體外產氣法評價全株藜麥與全株玉米混合青貯飼料飼用價值

路平樂， 魏玉明， 楊發榮， 江小帆， 李 倩， 趙生國， 蔡 原*， 焦 婷

(1.甘肅農業大學動物科學技術學院， 甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省農業科學院畜草與綠色農業研究所， 甘肅 蘭州 730070； 3.甘肅農業大學草業學院， 草業生態系統教育部重點實驗室， 中-美草地畜牧業可持續發展研究中心， 甘肅 蘭州 730070)

藜麥(Chenopodiumquinoa)，莧科(Amaranthaceae)藜亞科藜屬(ChenopodiumL.)作物，原產于南美洲，在安第斯山地區有著7 000年的種植歷史，是古印第安人的主要糧食作物之一[1]。藜麥因營養價值高而全，適應性強等特點，不僅成為了世界各國人們青睞的食用口糧，也因其籽實、麩皮、秸稈等含有較高蛋白質，而被廣泛應用于飼料制作中[2]。藜麥秸稈被用作飼草料時，其所含有的木質素含量低于玉米秸稈，擁有更好的適口性和更高的動物消化吸收率[3]，因此藜麥作為一種優質飼草被開發利用。此外，藜麥中同時含有少量皂苷、單寧、非淀粉多糖以及植酸等抗營養因子，這些成分會影響胰蛋白酶和糜蛋白酶等消化酶的功能[4]。為了最大限度地提高藜麥的營養品質，可通過青貯的方法對這些抗營養因子進行有效的控制。青貯是一種被廣泛應用的谷物和牧草的保鮮方法，可最大限度地保留牧草的營養價值，并且有較好的適口性[5]。目前，青貯技術發展較為成熟，因其具有原料豐富，青貯方式多樣[6]，添加劑種類繁多等特點，在近年開始被廣泛研究[7]。

我國草地資源豐富，天然草地面積廣闊[8]。自21世紀以來，由于自然災害頻發、飼草資源儲備能力不足以及優良牧草品種較少等原因，使得我國的粗飼料短缺，無法獲得更多的飼草料供給國內的畜牧業發展[9]。因此，實現飼料的工業化生產和開發新的飼料資源是我國目前面臨的必要措施[10]。目前國內外對有關于藜麥青貯飼料、其副產物開發利用及在日糧中的添加比例等方面的研究鮮有報道[11]。本試驗通過將全株藜麥與全株玉米按不同比例混合青貯，對比全株藜麥與全株玉米不同比例混合青貯下的青貯品質及發酵特性的異同。同時，利用體外產氣法[12]對各青貯組進行模擬發酵，并進行相應指標測定，以期找到利于反芻動物消化吸收的全株藜麥與全株玉米的最佳混合青貯比例，為藜麥飼料化利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1樣品材料 試驗所用的全株藜麥(‘臺灣紅藜’)及全株玉米(‘金凱3號’)均于2020年10月12日在甘肅省廣河縣農業科技試驗示范基地機械刈割，此后立即按照不同試驗設計比例混合后進行桶裝青貯，青貯60 d，開桶將飼料混合均勻后使用四分法采取樣品。

1.2 試驗設計

試驗采用單因素試驗設計，青貯料采用桶裝青貯方式青貯，桶的體積為15 L。將全株藜麥與全株玉米分別以不同比例(以鮮重為基礎)混合青貯，具體混合比例及分組命名見表1。青貯60 d后開桶取樣，并進行感官品質檢測。選擇顏色呈黃綠色、氣味帶有微弱芳香味、質地松散無霉變的優質青貯料帶回甘肅農業大學動物營養實驗室，將樣品于 65℃烘箱中烘干恒重后，粉碎，自封袋中密封保存備用，用于各指標的測定。

表1 全株藜麥與全株玉米混合比例(以鮮重為基礎)Table 1 Grouping and proportion of silage of whole quinoa and corn in different proportions(Based on fresh weight) 單位：%

1.3 試驗方法

1.3.1常規營養成份測定 常規營養成份分析參考賀建華主編的《飼料原料分析與檢測》一書進行，干物質測定采用直接烘干法；粗蛋白用全自動凱氏定氮儀測定；粗脂肪用全自動脂肪分析儀測定；粗灰分采用馬福爐灼燒法測定；中性洗滌纖維及酸性洗滌纖維用Van Soest纖維分析法測定。

