新生荷斯坦犢牛后腸道微生物母源傳遞特征的研究

楊敏娜 朱 煥 高偉星 曲永利

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163000)

對人類與嚙齒類動物腸道早期定植菌群結構和來源的分析顯示，哺乳動物腸道微生物的早期定植具有很強的母源特征，母代來源的微生物在子代腸道菌群形成過程中發揮了重要作用[1]。腸道微生物在早期發育過程中對天然免疫系統的成熟具有重要影響[2]。此外，胃腸道微生物區系具有重要的代謝和營養作用[3]，并且影響動物的健康和生產性能，對動物的整體福利有很大的影響[4-5]。

然而，哺乳動物新生兒腸道微生物的起源仍然存在爭議。有研究報道在妊娠期母體不同部位均發現了微生物區系，包括羊水、臍帶血、子宮內膜、胎膜[6-9]等部位，對應的嬰兒胎糞中也發現微生物的存在[10]。Quercia等[11]的研究結果表明，從胎兒時期起，母馬不同部位的微生物群落在馬駒腸道中進行了定植。Ferretti等[12]通過菌株分析也表明某些菌株可能從母代垂直傳遞到子代并進行定植。以上這些研究說明了在妊娠期間，母體各個部位的微生物可能通過某種內源途徑傳遞給子代。目前有關子代微生物母源傳遞的研究絕大部分是關于人的，奶牛相關研究的報道很少。本試驗利用16S rDNA擴增子測序技術，結合SourceTracker方法，對母牛糞便、初乳、胎盤、羊水、臍帶和胎糞的微生物區系進行分析，探討母牛不同部位的微生物來源對犢牛后腸道微生物區系的影響，深入了解母牛微生物對犢牛腸道定植的作用，將有助于設計對早期犢牛腸道微生物群落結構干預的策略，為改善犢牛健康狀況，特別是在免疫系統發育方面奠定科學的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗在黑龍江省某荷斯坦奶牛場進行，選取15頭健康且預產期相近的經產奶牛(2胎)進行試驗。試驗期內所有的母牛均在同一牛舍內飼養，并在預產期前1周左右集體轉移至產房。所有妊娠期的奶牛均在農場工人的監督下產犢。按照試驗采樣標準要求，最終選取6對荷斯坦母牛及其所生犢牛的樣品進行研究。所有樣品均由同一名經驗豐富的獸醫取樣。

1.2 樣品采集

母牛分娩后立即對所有樣品進行采集。胎盤與臍帶取樣：采用無菌設備對胎盤(臍帶)快速處理，從胎盤(臍帶)內部切取樣本，盡量減少環境中微生物污染的可能性。羊水取樣：當羊水囊清晰可見時，使用無菌手套和20 mL無菌注射器，用70%乙醇拭子擦拭胎膜后，采用穿刺法取出至少10 mL羊水。糞便取樣：用無菌手術手套對母牛和尚未被飼喂初乳的新生犢牛進行直腸取樣。初乳取樣：在分娩后，立即在犢牛第1次哺乳前，乳房用肥皂水消毒后，隨后用無菌生理鹽水進行擦洗，通過棄去頭幾滴乳汁來沖洗乳腺導管，收集5 mL的乳汁于無菌管中。所有樣品均放于無菌管中，分裝編號后迅速投入液氮中保存備用。

1.3 DNA提取

所有工作都在嚴格控制、分離和無菌的工作場所進行。采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)方法對樣本的基因組DNA進行提取，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，將離心管中適量的樣本DNA用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。

1.4 PCR擴增和產物的混樣和純化

以稀釋后的基因組DNA為模板，通過使用帶Barcode的特異引物和高效高保真酶對測序區域進行PCR。用2%濃度的瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳檢測，并用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產物。

1.5 文庫構建和高通量測序

1.6 數據分析

數據下機后，從中拆分出各樣本數據，通過使用FLASH[13]對每個截去Barcode和引物序列的樣本reads進行拼接得到原始Tags數據；利用Qiime 1.9.1軟件[14]對Tags進行質控，使用物種注釋數據庫對Tags序列[15]進行比對檢測，并去除其中的嵌合體序列，得到有效數據。利用Uparse 7.0.1001軟件[16]將所有序列以97%的一致性聚類成為操作分類單元(OTU)，用Mothur方法與SILVA132[17]的SSUrRNA數據庫[18]對OTU分析中出現頻數最高的代表序列從門到屬進行物種注釋(設定閾值為0.81)。

