體外產(chǎn)氣法比較不同活力屎腸球菌對綿羊瘤胃體外發(fā)酵的影響

白天天 崔浩然 蔣辰宇 周小玲，2 郭雪峰，2*

(1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué)，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，阿拉爾 843300)

屎腸球菌(Enterococcusfaecium)為自然界常見的乳酸菌，具有耐高溫、黏附力強(qiáng)、耐胃酸和耐膽鹽等特點(diǎn)[1-2]，由于其在生產(chǎn)加工上的獨(dú)特優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)[3]。當(dāng)前，屎腸球菌包含在《飼料添加劑品種目錄(2013)》中，被允許在飼料中使用，其特有的安全無毒、無藥殘的特點(diǎn)，使其在飼料應(yīng)用方面發(fā)展迅速。屎腸球菌在單胃動物上有大量研究，添加菌株后發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)斷奶仔豬腸道發(fā)育、增強(qiáng)腸道[4]和提高肉仔雞血清免疫球蛋白G(IgG)含量的作用[5]；促進(jìn)肉雞脂類和蛋白質(zhì)的合成代謝[6]；提高感染致病菌的家禽免疫力，調(diào)整患病肉雞腸道菌群，減緩鼠傷寒沙門菌對肉雞的損傷[7]。屎腸球菌在反芻動物上的研究包括：減少牦牛腸道內(nèi)毒素含量與尿素酶活性[8]；提高犢牛平均日增重和料重比，提高泌乳中、后期奶牛瘤胃氨態(tài)氮(NH3-N)濃度[9]，降低腹瀉率與死亡率，維持腸道微生物平衡[10]。乳酸菌具有產(chǎn)生乳酸的能力[11]，反芻動物酸中毒與乳酸的產(chǎn)生積累有關(guān)[12]，而添加不同活力的屎腸球菌是否對瘤胃產(chǎn)生影響的研究還未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)研究不同活力的屎腸球菌對綿羊瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響，為屎腸球菌在綿羊上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

屎腸球菌F11.1G為塔里木大學(xué)畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選菌株，于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏(保藏號：M 2020793)。乳酸菌培養(yǎng)使用MRS培養(yǎng)基，pH為6.8[13]。

1.2 試驗(yàn)動物及飼糧

瘤胃液采集的試驗(yàn)動物是3只體重為(35±3)kg、安裝瘺管的卡拉庫爾羊。每日09:00和20:00分2次定量飼喂，自由飲水。依據(jù)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》配制基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧以玉米和苜蓿顆粒為主要原料，其組成及營養(yǎng)水平見表1，精粗比為60∶40。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共有4個(gè)組，分別為對照組、試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組，各組分別添加0、1×1012、1×1011和1×1010CFU/mL的屎腸球菌，基礎(chǔ)飼糧粉碎過40目作為發(fā)酵底物，每個(gè)組6個(gè)重復(fù)，共24個(gè)注射器，在3、6、12、24、36和48 h讀取產(chǎn)氣量，在24和48 h時(shí)進(jìn)行干物質(zhì)降解率、pH和NH3-N、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度的測定。

1.4 人工瘤胃培養(yǎng)液配制

緩沖液采用Menke等[14]方法制備并通入二氧化碳至無色，然后置水浴鍋中保溫備用，晨飼前2 h采集瘤胃液，經(jīng)4層紗布過濾后與緩沖液以1∶2比例均勻混合制成培養(yǎng)液。

1.5 體外發(fā)酵培養(yǎng)及樣品的處理

準(zhǔn)確稱取0.2 g發(fā)酵底物和屎腸球菌發(fā)酵液，置于玻璃注射器(規(guī)格為100 mL，可讀刻度為1 mL)頂端，并設(shè)置3個(gè)重復(fù)。在39 ℃恒溫?cái)?shù)顯水浴搖床中振蕩培養(yǎng)，吸取30 mL培養(yǎng)液并密封的注射器。在3、6、12、24、36和48 h讀取產(chǎn)氣量，測定24和48 h培養(yǎng)液的pH，離心后取上清液用于NH3-N和VFA濃度測定。

1.6 指標(biāo)測定

屎腸球菌活力：參照郭雪峰等[15]方法進(jìn)行檢測；總產(chǎn)氣量：讀取注射器上的刻度進(jìn)行測定；pH：通過希瑪牌便攜式pH測試筆測定；VFA濃度：參照丁學(xué)智等[16]方法，采用GC-2014氣相色譜儀測定；干物質(zhì)降解率：采用趙超等[17]方法進(jìn)行測定；NH3-N濃度：采用馮宗慈等[18]方法進(jìn)行測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件的one-way ANOVA進(jìn)行方差分析，差異顯著采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同活力屎腸球菌對體外產(chǎn)氣量的影響

