關系，將Hiseq測序得到的雙端序列數據拼接(merge)成1條序列Tags，同時對reads的質量和merge的效果進行質控過濾。主要有3個步驟：第1步，PE reads拼接，使用FLASH v1.2.7軟件，通過overlap對每個樣品的reads進行拼接，得到的拼接序列即原始Tags數據(raw Tags)；第2步，Tags過濾，使用Trimmomatic v0.33軟件，對拼接得到的raw Tag進行過濾，得到高質量的Tags數據(clean Tags)；第3步，去除嵌合體，使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數據(effective Tags)。質控過濾后，利用QIIME(version 1.8.0)軟件中UCLUST對Tags按照97%相似性水平進行聚類，得到每個樣品的操作分類單元(OTU)。通過OTU的代表序列與微生物參考數據庫比對，進行物種注釋，分析α-多樣性，利用R語言工具繪制稀釋性曲線和Venn圖。使用QIIME軟件進行β-多樣性分析，繪制主坐標分析(PCoA)圖。不同組差異性利用CAA和Heatmap圖進行分析。

1.5 數據分析

數據經Excel 2016進行初步整理后，采用SPSS 20.0統計軟件進行方差分析，組間比較采用Duncan氏法進行多重比較，并以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 飼喂青蒿提取物對奶牛瘤胃發酵參數的影響

由表3可知，與對照組相比，添加0.25%青蒿提取物，瘤胃液NH3-N和丙酸濃度顯著升高(P<0.05)，乙丙比顯著降低(P<0.05)，瘤胃液pH、總揮發性脂肪酸、乙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸濃度無顯著變化(P>0.05)；添加0.50%青蒿提取物，瘤胃液丙酸、異丁酸和戊酸濃度顯著升高(P<0.05)，乙丙比顯著降低(P<0.05)，瘤胃液pH、NH3-N、總揮發性脂肪酸、乙酸、異戊酸和丁酸濃度無顯著變化(P>0.05)；添加0.75%青蒿提取物，瘤胃液總揮發性脂肪酸、丙酸、丁酸和戊酸濃度顯著升高(P<0.05)，乙酸、異丁酸濃度和乙丙比顯著降低(P<0.05)，瘤胃液pH、異戊酸和NH3-N濃度無顯著變化(P>0.05)。

表3 青蒿提取物對奶牛瘤胃發酵參數的影響Table 3 Effect of Artemisia annua L.extract on rumen fermentation parameters of dairy cows

2.2 飼喂青蒿提取物對奶牛瘤胃微生物區系的影響

2.2.1 青蒿提取物對奶牛瘤胃細菌群落多樣性的影響

2.2.1.1 凝膠電泳分析

由凝膠電泳結果(圖1)可知，對24個瘤胃液樣品(根據飼喂青蒿提取物對奶牛瘤胃常規發酵參數的影響進行劑量篩選，最終以添加水平0.75%為試驗組進行高通量測序，共24個瘤胃液樣品)進行16S rRNA基因的V3～V4區進行PCR擴增，產物條帶正確清晰、濃度合適，質量滿足建庫要求。

M：標記；1～24：24個樣品；CK：以純水為空白。M:marker；1 to 24:24 samples；CK:pure water was used as blank.圖1 PCR擴增樣品瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified samples

2.2.1.2 細菌群落多樣性分析

基于16S rRNA基因測序數據，繪制瘤胃液菌群樣本的稀釋曲線和物種積累曲線，圖2中各樣本曲線均達到平臺期，說明測序數量已經足夠包含樣本中絕大部分微生物信息。由Coverage指數可知，各樣本的覆蓋率達到99%以上(表4)，故可以準確地反映瘤胃中微生物群落的種類和結構多樣性。本試驗測序以97%的相似性閾值將序列劃分為不同的OTU，在瘤胃液菌群中獲得969個有效OTU，對照組與試驗組(0.75%青蒿提取物組)共享969個OTU，對照組獨享0個OTU，試驗組獨享5個OTU。由表4可知，與對照組相比，添加0.75%青蒿提取物顯著提高了Ace指數和Chao1指數(P<0.05)，Shannon指數和Simpson指數無顯著變化(P>0.05)。

