貴州巖溶山區多花木藍根瘤菌及高效菌株篩選

韋興迪， 曾慶飛， 韋 鑫， 李亞嬌， 歐二綾， 劉正書

(貴州省農業科學院草業研究所， 貴州 貴陽 550006)

貴州省位于云貴高原東部，是我國唯一一個沒有平原支撐的內陸高原山區省，也是喀斯特地貌發育最強烈、分布面積最大的典型區域[1]。在喀斯特地區石漠化生態修復過程中，豆科灌木具有植株高大、耐貧瘠、營養豐富、抗逆性和適應性強等特點，能明顯改善土壤微環境，為其他植物的遷移、定居、生長創造條件，從而促進退化生態系統植被演替與恢復[2]，已經成為巖溶山區農牧業生產和生態治理的寶貴植物資源[3]。多花木藍(Indigoferaamblyantha)作為一種優質豆科飼用灌木和抗逆先鋒植物，由于其具有耐干旱、耐貧瘠、耐踐踏、耐刈割、適口性好、粗蛋白質含量高、青綠期長等特點，被評價為改良干旱、半干旱地區退化草地和建植人工放牧草地的優良飼用灌木，也是喀斯特山區石漠化治理的重要先鋒植物之一[4-5]。本課題組在云貴高原天然豆科牧草根瘤菌資源調查過程中發現，貴州巖溶山區野生多花木藍分布廣泛，共生結瘤能力強，在干燥貧瘠的坡地以及石芽石縫中也能頑強生長，推測其根系定殖著豐富的、適應石漠化生境的共生根瘤菌[6]。因此，挖掘利用野生多花木藍共生微生物資源，對于推動地區農業及草地生態畜牧業的可持續發展具有重要意義。

國內外有關多花木藍的研究報道大多與其營養價值、栽培利用、生產表現，以及多花木藍根系叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)的調查、分析等有關[7-8]，但針對環境特殊的貴州巖溶山區多花木藍根瘤菌的資源研究還較為缺乏。本研究除了調查貴州巖溶山區野生多花木藍根瘤菌的資源蘊藏狀況并揭示其區系分布特征以外，還將從采自貴州省不同喀斯特地貌區域的野生多花木藍分離鑒定的多花木藍根瘤菌中，篩選出適應本地喀斯特環境、能在豆科作物根系內定殖共生并高效固氮促生的根瘤菌株。根瘤菌侵染豆科植物形成根瘤是一個十分復雜的過程，這一共生固氮系統的有效建立，首先需要根瘤菌與豆科植物的識別匹配[9]，不同種類的根瘤菌與豆科植物之間相互存在著一個識別選擇范圍[10]。除此之外，生態地理環境對豆科植物根瘤菌的多樣性也存在著重要影響，根瘤菌與豆科植物共生關系的建立是細菌、植物及環境三個因素相互作用的結果[11-12]，根瘤菌與豆科植物的共生關系會因生態環境的差異而呈現出種類的多樣性[13]。根瘤菌對共生宿主植物的識別選擇具有一個相對的種類專一性范圍，一般而言，從特定種類豆科植物根瘤中分離出的根瘤菌都能與該種植物識別共生。為了獲得共生匹配范圍較廣的優良根瘤菌株，本研究沒有選用多花木藍，而是選擇了豆科牧草百脈根(LotuscorniculatusL.)作為回接宿主植物。百脈根作為豆科百脈根屬多年生叢生草本植物，由于營養豐富、干物質消化率高、適口性好、根系強大等特點，既是一種優良的豆科牧草和飼用植物，又是一種具有良好水土保持性能的抗逆先鋒植物[14-17]。因此，選擇來自不同地域的不同種類的多花木藍根瘤菌與百脈根進行盆栽植物回接試驗，結合菌株固氮酶活性的測定，篩選出結瘤固氮能力強、植物促生效果好的優良菌株，可進一步探明野生多花木蘭根瘤菌資源，利用豐富的豆科牧草共生資源積極推動“綠色整治、生態修復”發展草地生態畜牧業，對于貴州巖溶地區農業及草地生態畜牧業的可持續發展和喀斯特生態環境修復提供可利用的微生物資源和研究基礎，具有重要而深遠的現實意義[18]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1根瘤樣品 按照《貴州省生態功能區劃》[19]發布的標準，本試驗選擇了5個不同的生態功能區為采樣區(涉及22個縣)，具體為：(1)北部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態區，屬亞熱帶季風氣候；(2)南部干熱河谷南亞熱帶季雨林生態區，位于貴州南部，屬典型的亞熱帶溫暖溫潤的季風氣候；(3)中部濕潤亞熱帶喀斯特脆弱生態區，位于貴州中西部，屬典型的高原型濕潤亞熱帶季風氣候；(4)東部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態區，位于貴州省東北部，屬中亞熱帶季風濕潤氣候區；(5)西部半濕潤亞熱帶針闊混交林、草山喀斯特脆弱環境生態區，位于貴州高原西南部，屬亞熱帶季風濕潤氣候。共采集野生多花木藍根瘤樣品44份，具體采集地點及根瘤樣品編號見圖1。