1.3.2瘤胃液采集及培養液配制 試驗所用瘤胃液是在體外發酵試驗當天清晨在屠宰場屠宰羊只瘤胃中獲得，將其通過4層紗布過濾入預熱過的暖壺中，期間不斷通入CO2，待用培養液參考Menke等[13]方法制備。

1.3.3體外發酵及產氣量測定

1.3.3.1 體外發酵

準確稱取經烘干處理過的不同混合比例的全株藜麥-玉米青貯飼料(0.2000±0.0010 g)，裝入孔徑為50 um、長寬為2.0 cm×3.0 cm的尼龍袋中，用尼龍繩綁緊封口，每組三個重復，并設置空白對照組(尼龍袋中不加發酵底物)，將其放置于體外產氣管(100 mL)的底部。同時加入預先配制好的人工瘤胃液30 mL(瘤胃液10 mL+緩沖液20 mL)，排出其中多余氣體后立即將產氣管前端橡皮套密封，并記錄此時產氣管刻度值(mL)，放置于39℃恒溫水浴鍋支架上。此后在第2 h，4 h，6 h，9 h，12 h，24 h，36 h和第48 h時記錄產氣管刻度值(mL)，每次讀數后輕輕搖晃產氣管以模擬動物瘤胃活動。

1.3.3.2 產氣值測定

GPt=200×(Vt-Vo)/W

上式中，GPt(Gas Production，mL)為各組合在t時刻的產氣管讀數(mL)；V0為體外發酵反應時該產氣管在0 h的讀數(mL)；Vt為體外發酵反應時該產氣管在t h時的讀數(mL)；W為該產氣管內樣品的干物質重(mg)。

某時刻GP(mL)= 該時刻樣品GP-該時刻空白管GP

1.3.4發酵產物及殘渣采集 體外發酵48 h后，記錄此時的產氣管產氣值GP48，將發酵液收入離心管中，將產氣管中的尼龍袋取出放入冰水中浸泡，使尼龍袋中樣品發酵終止。隨后將尼龍袋放入蒸餾水中反復清洗，洗至蒸餾水澄清且顏色無變化時取出瀝干，放入65℃烘箱中烘干并恒重，并測定體外干物質降解率(IVDMD)。發酵液經3 000 r·min-1離心10 min后取上清液分裝于5 mL離心管中，并于-20℃保存備用，后期用于測定乙酸(Acetic acid,AA)、丙酸(Propionic acid,PA)及丁酸(Butyric acid,BA)等揮發性脂肪酸濃度及氨態氮(NH3-N)含量。

1.3.5指標測定 使用P 611型酸度計測定儀測定pH；使用苯酚-次氯酸鈉比色法[14]測定氨態氮(NH3-N)，并計算出氨態氮總量；使用氣相色譜法測定[15]揮發性脂肪酸(VFA)濃度(氣相色譜儀型號為安捷倫-8890)；

體外干物質降解率計算 體外干物質降解率(In vitro dry matter digestibility，IVDMD)=(消化前樣品重量×消化前DM含量-殘渣樣品重量×殘渣DM含量)/(消化前樣品重量×消化前DM含量)×100%；

采空區充填后形成含水介質為中粗砂的含水層，圍巖具有隔水作用。地下水的主要補給來源為大氣降水，滲入地下部分沿基巖構造裂隙發育方向，匯集到中粗砂中，其排泄方式主要為人工開采。經估算，采空區蓄置的含水層，調節資源量約為1.3萬m3，單井涌水量大于1000m3/d，成為花崗巖基巖裂隙水貧水區中的富水地段。

產氣參數計算利用“fit curve”軟件(MLP；Lawes Agricultural Trust)，根據Фrskov[16]和McDonald(1979)的產氣模型公式將各樣品在2 h，4 h，6 h，9 h，12 h，24 h，36 h及48 h的GP代入，計算消化動力參數，消化動力模型公式為∶

GP=a+b(1-exp-ct)

式中，t為發酵開始后的某一時間(h)；a為快速產氣部分；b為緩慢產氣部分；c為產氣速度常數；a+b為潛在產氣量。

1.4 灰色關聯度分析

根據灰色系統理論，將每組全株藜麥與全株玉米不同比例混合的青貯料作為灰色系統的一個因素,應用灰色關聯度分析法對全株藜麥與全株玉米不同比例混合的青貯料的營養品質和發酵特性(GP以GP24為準)進行綜合分析[17]。