表4 瘤胃液細菌α-多樣性指數Table 4 Rumen bacterial alpha-diversity index

C：對照組；T：試驗組(0.75%青蒿提取物組)。下圖同。C:control group;T:experimental group (0.75% Artemisia annua L.extract group).The same as below.圖2 樣品稀釋曲線Fig.2 Sample dilution curve

圖3 OTU Venn圖Fig.3 OTU Venn diagram

2.2.2 青蒿提取物對瘤胃液菌群相對豐度的影響

分析瘤胃液菌群在門水平的組成比例及變化，檢測到14個菌門，其中不同組瘤胃液細菌區系中相對豐度在0.01%以上的門均有10個。由表5和圖4可知，在門水平上，不同組奶牛瘤胃液細菌區系的優勢菌群一致，但在2組間相對豐度不同，相對豐度在1%以上的菌門均有4個，分別為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和SR_[Absconditabacteria]。其在試驗組中的相對豐度分別為52.37%、32.94%、10.48%、1.38%，在對照組中的相對豐度分別為56.12%、31.22%、6.91%、2.30%。泌乳期荷斯坦奶牛瘤胃液的優勢菌門主要有擬桿菌門、厚壁菌門。對照組中擬桿菌門、厚壁菌門的相對豐度分別為56.12%、31.22%，試驗組中擬桿菌門、厚壁菌門的相對豐度分別為52.37%、32.94%。與對照組相比，試驗組擬桿菌門相對豐度顯著下降3.7%(P<0.05)，厚壁菌門相對豐度上升1.72%(P>0.05)，變形菌門相對豐度顯著上升3.57%(P<0.05)，SR_[Absconditabacteria]相對豐度顯著下降0.92%(P<0.05)，疣微菌門相對豐度顯著下降0.26%，其他菌門相對豐度無顯著變化(P>0.05)。

圖4 門水平上青蒿提取物對奶牛瘤胃液細菌區系組成的影響Fig.4 Effects of Artemisia annua L.extract on bacterial flora composition in rumen fluid of dairy cows at phylum level

表5 青蒿提取物對瘤胃菌群相對豐度的影響(門水平)Table 5 Effects of Artemisia annua L.extracts on relative abundance of rumen microflora (phylum level) %

分析2組瘤胃液菌群在屬水平的組成和變化，共檢測到相對豐度大于0.01%的屬共有128個。由表6和圖5可知，在屬水平上，不同組奶牛瘤胃液細菌區系的優勢菌群一致，但在2組間相對豐度不同，主要的屬有10個(大于1%)分別為普雷沃氏菌屬1、uncultured_rumen_bacterium、琥珀酸弧菌科UCG-002、理研菌科RC9群、丁酸弧菌屬2、月形單胞菌屬1、解琥珀酸菌科、瘤胃球菌科NK4A214群、瘤胃球菌屬2、克里斯滕森菌科R-7。與對照組相比，試驗組普雷沃氏菌屬1、理研菌科RC9群和解琥珀酸菌屬相對豐度顯著提高(P<0.05)，丁酸弧菌屬2、瘤胃球菌科NK4A214群和瘤胃球菌屬2相對豐度顯著下降(P>0.05)。

表6 青蒿提取物對瘤胃菌群相對豐度的影響(屬水平)Table 6 Effects of Artemisia annua L.extract on relative abundance of rumen microflora (genus level) %

2.2.3 青蒿提取物對奶牛瘤胃液細菌組成影響相似性分析

通過β-多樣性分析，評估2組之間菌群結構的差異性。圖6為基于非加權距離算法的PCoA，坐標軸1和坐標軸2分別占總變異量的50.07%和14.21%。ANOSIM的R值為0.57，說明對照組與試驗組之間的菌群結構存在顯著差異(P<0.05)。

