叢枝菌根真菌對干旱脅迫下鵝絨委陵菜生理指標的影響

齊晨汐， 易觀濤， 付曉璇， 王海龍， 王佳琳， 吳建慧

(東北林業大學， 黑龍江 哈爾濱 150040)

干旱是世界性環境問題，全球有三分之一以上的地區為干旱或半干旱地區，其他地區植物在生長季也會遭受不同程度的干旱脅迫[1]，在諸多非生物脅迫中，干旱脅迫對植物的危害程度占主要地位。陳愛萍等[2]研究發現，在中度和重度干旱脅迫下伊犁絹蒿幼苗地上部分生長受到嚴重抑制。干旱脅迫會誘導植物活性氧的累積，降低植物水勢，從而引起植物吸收礦質營養能力下降，阻礙植物生長，甚至導致植物死亡[3]。為了減緩干旱脅迫對植物的傷害，國內外有許多學者取得了相關成果，如噴施生長素[4]、噴施赤霉素[5]、用有機物(硝普納)處理[6]、用硅處理[7]、加入AMF[8]處理等。關于AMF對干旱脅迫下植物生理生化的影響近年已有一些相關報道。張偉珍等[9]發現，AMF可以通過提高植物的可溶性糖、可溶性蛋白等滲透調節物質的積累，從而提高細胞液濃度、降低細胞滲透勢、防止細胞脫水、細胞水勢降低，與外界形成較高的水勢差，提高細胞吸水或保水能力[10]。AMF能與柑橘(Citrusreticulatablanco)形成共生體，其抗旱性高于未接種AMF的柑橘[11]。秦子嫻等[12]研究發現，接種了AMF的玉米(ZeamaysL.)在土壤有效磷含量較高時可提高玉米的抗旱性，提高了SOD，POD相對活性，降低MDA的含量。綜上所述，AMF與植物體共生可以促進宿主植物對水分的吸收與利用，促進植物光合作用，從而提高植物對干旱脅迫的抵抗能力。

鵝絨委陵菜，又名蕨麻，薔薇科(Rosaceae)委陵菜屬(Potentilla)多年生草本植物，是一種匍匐莖型蓮座狀植物，具有較高觀賞價值。鵝絨委陵菜較耐粗放管理、高度適應不良環境、維護成本較低、分布范圍廣[13]。在國外對鵝絨委陵菜的研究主要是藥理作用和無性繁殖，我國對鵝絨委陵菜的研究多集中在引種馴化[14]、重金屬脅迫[15]、組織培養[16]、藥理作用[17]等方面，鵝絨委陵菜在園林中常用作北方干旱地帶的草坪草，而有關鵝絨委陵菜-AMF共生體應答干旱逆境的機制未見報道。本研究通過自然控水方法，對接種AMF的委陵菜響應干旱脅迫的生理特性進行測定分析，旨在揭示鵝絨委陵菜的耐旱機制及其在干旱地區的園林應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在東北林業大學園林學院苗圃培養鵝絨委陵菜幼苗，待株高為4～5 cm時收割取回。從北京市農林科學院購回根內根生囊霉接種物，包含有菌根片段、真菌菌絲和孢子等，孢子量約為18 個·g-1。泥炭土、珍珠巖、蛭石、腐殖土等購自黑龍江省哈爾濱市花卉市場。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設計 選取生長一致、發育正常的鵝絨委陵菜幼苗，用清水培養3～5 d。

AMF接種處理：將所購基質泥炭土、珍珠巖和蛭石按3∶1∶1比例混合拌勻后置于高壓滅菌鍋中，120℃，240 KPa滅菌處理3 h。將經過高溫高壓滅菌處理的基質土置于口徑為18 cm的花盆中，精確稱取根內根生囊霉接種物25 g均勻置于處理組2 cm表層基質。