首先，確定參考數列。以各測定指標的最理想值構成參考數列∶X0(k) = {X0(1)，X0(2)，X0(3)，…，X0(n)}，各指標的測定值為比較數列∶Xi(k) ={Xi(1)，Xi(2)，Xi(3)，…，Xi(n)}，其中k= 1，2，3，…，n(n為測定指標數，此處為 17)，i= 1，2，3，…，m(m為全株藜麥與玉米不同比例混合組數，此處為 11)。其次指標的無量綱化。用Xi' (k) =Xi(k)/X0(k) 對各指標原始數據進行無量綱化處理。然后計算比較數列Xi與參考數列X0各對應點的絕對差值。△i(k) = |X0(k)-Xi(k)|，此處△i(k) 為第i全株藜麥與玉米不同比比例混合組的指標測定值Xi與理想值X0在第k個指標上的絕對差值，則理想數列X0和比較數列Xi在k點的關聯系數εi(k)∶

式中∶minmin|X0(k)-Xi(k)|為二級最小差；maxmax|X0(k)-Xi(k)|為二級最大差；ρ為分辨系數，本研究中取為0.5，視為同等重要[18]。

最后，計算等權關聯度、加權關聯度。

求出關聯度后，按照關聯度由大到小進行排序，關聯度越大，則說明比較數列越接近參考數列，綜合青貯效果越優。

1.5 數據處理及統計分析

采用Excel進行前期數據處理和制圖，采用SPSS 22. 0軟件的One-way ANOVA進行單因素方差分析，采用Duncan法進行多重比較，結果以平均值和均值標準誤(Mean ± SEM)表示，以P<0.05為差異顯著判斷標準。

2 結果與分析

2.1 營養價值

由表2可知，隨著全株藜麥含量的降低，各處理組混合青貯飼料的DM含量呈現先下降后逐漸升高的趨勢，蛋白含量及粗灰分含量逐漸降低。當為100%玉米時，其DM含量顯著高于其他處理(P<0.05)；CQC01組的粗蛋白及粗灰分含量顯著低于CK組(P<0.05)；CQC91組的粗脂肪含量高于CK組，且差異不顯著；CQC01組的中性洗滌纖維含量較CK組偏高，差異不顯著；CQC01組的酸性洗滌纖維含量顯著低于CK組(P<0.05)。

表2 青貯飼料組成及常規營養成分表(風干基礎)Table 2 Feed composition and routine nutrients(Air dry base)

2.2 體外產氣量

由圖1可知，在產氣0～2 h時，各組間累計產氣量基本一致；在產氣進行到2～6 h時，各組間的產氣量差異開始逐漸增大且CQC01組的產氣量高于CK組；發酵24 h時，各組體外發酵能力增強，速度開始達到最大；在第36 h時，各組體外發酵能力開始減弱，甚至趨向于停止，且此時可看出，CQC64、CQC28、CQC46組的產氣量從產氣第4 h開始逐漸高于其他各組，在第36 h差異達到最大，表明這3組的產氣效果尤為良好。

圖1 0 h～48 h各組飼料產氣量變化趨勢圖Fig.1 Change trend of feed gas production in each group from 0 h～48 h

2.3 單一青貯飼料體外產氣參數

由表3可知，CK組和CQC01組快速產氣部分a值分別為4.81和1.42，說明全株藜麥和玉米都不存在產氣滯后效應，且在快速產氣部分時間(a)全株藜麥長于玉米；緩慢產氣部分時間b值分別為21.87和39.59，且玉米的緩慢產氣時間長于全株藜麥。在24 h時，玉米和全株藜麥的產氣量分別為21.67和33.50，且玉米的產氣量高于全株藜麥。玉米的干物質降解率高于全株藜麥。

2.4 混合青貯飼料體外產氣參數

由表4可知，CQC19組和CQC37組的快速產氣部分顯著高于其他各組(P<0.05)，CQC46組存在產氣滯后效應；CQC28組的緩慢產氣部分和潛在產氣部分顯著高于較其他組(P<0.05)；CQC46組和CQC28組的24 h時產氣量GP24h最高，高于其他組4.33 mL，顯著高于其他各組(P<0.05)。CQC64組的干物質消失率(IVDMD)顯著高于其他組(P<0.05)。

2.5 全株藜麥與全株玉米不同比例混合青貯飼料組合后的IVDMD變化

由表3及表4可知，在體外發酵結束后，各組的IVDMD都低于 60 %，全株藜麥的IVDMD低于全株玉米，且CQC64組體外IVDMD值(0.51)顯著高于其他各混合青貯飼料組(P<0.05)，同時高于單一青貯飼料CK(藜麥)組和CQC01(玉米)組。