圖6 PCoA聚類分析Fig.6 PCoA cluster analysis

2.2.4 青蒿提取物對奶牛瘤胃細菌組成與發酵參數的相關性分析

圖7展示了奶牛瘤胃細菌屬水平相對豐度(排名前15的菌屬)與發酵參數的相關關系。其中琥珀酸弧菌科UCG-002相對豐度與乙酸(R=0.655，P<0.01)、總揮發性脂肪酸(R=0.627，P<0.01)和丙酸(R=0.508，P<0.01)濃度呈極顯著正相關；瘤胃球菌科UCG-014相對豐度與總揮發性脂肪酸濃度呈顯著負相關(R=-0.345，P<0.05)，與丁酸濃度呈極顯著負相關(R=-0.415，P<0.01)，與產奶量呈顯著正相關(R=0.504，P<0.05)；瘤胃球菌屬1相對豐度與乙酸濃度呈顯著負相關(R=-0.433，P<0.05)，與總揮發性脂肪酸(R=-0.345，P<0.05)、丙酸(R=-0.120，P<0.05)濃度呈顯著負相關，與產奶量呈顯著正相關(R=0.504，P<0.05)；普雷沃氏菌科1與乙酸(R=-0.896，P<0.01)、總揮發性脂肪酸(R=-0.585，P<0.01)、NH3-N(R=-0.656，P<0.01)和戊酸(R=-0.449，P<0.01)濃度呈極顯著負相關，與乙丙比呈顯著負相關(R=-0.193，P<0.05)；普雷沃氏菌科UCG-001相對豐度與乙酸濃度呈極顯著負相關(R=-0.789，P<0.01)，與總揮發性脂肪酸(R=0.480，P<0.05)和異戊酸濃度(R=0.338，P<0.05)呈顯著負相關；理研菌科RC9群相對豐度與乙酸(R=-0.531，P<0.01)和總揮發性脂肪酸(R=-0.448，P<0.01)濃度呈極顯著負相關，與NH3-N(R=-0.372，P<0.05)和丙酸(R=-0.423，P<0.05)濃度呈顯著負相關；琥珀酸菌屬相對豐度與乙酸濃度呈極顯著負相關(R=-0.486，P<0.01)；毛螺菌科NK3A20群相對豐度與乙酸濃度呈顯著負相關(R=-0.462，P<0.05)；瘤胃球菌科NK4A214群相對豐度與丙酸濃度呈顯著負相關(R=-0.368，P<0.05)。

3 討 論

3.1 飼喂青蒿提取物對奶牛瘤胃發酵參數的影響

瘤胃液pH是反映瘤胃健康的直接指標，其與飼糧組成和添加劑類型的關聯密切，反映瘤胃內各種有機酸和代謝物產生與吸收的情況[15]。奶牛瘤胃液正常pH在5.5～6.8[16]，本試驗中各組瘤胃液pH均處于正常生理范圍內，這與蘇漢書等[12]在奶牛瘤胃體外發酵的研究結果一致。此外，在山羊的基礎飼糧中添加青蒿提取物，發現青蒿提取物對山羊瘤胃液pH無顯著影響[17]，這也印證了奶牛飼糧中添加青蒿提取物不會改變瘤胃內的酸堿平衡。

瘤胃中NH3-N是微生物菌體蛋白(MCP)合成的原料，是反映瘤胃微生物生長情況的指標，NH3-N濃度在10～50 mg/dL最適宜瘤胃微生物生長[18]。本試驗中，瘤胃中NH3-N濃度在此范圍內，并且在青蒿提取物0.25%和0.50%的添加水平下NH3-N濃度相對于對照組顯著提高，而在0.75%的添加水平下無顯著變化，說明青蒿提取物在一定程度上可以促進瘤胃NH3-N的合成，這與秦韜等[19]的研究結果一致。瘤胃內NH3-N濃度與MCP的含量密切相關，可以推測青蒿提取物能提高瘤胃微生物的活性，促進蛋白分解菌的生長，進而促進MCP和NH3-N的生成。