將鵝絨委陵菜幼苗隨機等分為兩組：對照組(CK)和處理組(T)，CK栽植在未接種根內根生囊霉的滅菌土壤中，T栽植在接種根內根生囊霉的滅菌土壤。每隔3 d澆一次水正常養護，80 d后測定鵝絨委陵菜菌根侵染率，讓侵染后的植株及CK自然失水(CK組與T組連續12 d不澆水)，讓其自然干旱，在干旱脅迫0 d，3 d，6 d，9 d，12 d時兩組分別取樣并測定其相應生理指標。

1.2.2菌根侵染率的測定 從基質中挖出鵝絨委陵菜后，用清水輕輕沖洗根部，將根部附帶的雜質等沖洗干凈至根部呈黃白色，注意控制水流速度和人為操作手法，以免破壞根系。根系清洗干凈后，取新鮮根樣，準確剪取1 cm不同粗細的根段保存FAA固定液(70%酒精：17.5 mol·L-1冰醋酸：38%甲醛=18∶1∶1)中，標記后可放入4℃冰箱內進行密封保存。

剪取接種根內根生囊霉的鵝絨委陵菜100個根段，用10%氫氧化鉀溶液在90℃水浴鍋消解60 min至透明狀，用蒸餾水清洗兩遍，再用2%的鹽酸酸化至少30 min后用蒸餾水清洗兩遍，用H2O2和蒸餾水再各清洗兩遍，用堿解離-Trypan blue色法[18]進行染色，乳酸甘油溶液進行脫色處理后制片，用根段觀測法和網格十字交叉法進行觀察，按照《菌根學》[19]測定菌根侵染率。

1.2.3生理指標的測定 以鵝絨委陵菜葉片為試驗材料，通過利用硫代巴比妥酸測定法測定MDA質量摩爾濃度；利用氮藍四唑法測定SOD活性；利用愈創木酚方法測定POD活性；通過考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量[20]。

1.3 數據分析

通過利用MYCOCALC.EXE軟件計算菌根侵染率。利用SPSS軟件對侵染率生理指標進行Duncans單因素方差多重比較分析，差異顯著水平為0.05。利用Microsoft Excel軟件對鵝絨委陵菜在AMF侵染后的生理指標進行數據分析與處理。

2 結果與分析

2.1 鵝絨委陵菜根與菌根共生的結構特征

經查閱文獻[21-22]鑒定鵝絨委陵菜與菌根共生的叢枝結構為重樓型(Paris type，簡寫為P型)叢枝結構。由圖1所示，根內根生囊霉的菌絲沿著植物根系表面生長并形成多處分支、多個入侵點(圖1a-1e)。菌絲根據結構不同可分為有隔菌絲(圖1a)和無隔菌絲(圖1d)；菌絲彎曲纏繞自由生長，可擴展為胞間菌絲(圖1c)和胞內菌絲(圖1e)；而根內根生囊霉的菌絲體以二叉分支方式生長，得到二叉狀菌絲H(圖1e)，連續以二叉分支方式生長，可形成樹狀結構。根內根生囊霉存在有大量泡囊(圖1d-1i)，且在相對較老的根中有較多的孢囊(圖1i)；泡囊形態多為橢圓形，也有圓形、異形、不規則形等(圖1f-1i)；根內根生囊霉菌絲體侵染植物根外層細胞后會導致被侵染植物根系表面有明顯的隆起，影響鵝絨委陵菜的根活力水平(即根系代謝水平)，從而影響整個植物的生命活動強度。

圖1 鵝絨委陵菜AMF菌根顯微結構Fig.1 Microstructure of AM mycorrhiza in Potentilla anserina注：(a)有隔菌絲H;(b)菌絲侵入點H;(c)已消解成斑點狀叢枝A及有隔菌絲H;(d)無隔菌絲H及泡囊V;(e)二叉狀菌絲H及頂端膨大成泡囊V;(f)異形泡囊V;(g)不規則泡囊V;(h)圓形泡囊V;(i)不規則泡囊VNote:(a)Septate hyphae H;(b)Hyphal invasion point H;(c) Been digested into Arbuscular and septate hyphae H;(d) Hyphae H and vesicles without septum;(e) Bifurcate hyphae H and apical expanded V;(f) Heterocyst V;(g) Irregular vesicle V;(h) Round vesicle V;(i) Irregular vesicle V