由表2可知，各組產(chǎn)氣量在發(fā)酵初期增長迅速，呈上升趨勢，各組產(chǎn)氣量顯著高于對照組(P<0.05)，試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組差異不顯著(P>0.05)，在發(fā)酵3～12 h時(shí)，試驗(yàn)3組的產(chǎn)氣量顯著高于試驗(yàn)1組(P<0.05)，在發(fā)酵24 h時(shí)，各試驗(yàn)組產(chǎn)氣量差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同活力屎腸球菌對體外產(chǎn)氣量的影響Table 2 Effects of different activities of Enterococcus faecium on gas production in vitro

2.2 添加不同活力屎腸球菌對培養(yǎng)液pH的影響

由表3可知，各組pH在整個(gè)發(fā)酵過程中均呈逐漸下降的趨勢。在發(fā)酵24和48 h時(shí)，各組pH顯著低于對照組(P<0.05)，試驗(yàn)3組的pH為最低，各組之間差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)3組在發(fā)酵48 h時(shí)pH最低，為6.35。

表3 不同活力屎腸球菌對培養(yǎng)液pH的影響Table 3 Effects of different activities of Enterococcus faecium on pH of rumen fluid

2.3 添加不同活力屎腸球菌對干物質(zhì)降解率的影響

由表4可知，各試驗(yàn)組隨著發(fā)酵時(shí)間的增長，各組干物質(zhì)降解率均顯著高于對照組(P<0.05)，各組之間差異顯著(P<0.05)。在發(fā)酵24 h時(shí)，試驗(yàn)3組的干物質(zhì)降解率顯著高于對照組、試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組(P<0.05)。在發(fā)酵48 h時(shí)，試驗(yàn)3組的干物質(zhì)降解率顯著高于對照組、試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組(P<0.05)。

表4 不同活力屎腸球菌對干物質(zhì)降解率的影響Table 4 Effects of different activities of Enterococcus faecium on degradation rate of dry matter %

2.4 添加不同活力屎腸球菌對培養(yǎng)液NH3-N濃度的影響

由表5可知，在試驗(yàn)開始初期，各組NH3-N濃度呈上升趨勢，在發(fā)酵24 h時(shí)，試驗(yàn)3組的NH3-N濃度顯著高于對照組(P<0.05)，但與試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組差異不顯著(P>0.05)，此時(shí)對照組NH3-N濃度是11.67 mg/dL，為最低；在發(fā)酵48 h時(shí)，各組的NH3-N濃度與對照組相比，差異不顯著(P>0.05)，試驗(yàn)3組的NH3-N濃度最高，為27.18 mg/dL。

表5 不同活力屎腸球菌對培養(yǎng)液NH3-N濃度的影響Table 5 Effects of different activities of Enterococcus faecium on concentration of NH3-N in rumen fluid mg/dL

2.5 添加不同活力屎腸球菌對培養(yǎng)液VFA濃度的影響

由表6可知，在發(fā)酵24 h時(shí)，試驗(yàn)2組的乙酸濃度顯著高于其他各組(P<0.05)，但與對照組差異不顯著(P>0.05)，在發(fā)酵48 h時(shí)，試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組的乙酸濃度顯著高于其他組(P<0.05)；在發(fā)酵24 h時(shí)，試驗(yàn)組1的丙酸含量顯著高于對照組和其他各組(P<0.05)，在發(fā)酵48 h時(shí)，試驗(yàn)2組丙酸濃度最高，試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組顯著高于對照組(P<0.05)；在發(fā)酵24 h時(shí)，對照組的丁酸濃度最低，試驗(yàn)2組的丁酸濃度顯著高于對照組和試驗(yàn)組3(P<0.05)，在發(fā)酵48 h時(shí)，試驗(yàn)1組的丁酸濃度顯著高于其他各組(P<0.05)，但與對照組差異不顯著(P>0.05)；在發(fā)酵24 h時(shí)，試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組的總VFA濃度顯著高于對照組(P<0.05)，在發(fā)酵48 h時(shí)，試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組的總VFA濃度顯著高于對照組(P<0.05)；發(fā)酵24 h時(shí)的試驗(yàn)2組和發(fā)酵48 h時(shí)的試驗(yàn)3組的乙酸/丙酸均高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。