瘤胃內碳水化合物發酵后生成VFA，其主要包括丙酸、丁酸、乙酸、異丁酸、戊酸、異戊酸等，均是奶牛主要的能量來源[20]，乙酸、丙酸和丁酸約占總揮發性脂肪酸濃度95%以上，乙酸是反芻動物合成脂肪的前體，是動物合成乳脂的主要成分，丁酸也可作為乳腺和脂肪組織合成脂肪酸的原料，丙酸經肝臟糖原異生作用生成葡萄糖為機體供能，丙酸比例越高，其可為機體提供的能量就越高[21]。有研究報道，在反芻動物飼糧中添加青蒿提取物可以提高瘤胃內乙酸、丙酸、丁酸和總揮發性脂肪酸濃度[22]，在本試驗中，添加0.75%的青蒿提取物顯著降低了瘤胃內乙酸濃度和乙丙比，總揮發性脂肪酸、丙酸和丁酸濃度顯著增加，這與王小晶等[23]的研究結果一致。這說明在奶牛飼糧中添加青蒿提取物可以促進瘤胃發酵，改變瘤胃內VFA的比例。

3.2 飼喂青蒿提取物對奶牛瘤胃微生物區系的影響

研究表明，當樣本覆蓋率達到97%以上時，說明測序樣本取樣充分[24]，本試驗中樣本覆蓋率高于99%，證明本次測序結果能夠真實地反映奶牛瘤胃微生物種類和結構多樣性。報道指出，奶牛瘤胃微生物區系的種類和數量與奶牛種類、飼糧及添加劑種類有關[3]。研究表明，采用ITS高通量測序和16S rRNA高通量測序對瘤胃微生物進行分析能得到612～1 797個OTU[25-26]，本試驗測得試驗奶牛瘤胃微生物區系共969個，處于兩者之間，這說明添加青蒿提取物改變了奶牛的瘤胃細菌區系的種類和數量，試驗中2組共有964個OTU，青蒿提取物組獨有5個OTU。Shannon指數和Simpson指數反映瘤胃微生物區系的多樣性，Shannon指數越大或Simpson指數越小時微生物區系越高；Ace指數和Chao1指數反映瘤胃微生物區系的豐富度，Ace指數和Chao1指數越大，微生物區系越豐富[27]。本試驗中Shannon指數和Simpson指數無顯著變化，Ace指數和Chao1指數顯著提高，說明青蒿提取物不影響瘤胃微生物的多樣性，但會增加其豐富度。

奶牛瘤胃微生物中優勢菌門為擬桿菌門和厚壁菌門[28-29]，本試驗中奶牛瘤胃優勢菌門也為擬桿菌門和厚壁菌門。飼糧中的非纖維性碳水化合物主要依靠擬桿菌門細菌降解[30]，而纖維降解主要依靠厚壁菌門細菌[31]，如溶纖維丁酸弧菌和解纖維梭菌等。Zened等[32]研究發現，奶牛瘤胃內細菌的優勢菌門不會因飼糧改變而改變，始終為擬桿菌門和厚壁菌門。本試驗中，添加青蒿提取物后擬桿菌門相對豐度顯著下降，厚壁菌門相對豐度無顯著變化，說明青蒿提取物抑制了擬桿菌門微生物的生長與增殖。研究表明，變形菌門可降解可溶性碳水化合物[33]，本試驗添加青蒿提取物后變形菌門相對豐度顯著增加，說明青蒿提取物能促進奶牛瘤胃可溶性碳水化合物的降解，這也解釋了總揮發性脂肪酸濃度顯著升高的原因。SR_[Absconditabacteria]和疣微菌門相對豐度與哺乳動物胃腸道免疫有顯著關系[34-35]，本試驗中SR_[Absconditabacteria]和疣微菌門相對豐度在添加青蒿提取物后顯著下降，這表明在飼糧中添加青蒿提取物可能與增強機體免疫力有關，這也印證了前期本試驗中青蒿提取物可以提高奶牛免疫能力的試驗結果。