2.2 鵝絨委陵菜根圍AMF侵染狀況

由表1可知，菌根類型均為P型。在干旱脅迫天數為0 d、不接菌的對照處理中，未發現有菌根真菌的侵染，即侵染率為0；在干旱脅迫天數為0 d、接種根內根生囊霉的鵝絨委陵菜菌根侵染率極高，達到91.07%；對于處理組，隨著干旱脅迫程度逐漸增加，根系的菌根侵染率表現為下降，表明干旱會影響土壤中AMF的正常生長。

表1 干旱脅迫下AMF對鵝絨委陵菜菌根侵染率的影響Table 1 Effects of AM fungi on mycorrhizal infection rate of Potentilla anserina under drought stress

2.3 AM真菌對干旱脅迫下鵝絨委陵菜生理特性的影響

2.3.1AM真菌對干旱脅迫下鵝絨委陵菜丙二醛含量的影響 由圖2可知，CK的鵝絨委陵菜在干旱脅迫第9 d時，MDA的含量最高，高達25.41 μmol·g-1；而T在干旱脅迫9 d時MDA的含量顯著低于CK(P<0.05)，降低了15.89%；在干旱脅迫第12 d時，T的MDA含量也低于CK;由此可見，AMF會減輕細胞受到損傷的程度。

圖2 AMF對干旱脅迫下鵝絨委陵菜MDA的影響Fig.2 Effects of AM fungi on MDA tolerance of Potentilla anserina under drought stress

2.3.2AM真菌對干旱脅迫下鵝絨委陵菜酶活性的影響 由圖3可知，SOD的活性隨著干旱處理時間的延長呈現先升高后降低的趨勢。CK和T的SOD活性在第9 d時達到最大值，分別為14.65 U·g-1和19.36 U·g-1，和其他脅迫時間相比差異顯著(P<0.05)；且T的SOD的活性始終高于CK，說明接菌后顯著提高了植株體內的SOD活性水平，比CK更有效地清除體內活性氧，進而保護自身細胞免受損害。

圖3 AMF對干旱脅迫下鵝絨委陵菜SOD的影響Fig.3 Effect of AM fungi on SOD of Potentilla anserina under drought stress

由圖4所示，POD的活性隨著干旱脅迫時間的增加呈現先升高后降低的趨勢。CK和T的POD活性在第9 d時達到最大值，分別達到791 U·g-1和1 029 U·g-1，T的POD的活性比CK高30.00%，和其他脅迫時間相比差異顯著(P<0.05)；且T的POD的活性始終高于CK，說明接菌后減輕了氧化物對鵝絨委陵菜的傷害，從而降低了干旱脅迫對鵝絨委陵菜的傷害程度。

圖4 AMF對干旱脅迫下鵝絨委陵菜POD的影響Fig.4 Effect of AM fungi on POD tolerance of Potentilla anserina under drought stress

2.3.3AM真菌對鵝絨委陵菜耐受干旱脅迫可溶性蛋白的影響 由圖5所示，干旱脅迫初期(前3 d)，可溶性蛋白含量變化不明顯；在干旱脅迫第6 d時，CK和T的可溶性蛋白含量明顯提高并達到最大值，分別達到2.21 mg·g-1和2.47 mg·g-1；而CK在脅迫12 d時可溶性蛋白含量顯著低于T(P<0.05)，降低了34.59%；由此可見，AMF能夠加強鵝絨委陵菜細胞的保水能力，對其起到保護作用。

圖5 AMF對干旱脅迫下鵝絨委陵菜可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effects of AM fungi on soluble proteins of Potentilla anserina under drought stress