表3 單一青貯飼料體外產氣參數Table 3 In vitro gas production parameters of single silage

表4 全株藜麥與全株玉米不同比例混合青貯飼料產氣參數Table 4 Gas production parameters of silage mixed with whole quinoa and corn in different proportions

2.6 全株藜麥與全株玉米不同比例混合青貯飼料組合后的瘤胃發酵特性變化

由表5可以看出，本試驗中CQC91，CQC19和CQC01組的總揮發性脂肪酸含量顯著高于其他各組(P<0.05)；CQC64，CQC19，CQC91組的乙酸含量顯著高于其他各組(P<0.05)；CQC01組的丙酸含量顯著高于其他各組(P<0.05)，CQC55組的含量顯著低于其他各組(P<0.05)；異丁酸和戊酸含量在各組中差異不顯著；CQC01，CQC46組的丁酸含量顯著高于其他各組(P<0.05)；異戊酸含量在CK，CQC91兩組中含量最高，且顯著高于其他各組(P<0.05)；CQC28組的異戊酸含量顯著低于其他各組(P<0.05)；CQC91組的乙酸/丙酸值顯著高于其他各組(P<0.05)，CQC64組的乙酸/丙酸的值顯著低于其他各處理組(P<0.05)；

本試驗中，pH范圍在7.1～7.4，CQC37組的pH值最高，且顯著高于其他處理組(P<0.05)，CQC01組pH值顯著低于其他處理組(P<0.05)。CQC91組的NH3-N含量高于CK組，但差異不顯著。

表5 不同比例全株藜麥與全株玉米混合青貯飼料體外混合培養48 h后發酵特性Table 5 Fermentation characteristics of mixed silage of whole quinoa and corn in different proportions after in vitro mixed culture for 48 h

2.7 灰色關聯度綜合評價

由表6可知，不同比例全株藜麥與全株玉米混合青貯飼料的關聯值排序為CQC91組>CK組> CQC46組> CQC19組> CQC01組> CQC82組> CQC55組> CQC64組> CQC37組> CQC73組> CQC28組，且不同比例全株藜麥與全株玉米混合青貯飼料的加權關聯度排序順序與等權關聯度排序一致。

表6 不同比例全株藜麥與全株玉米混合青貯飼料的關聯度及排序Table 6 Correlation degree and order of mixed silage of whole quinoa and corn in different proportions

3 討論

3.1 不同混合比例青貯飼料的營養品質

粗蛋白和粗脂肪的含量是生產中選擇飼料的重要指標[19]，其含量的高低會影響動物的生長速度和飼料轉化率[20]。粗灰分是飼料中礦物元素的氧化態，在被動物攝入后為機體提供礦物質元素[21]。本試驗中，粗蛋白的含量隨著全株藜麥含量的降低而降低，是因為藜麥的蛋白含量高于玉米，這與汪曉璇[22]的研究相同。粗灰分含量隨著試驗中藜麥含量的降低而逐漸降低，這說明藜麥相對于玉米，含量較高的礦物質元素。這與的魏愛春等[23]的研究結果相同。

3.2 不同混合比例青貯飼料的產氣參數和GP

Menke等[13]認為體外發酵產氣量的多少與飼料中有機物的成分的發酵強度呈明顯的正比關系，產氣量是評價飼料營養價值的一項重要指標。當產氣量越高時，也說明飼料中可利用的營養成分越多。本試驗中，單一藜麥的a、b、a+b值低于單一全株玉米值，說明玉米較藜麥有更好的產氣性能。各組合飼料中，隨著全株玉米含量的增加，a + b值相應也隨著增加，當藜麥與全株玉米比例為60∶40時，a + b值大于其他各組，這可能是飼料間的組合效應所致。在產氣前24 h，所有組的產氣速度較快，袁翠林[24]研究中也得到了相同的結果，在產氣24 h后，各組的產氣速度相對穩定。同時CQC46組CQC64組、CQC28組三個組的產氣量顯著高于單一藜麥(CK)組和單一玉米(CQC01)組，這說明合理的飼料組合可以提高飼料的利用率。