每2個變量之間的相關強度用顏色和*表示，紅色表示正相關，藍色表示負相關，*表示0.01

在屬水平上，奶牛瘤胃內微生物優勢菌屬為普雷沃氏菌屬、琥珀酸菌屬和理研菌屬[36-37]，這與本研究結果一致，普雷沃氏菌屬于擬桿菌門，在瘤胃中分布廣泛，數量多，包括半纖維素分解菌和蛋白分解菌，如棲瘤胃普雷沃菌、布氏普雷沃氏菌和短普雷沃氏菌等，其可降解植物性半纖維素、蛋白質、非纖維多糖、參與多種微生物代謝[38]，本試驗添加青蒿提取物后，奶牛瘤胃液中普雷沃氏菌屬相對豐度顯著提高，說明添加青蒿提取物在一定程度上促進了奶牛瘤胃內蛋白質的分解利用，影響瘤胃內NH3-N和總揮發性脂肪酸濃度，這與瘤胃發酵常規指標的結果相一致。理研菌科與自身免疫有關[39]，本試驗中添加青蒿提取物后瘤胃液中理研菌科RC9群相對豐度顯著增加，這可能與青蒿提取物改變奶牛免疫性能有關。丁酸弧菌屬也是瘤胃中分解利用纖維素的菌屬[40]，飼喂青蒿提取物后瘤胃液中丁酸弧菌屬2相對豐度顯著下降可能是由于其他降解纖維素菌的增加，導致丁酸弧菌屬2的競爭優勢降低，進而比例下降。解琥珀酸菌屬可以將瘤胃微生物分解碳水化合物后產生的琥珀酸代謝成丙酸鹽，進而生成丙酸[41]，添加青蒿提取物后瘤胃液中解琥珀酸菌屬相對豐度顯著上升，這可能是導致瘤胃液中丙酸濃度顯著上升的主要原因。瘤胃球菌屬在瘤胃中可以降解粗飼料中的纖維素、半纖維素和木質素，產生大量的纖維素酶和木聚糖酶，通過酶作用生成乙酸[42]。添加青蒿提取物后瘤胃球菌科NK4A214群和瘤胃球菌屬2相對豐度顯著下降，導致瘤胃液中乙酸濃度下降，這與前人研究結果[27]相同。本試驗發現，普雷沃氏菌屬1和理研菌科RC9群相對豐度與總揮發性脂肪酸濃度呈極顯著負相關，說明這2種菌可能參與總揮發性脂肪酸的代謝，這與程冠文[43]研究結果相一致。同時，瘤胃球菌屬1、普雷沃氏菌屬1、普雷沃氏菌科UCG-001、理研菌科RC9群和琥珀酸菌屬相對豐度與乙酸濃度呈負相關，這些菌屬促進了乙酸的代謝，影響了乙丙比，這也揭示了本研究中瘤胃液中乙酸濃度顯著降低的原因。瘤胃球菌科UCG-014和瘤胃球菌屬1與調節機體免疫有關[44-45]，在本試驗中2種菌屬相對豐度與產奶量呈顯著正相關，表明這2種菌屬可能通過調節機體免疫力以促進奶牛產奶。綜上可知，青蒿提取物可以通過改善瘤胃微生物相對豐度，調節瘤胃發酵，進而提高奶牛機體免疫能力和產奶量。

4 結 論

在奶牛飼糧中添加0.75%青蒿提取物顯著提高Ace指數和Chao1指數，使變形菌門、普雷沃氏菌屬1、理研菌科RC9群等相對豐度顯著提高，擬桿菌門、丁酸弧菌屬2等相對豐度顯著降低；降低瘤胃中乙酸濃度和乙丙比，提高總揮發性脂肪酸、丙酸、丁酸和戊酸濃度，對瘤胃發酵和微生物結構變化有積極作用。

Prevotella1：普雷沃氏菌屬1；Uncultured rumen_bacterium：未分類瘤胃細菌；Succinivibrionaceae_UCG-002：琥珀酸球菌科UCG-002；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9群；Succiniclasticum：解琥珀酸菌屬；Selenomonas1：月形單胞菌屬1；Butyrivibrio2：丁酸弧菌屬2；Ruminococcus2：瘤胃球菌屬2；Christensenellaceac_R-7_group：克里斯滕森菌科R-7群；Ruminococcaceae_NK4A214_group：瘤胃球菌科NK4A214群；Others：其他；Unclassified：未分類。
圖5 屬水平上青蒿提取物對奶牛瘤胃液細菌區系組成的影響
Fig.5 Effects ofArtemisiaannuaL.extract on bacterial flora composition in rumen fluid of dairy cows at genus level

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