3 討論

3.1 干旱脅迫下接種AM真菌的菌根侵染率

根系是植物的重要器官，吸收水分和礦物質養分，穩固和儲存同化物[23]，植物對養分吸收效率與根系構型有關[24]。本試驗通過對鵝絨委陵菜接種根內根生囊霉，發現接種根內根生囊霉的鵝絨委陵菜菌根侵染率達91.07%，侵染率高，易與鵝絨委陵菜形成共生關系。這與吳強盛等[25]研究認為接種AMF可對白三葉(TrifoliumrepensL.)根系構型及參數起促進效應與本文研究結果基本一致。

3.2 AM真菌對干旱脅迫下鵝絨委陵菜生理特性的影響

MDA是細胞膜脂過氧化產物之一，植物體內MDA含量的高低在一定程度上反映了脂膜過氧化作用水平和膜結構的受害程度[26]，以及植物的抗逆性強弱，其中MDA含量越高則植物氧化程度越高，即細胞所受損害程度越大。在本試驗中，隨著干旱脅迫程度的增加，鵝絨委陵菜體內的MDA含量呈上升趨勢，這與張玉曼等[27]的研究中發現所受脅迫程度越深的狗尾草其體內MDA含量越高一致。且T的MDA含量始終低于CK，即AMF能夠阻礙干旱脅迫對鵝絨委陵菜植株的傷害，從而增強植株的抗旱性。

SOD和POD是普遍存在于植物體內、極為重要的抗氧化酶，防止逆境產生的自由基對細胞膜產生不利影響[28]。研究表明，SOD和POD活性與生物機體的免疫水平密切相關[29]，體內SOD，POD活性較高的植物抗逆性較強[30]。隨著干旱強度的增加，CK和T的SOD，POD的活性均增加；在植株受到干旱脅迫時，體內活性氧數量會增加，說明鵝絨委陵菜會對干旱脅迫做出應答反應；但當植株所受逆境脅迫超過承受能力時，會損傷細胞。在干旱中期和后期(6～12 d)，T的酶活性始終高于CK，說明接菌后能夠增加SOD，POD活性，即降低了干旱脅迫對鵝絨委陵菜的傷害程度，保護了自身細胞。

可溶性蛋白為重要的滲透調節物質和營養物質，它們的增加和積累能提高細胞的保水能力，對細胞的生命物質及生物膜起到保護作用，即可溶性蛋白的含量是判斷植物抗旱性的重要指標之一[31]。隨著干旱脅迫強度的增加，CK和T的可溶性蛋白的含量均降低。在高強度干旱脅迫下，植物生物膜脂氧化加劇，破壞了細胞膜結構的完整性[32]。而在CK和T的干旱脅迫中期和后期(6～12 d)，T的可溶性蛋白含量顯著高于CK，這與羅方舟等[33]的研究發現可溶性蛋白質在一定程度的干旱脅迫下，通過參與植物體內的滲透調節以抵御干旱脅迫一致。這說明AMF能夠提高鵝絨委陵菜細胞的持水性，從而提高了植物的抗旱性。此與趙匠等[34]發現AM真菌在鹽脅迫下能通過促進黃檗(PhellodendronamurenseRupr.)可溶性蛋白分泌提高黃檗抗逆性的研究結果一致。

4 結論

綜上所述，鵝絨委陵菜接種AMF后，AMF能夠侵染鵝絨委陵菜根系并與鵝絨委陵菜建立良好的共生關系；在干旱脅迫下，接種AMF的鵝絨委陵菜能夠有效的降低MDA含量、增強SOD和POD活性并增加可溶性蛋白的含量。以上生理指標的變化體現了AMF在一定程度上能夠增強鵝絨委陵菜的抗旱能力，有效減緩了干旱脅迫對鵝絨委陵菜所造成的傷害。鵝絨委陵菜在干旱脅迫下，能夠利用接種AMF提高其抗旱性。