3.3 不同混合比例青貯飼料的IVDMD、pH及NH3-N含量

瘤胃干物質降解率(IVDMD)反映的是動物對飼料消化的難易程度。飼料中合適的纖維含量可以刺激瘤胃收縮和腸道蠕動，增加飼料通過瘤胃的時間，進而提高飼料的降解率[25]。本試驗中，單一全株藜麥的干物質降解率低于單一全株玉米，在進行最佳組合后，CQC64組干物質降解率較單一全株藜麥(CK)組及單一全株玉米(CQC01)組都有所提高，這可能是此時的瘤胃pH更有利于纖維消化。

瘤胃內pH作為反映瘤胃發酵水平的一綜合性指標，其過高過低都會降低瘤胃的發酵性能。根據張昌吉[26]等研究說明，瘤胃pH的值一般在5.5～7.5范圍內，當pH不在此范圍內時，會影響纖維分解霉的活性從而降低瘤胃對纖維的消化率。本試驗的pH在6.5～7.5的范圍內，適合瘤胃微生物的生長和瘤胃發酵，同時，Hoover和Stocks[27]發現適合瘤胃消化纖維和干物質的最適pH為6.5，本試驗pH結果與此相似，并隨著全株玉米含量的增加，pH逐漸降低，接近于Hoover研究的最適pH值，表明發酵效果良好，各混合飼料適合瘤胃發酵。

瘤胃中的氨態氮(NH3-N)含量能反映飼料原料蛋白質的消化情況[28]，它是生物蛋白合成與蛋白質降解間的一個動態平衡，因飼料種類的不同，其會表現出大幅度的變動。維持合適的NH3-N濃度是保證瘤胃微生物蛋白合成的重要前提[29]，本試驗的氨態氮(NH3-N)含量在26.33～28.96 mg/dL之間，與鄭琛[30]研究的瘤胃內的氨態氮(NH3-N)含量應該在10～50 mg/dL范圍內的結果相同。同時在隨著藜麥混合比例的降低，試驗中的氨態氮(NH3-N)含量有隨之降低的趨勢，這可能是由于藜麥的蛋白含量較高，而全株玉米的蛋白含量較低的原因。

3.4 不同混合比例青貯飼料的瘤胃發酵特性變化

揮發性脂肪酸(VFA)是瘤胃碳水化合物發酵的主要產物，是反映微生物活性的重要指標，主要有維持瘤胃內環境穩定和為反芻動物機體提供70%～80%的能量等主要作用[31]。在本試驗中，CQC19組TVFA含量高于其他組，其變化與GP的變化趨勢呈現出正相關。此結果與唐德富等[32]的研究結果相似。同時乙酸/丙酸的值反映瘤胃的發酵類型。本試驗中，乙酸/丙酸的值在1.5～2.2的范圍內，根據李宗軍[33]研究表明，丙酸發酵可以為動物機體提供較高的能量效率，其提供的能量高于乙酸和丁酸所能提供的。所以藜麥和全株玉米青貯組合可以有效提高瘤胃對飼料的能量轉化效率，更好的為動物機體供能。CQC64組的乙酸/丙酸的值顯著低于其他各組，這表明可以該組合為可以為機體更高效的功能。

3.5 灰色關聯度分析

該混合青貯飼料的營養品質和發酵品質在全株藜麥與全株玉米的比例不同時，其結果呈現出一定的差異性，僅憑其中的一個指標難以篩選出最優的青貯混合比例。而灰色關聯度分析法可以將離散、不便于歸納的信息進行處理后，轉化為可以幫助我們分析的有用信息[34]。目前該方法廣泛運用于各個領域，特別在品種篩選和品比試驗中運用較為成熟[35-37]。利用灰色關聯度分析法通過對本試驗中的11組全株藜麥與玉米不同混合青貯飼料的 17項指標進行灰色關聯度評價模型的構建，可以將各營養品質及發酵品質綜合分析[28]，更加合理科學的篩選出全株藜麥與玉米最優的青貯比例。本試驗中，根據關聯度排序可知，CQC91組的青貯效果最好，CQC10組的青貯效果其次，CQC28組效果最差。

4 結論

通過比較不同比例混合的全株藜麥和全株玉米青貯組合發現，全株藜麥與全株玉米混合比例為90∶10時，該青貯飼料組合的粗蛋白(CP)和粗脂肪(EE)含量顯著高于其他各組，該組合的乙酸(AA)、總揮發性脂肪酸(TVFA)含量以及氨態氮(NH3-N)濃度顯著高于其他各處理組，可作為優質飼料組合在生產實踐中推廣應用。