表6 不同活力屎腸球菌對培養(yǎng)液VFA濃度的影響Table 6 Effects of different activities of Enterococcus faecium on concentration of VFA in rumen fluid

3 討 論

3.1 不同活力屎腸球菌對培養(yǎng)液產(chǎn)氣量的影響

瘤胃微生物消耗可溶性碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生氣體，主要是代謝產(chǎn)物，如氫氣、二氧化碳、甲烷、低級脂肪酸等[19]，一定程度上反映瘤胃微生物對發(fā)酵底物利用的程度。由本試驗(yàn)結(jié)果可見，添加屎腸球菌于瘤胃液體外發(fā)酵能顯著促進(jìn)底物發(fā)酵，添加屎腸球菌的各組產(chǎn)氣量顯著高于對照組，0～24 h的產(chǎn)氣量增加迅速，24～48 h時(shí)的產(chǎn)氣量呈緩慢上升狀態(tài)，其中添加了1×1010CFU/mL屎腸球菌對于體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響最為明顯。推測可能是屎腸球菌進(jìn)入瘤胃環(huán)境中迅速增殖，成為優(yōu)勢菌種，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化[20]，促進(jìn)產(chǎn)氣，而添加活力的大小會影響產(chǎn)氣的多少，但活力過高的屎腸球菌的進(jìn)入影響了瘤胃微生物的平衡，反而不利于瘤胃內(nèi)容物的消化。

3.2 不同活力屎腸球菌對培養(yǎng)液pH的影響

瘤胃pH正常范圍維持在6.0～7.5，與瘤胃內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用息息相關(guān)，pH的變化與反芻動物唾液分泌、瘤胃食糜外流速度、瘤胃發(fā)酵產(chǎn)酸以及瘤胃上皮對VFA的吸收有關(guān)[21-22]。本試驗(yàn)各組pH在整個(gè)發(fā)酵過程中呈下降趨勢，添加屎腸球菌可以顯著降低培養(yǎng)液pH，pH的降低可能與屎腸球菌發(fā)酵積累乳酸、乙酸等有關(guān)[23]，人們發(fā)現(xiàn)，瘤胃在pH降至5.0～5.5時(shí)，反芻動物常常出現(xiàn)亞臨床酸中毒，而當(dāng)pH低于5.0時(shí)，急性酸中毒則會發(fā)生[24]，在本試驗(yàn)中通過測定確定培養(yǎng)液pH為6.35～7.37，處于瘤胃發(fā)酵pH的正常范圍內(nèi)，此結(jié)果說明，添加1×1012、1×1011和1×1010CFU/mL的屎腸球菌，并不會影響瘤胃酸堿內(nèi)環(huán)境守恒。

3.3 不同活力屎腸球菌對培養(yǎng)液干物質(zhì)降解率的影響

干物質(zhì)降解率的高低，反映了飼料綜合營養(yǎng)素的可消化特性，是評價(jià)不同飼料飼用價(jià)值高低的重要指標(biāo)，越高越有利于動物的生長和生產(chǎn)[25]。在本試驗(yàn)中，添加屎腸球菌組的干物質(zhì)降解率均顯著高于對照組，而運(yùn)用體外產(chǎn)氣法研究屎腸球菌對瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的報(bào)道較少。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果可以推斷屎腸球菌由于其對腸道菌群的有益作用，而提高了瘤胃對飼料的消化。

3.4 不同活力屎腸球菌對培養(yǎng)液NH3-N濃度的影響

瘤胃消化發(fā)酵飼料會產(chǎn)生NH3-N，因此，瘤胃NH3-N反映蛋白質(zhì)和碳水化合物降解情況，而瘤胃微生物可以利用NH3-N合成菌體蛋白，反映瘤胃微生物與菌體蛋白的合成情況[26]。由本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加屎腸球菌可以促進(jìn)NH3-N產(chǎn)生，其原因可能是屎腸球菌進(jìn)入瘤胃后降低pH使得以氨為唯一氮源維持生長的瘤胃細(xì)菌受到抑制，致使NH3-N濃度上升[27]。在發(fā)酵24 h時(shí)，添加1×1010CFU/mL屎腸球菌后培養(yǎng)液的NH3-N濃度顯著提高，這與聶煉等[9]的結(jié)果一致。添加1×1010CFU/mL的屎腸球菌更利于瘤胃微生物生長。