為了評估測序深度和生物多樣性豐富度，建立了所有樣品的稀疏曲線。通過R 3.0.3軟件中的VennDiagram包繪制花瓣圖。計算樣品間Shannon指數和Chao1指數，并用wilcox秩和檢驗進行差異顯著性分析，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著?；赨nweighted Unifrac距離來進行主坐標分析(PCoA)，評價不同樣本類型之間微生物區系的結構差異[19]。本研究通過R 3.4.1軟件中的SourceTracker包分析母牛不同部位微生物來源對犢牛胎糞中微生物的相對貢獻度。結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 特異性OTU

從胎盤、臍帶、羊水、母牛糞便、胎糞和初乳等6類36個樣品中產生了3 447 210條原始讀碼。將有效數據以97%的一致性進行OTU聚類。圖1為所有樣本類型的花瓣圖，其中羊水的特異性OTU最多(801個)，其次是初乳(641個)、胎盤(630個)、胎糞(343個)、臍帶(266個)、母牛糞便(97個)，所有組共享916個OTU。

T：胎盤；Q：臍帶；Y：羊水；C：初乳；M：母牛糞便；D：胎糞。下圖同。T:placenta;Q:umbilical cord;Y:amniotic fluid;C:colostrum;M:cow feces;D:meconium.The same as below.圖1 OTU花瓣圖Fig.1 OTU petals diagram

2.2 母子不同類型樣本微生物區系的α多樣性

Shannon多樣性指數曲線趨于平穩(圖2)，表明本試驗的測序深度足以捕捉具有代表性的微生物多樣性。在取樣深度為424 824時，用wilcox秩和檢驗對Shannon指數和Chao1指數進行差異顯著性分析(表1)。Shannon指數差異顯著性分析表明，除胎糞和羊水、胎糞和胎盤組間差異顯著(P<0.05)外，其余樣本類型間差異均不顯著(P>0.05)。Chao1指數差異顯著性分析表明，胎糞除了和母牛糞便差異不顯著(P>0.05)外，和其余母牛樣本類型差異均顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)；胎糞和初乳、胎盤、臍帶樣本類型間差異顯著(P<0.05)，胎糞和羊水間差異極顯著(P<0.01)；母牛糞便和其他母體樣本類型差異極顯著(P<0.01)；其余樣本類型間差異均不顯著(P>0.05)。

圖2 Shannon多樣性指數稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of Shannon diversity index

表1 不同樣本類型的α多樣性分析Table 1 α diversity analysis of different sample types

2.3 母子不同類型樣本微生物區系的組成特征

將本試驗所得有效序列在門和屬水平上進行物種注釋和統計(圖3和圖4)，結果表明，在門水平上，羊水、初乳、臍帶和和胎糞的主要優勢菌門相同，為變形菌門(Proteobacteria)，次要優勢菌門也相同，為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)。胎盤的主要優勢菌門為Proteobacteria和Firmicutes，Bacteroidetes和Actinobacteria是胎盤的次要優勢菌門。母牛糞便主要是由Firmicutes和Bacteroidetes組成。在屬水平上，假單胞菌屬(Pseudomonas)是羊水、初乳、胎盤和臍帶中相對豐度最高的優勢菌屬，但在母牛糞便和胎糞中是第2優勢菌屬。Limnobacter和短波單胞菌屬(Brevundimonas)是羊水、初乳和胎盤中的次要優勢菌屬，臍帶、母牛糞便和胎糞中也含有這些菌屬，但是這些菌屬的相對豐度都很低。在母牛糞便中，所有物種的相對豐度都很低，不動桿菌屬(Acinetobacter)是相對豐度最高的菌屬。嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)是胎糞中相對豐度最高的菌屬。

圖3 門水平上的物種相對豐度Fig.3 Relative abundances of species at phylum level

圖4 屬水平上的物種相對豐度Fig.4 Relative abundances of species at genus level

2.4 母子不同類型樣本微生物區系的β多樣性特征分析

利用基于Unweighted Unifrac距離來進行PCoA的方法，評價胎糞與母體樣本微生物區系結構的特征差異(圖5)。母牛糞便的個體聚集程度最高，表明母牛糞便的組內相似度比其他樣本類型都高。母牛糞便和胎糞都不與其他母體樣本類型位置相似，表明母體糞便和胎糞都有獨特的微生物區系。羊水和初乳、胎盤和臍帶的位置相似，表明羊水和初乳、胎盤和臍帶微生物區系結構相似。