3.5 不同活力屎腸球菌對培養(yǎng)液VFA濃度的影響

VFA是動物生長、繁殖與泌乳等基本活動的主要能量來源之一，其濃度變化直接影響反芻動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、利用和生產(chǎn)能力等[28]。乙酸是反芻動物體內(nèi)脂肪合成的主要前體物，丙酸是唯一能凈生成葡萄糖的VFA，足夠的丙酸能滿足動物對葡萄糖的需要[29]。在本試驗(yàn)中添加屎腸球菌后發(fā)現(xiàn)乙酸濃度有所增加，姜艷美等[30]將屎腸球菌液添加至奶牛飼糧中發(fā)現(xiàn)，其瘤胃內(nèi)乙酸濃度有所提高。劉星[31]接種乳酸菌和酵母菌進(jìn)行奶牛體外發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙酸、丙酸和丁酸濃度高于對照組，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。添加屎腸球菌組的總VFA濃度高于對照組，可能是因?yàn)楸釢舛雀哂趯φ战M，此結(jié)果證實(shí)接種乳酸菌于培養(yǎng)液中進(jìn)行體外發(fā)酵能夠影響VFA的產(chǎn)生量，對VFA的組成產(chǎn)生一定影響。在本試驗(yàn)中，添加不同活力屎腸球菌后，各組總VFA濃度均升高，說明屎腸球菌可以增強(qiáng)瘤胃發(fā)酵功能，促進(jìn)底物發(fā)酵，產(chǎn)生更多的VFA。添加1×1012CFU/mL屎腸球菌組的丙酸濃度高于乙酸濃度，可能與高活力屎腸球菌產(chǎn)酸較多，抑制纖維降解菌和纖維素酶活性[32]，使乙酸產(chǎn)量降低，瘤胃液發(fā)酵趨于丙酸發(fā)酵型有關(guān)[29]，說明添加微生物發(fā)酵飼料能改變瘤胃的發(fā)酵類型，從而提高了瘤胃發(fā)酵的能量利用率。

3.6 添加低活力屎腸球菌對瘤胃體外發(fā)酵效果評價(jià)

添加高活力的屎腸球菌較低活力屎腸球菌對瘤胃體外發(fā)酵效果差的原因可能是在瘤胃發(fā)酵液中添加高活力的屎腸球菌，使屎腸球菌在短時(shí)間內(nèi)成為優(yōu)勢菌，與瘤胃內(nèi)其他微生物爭奪營養(yǎng)物質(zhì)并產(chǎn)生乳酸，乳酸迅速產(chǎn)生堆積在發(fā)酵液中使內(nèi)環(huán)境pH短時(shí)間內(nèi)快速降低[29,31-33]，盧德勛[34]認(rèn)為促進(jìn)纖維素消化的適宜瘤胃液pH范圍為6.0～6.8，pH過低時(shí)，纖維分解菌生長就會受到抑制。前人研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃內(nèi)微生物的活力與pH的變化具有很大的關(guān)系。可能是因?yàn)轲B(yǎng)分的耗盡和瘤胃內(nèi)環(huán)境pH的變化使得瘤胃內(nèi)屎腸球菌和其他微生物活力降低，反過來又影響瘤胃內(nèi)NH3-N的利用和干物質(zhì)降解率。很多研究表明，瘤胃內(nèi)的pH過高，可能會降低胃蛋白酶活性，以及影響蛋白質(zhì)的消化率，益生菌會影響瘤胃內(nèi)pH，從而提高瘤胃蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的活性[35]。這與試驗(yàn)3組發(fā)酵24 h時(shí)的干物質(zhì)降解率顯著高于對照組一致。乳酸菌還對維持瘤胃的環(huán)境產(chǎn)生積極的效應(yīng)，如產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)如細(xì)菌素，抑制瘤胃內(nèi)有害的厭氧微生物生長，蛋白質(zhì)分解減慢，并競爭性抑制有害菌黏附，與腸道黏膜形成穩(wěn)定的生物屏障[4]，高活力的屎腸球菌進(jìn)入瘤胃后成為優(yōu)勢菌群，可能會產(chǎn)生大量細(xì)菌素抑制瘤胃微生物的正常生長，導(dǎo)致瘤胃內(nèi)原有穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞。因此，屎腸球菌在瘤胃液中的添加量要適度。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明添加屎腸球菌至發(fā)酵液中可以提高產(chǎn)氣量、干物質(zhì)降解率及NH3-N和VFA濃度，降低發(fā)酵液pH。通過各項(xiàng)指標(biāo)分析比較，建議屎腸球菌在綿羊體內(nèi)的添加活力為1×1010CFU/mL。