圖5 PCoA聚類分析Fig.5 Cluster analysis by PCoA

2.5 用SourceTracker預測胎糞微生物的母體來源

利用基于貝葉斯方法的SourceTracker分析估計母體不同部位潛在的微生物來源對新生犢牛胎糞中微生物貢獻的比例。SourceTracker分析結果表明，母牛的胎盤、臍帶、羊水、初乳和糞便中的微生物均對新生犢牛胎糞菌群的定植有貢獻，按貢獻比例由高到低依次為臍帶(23.45%)、胎盤(16.35%)、初乳(14.29%)、羊水(11.45%)、母牛糞便(9.93%)。其胎糞群落主要由來自臍帶的微生物組成；未知來源微生物貢獻占24.53%(圖6)。

圖6 SourceTracker分析不同微生物來源對犢牛胎糞微生物的貢獻度Fig.6 SourceTracker analysis of potential microbial sources of meconium microbiota of calves

3 討 論

為了盡量減少污染微生物樣本的機會，在犢牛出生后立即對母牛糞便、初乳、羊水、胎盤、臍帶和胎糞樣本進行無菌采集。與以往收集新生犢牛出生后幾天糞便樣本的研究不同，本研究分析的是胎糞樣本，其代表犢牛出生時的腸道內容物，不受飲食等環境影響[20]。在此研究中，6種樣本類型都檢測到了微生物群，α多樣性的顯著性差異分析表明，犢牛胎糞除了和羊水、胎盤間微生物群落多樣性差異顯著外，和其余母體樣本類型間微生物群落多樣性差異均不顯著；胎糞除了和母牛糞便間微生物群落豐富度差異不顯著外，和其余母牛樣本類型微生物豐富度差異均顯著或極顯著。從β多樣性分析可以看出每種樣本類型的微生物區系都表現出不同的特征。此外，在所有樣本類型中均發現了只出現于某一樣本類型的特異性OTU。胎糞中有343個特異性OTU，這些OTU并非來自本研究中的母體部位，很有可能來自于其他未被研究的母體部位。胎盤、臍帶和羊水的第3優勢菌門均是Bacteroidetes，此菌門也是Moore等[21]研究中青年母牛子宮內優勢菌門之一。在初乳中發現了相對豐度較小的Halomonas,其不僅是鹿乳汁微生物的優勢微生物之一，也是奶酪表面的優勢微生物，其可能與乳汁中其他微生物產生互作，并且受到乳汁環境的影響[22]。本研究發現胎盤和胎糞中均存在乳桿菌屬(Lactobacillus)。Satokari等[23]也在胎盤及胎糞中發現乳桿菌屬(Lactobacillus)，說明在妊娠期間母體的羊水、臍帶血、胃腸道等可能通過某種內源途徑將自身菌群垂直傳遞給子代。SourceTracker分析表明母牛的糞便、胎盤、臍帶、羊水和初乳中的微生物均是犢牛胎糞菌群的主要來源，其中臍帶微生物對犢牛胎糞微生物定植的貢獻最大。產生這種結果的原因可能是由于產前母代和子代的主要聯系是臍帶，所以其不僅是母代和子代之間進行代謝廢物和營養物質交換的通道，而且有可能是母代和子代之間進行微生物傳遞的主要途徑。羊水中的微生物可能是通過子代吞咽羊水的過程進入子代腸道并進行定植，最終成為胎糞生態系統的一部分。這一結果和He等[24]發現羊水是胎糞菌群主要來源的結論一致。以上研究表明胎糞微生物區系可能來自于多個母體部位[11-12,24]，具有強烈的母源特征，但母體不同部位間微生物的傳遞途徑仍不清楚。本研究發現犢牛胎糞中未知來源微生物(24.53%)貢獻占比較高，但由于本研究母體樣本類型的局限性，需要進一步研究來確定未知來源微生物的母體來源。

傳統觀點認為新生犢牛腸道微生物的最初定植來源于出生后2 d內初乳或其他外界環境中的微生物。但本試驗數據表明，胎糞菌群是在胎兒生命期間已經定植。初乳中的微生物可能是通過某種途徑到達胎兒腸道，而不是在犢牛出生后通過吮吸乳汁的方式直接對胎糞微生物區系產生影響，其更有可能的原因是胎糞和初乳微生物有共同的母體來源。這一觀點與上述不同母體部位的菌群通過某種傳遞途徑進入子代腸道進行定植的觀點一致，但具體途徑也有待進一步研究。

4 結 論

在本研究中，圍產期母牛胎盤、臍帶、羊水、初乳和糞便中的微生物均是犢牛腸道微生物的主要來源，其中臍帶微生物對胎糞微生物的定植貢獻最大；犢牛胎糞中還有許多未知來源且相對貢獻度(24.53%)較高的微生物，其母體來源有待深入研究。