1.1.2牧草種子 盆栽回接試驗用百脈根種子(品種名：‘歌德’)購于貴陽霖卉園林綠化有限公司。

1.2 根瘤菌株的分離純化

將采集到的多花木藍根段及根瘤表層泥土沖凈，吸水紙吸干表面水分，將干燥的根瘤在無菌水中浸泡至吸脹，挑取10～20顆碩大飽滿的單個根瘤放入無菌小燒杯中，在超凈工作臺內用95%的乙醇浸泡5 min，接著換用0.1%的HgCl2浸泡5 min，無菌水洗滌5～l0次后轉至無菌研缽中，加入1000 μL無菌水研磨成懸濁液，用移液槍將懸濁液轉至加有剛果紅的酵母甘露醇瓊脂(Yeast mannitol agar，YMA)培養基上，均勻涂布，28℃培養箱內恒溫倒置培養3～7 d。每天觀察1次，挑取不吸色、菌落圓形、邊緣整齊、表面光滑而隆起、濕潤黏稠、略透明或半透明的典型單菌落，用平板劃線法接種于另一新的YMA平板上，倒置于28℃培養箱內恒溫培養。長出菌落后挑取單菌落進行革蘭氏染色，鏡檢，若不純，進一步純化，直至獲得純化菌株。將純化菌株接種至YMA液體培養基中，28℃振蕩培養7 d后用30%甘油保種，—70℃超低溫冰箱中凍存。

圖1 野生多花木藍根瘤樣品編號及采集地點Fig.1 Root nodule sample numbers of wild Indigofera amblyantha and their sampling sites注：審圖號GS(2021)5448號Note:Drawing No. GS(2021)5448

1.3 根瘤菌株的鑒定與區系分析

1.3.1根瘤菌株的形態學鑒定 參照一般細菌常用鑒定方法[20]，對純化后革蘭氏染色鏡檢為紅色的G-菌株，進一步觀察菌體形態特征。

1.3.2根瘤菌株的16S rRNA基因系統發育分析 利用細菌基因組DNA抽提試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)提取分離純化獲得的各菌株的總DNA，選用P1—P6通用引物對擴增各菌株的16S rDNA片段，PCR產物經純化回收后與質粒PMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α；篩選得到轉化子，提取質粒DNA并經酶切驗證后，送北京擎科新業生物技術有限公司昆明分公司測序。將測得的菌株序列使用NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)中的Blast軟件在線比對，并從GenBank數據庫中下載與待分析序列相近的已知種模式菌株的16S rDNA序列，用DNAMAN進行多重比對，確定各菌株的種屬分類地位。

1.3.3根瘤菌株的區系分析 根據分離菌株的系統發育分析結果，統計所有種類根瘤菌在研究區中的種屬組成、分離頻度，對其優勢種及生境分布多樣性進行分析。分布頻率采用相對頻率分別計算，計算公式：

分離頻度(%)=

(某個種出現的樣品數/總樣品數)×100%

1.4 優良根瘤菌株的盆栽回接篩選

1.4.1供試菌株 基于菌株盆栽回接篩選試驗的工作量大，同一地域同一宿主植物的同種根瘤菌株的生理代謝與固氮促生功能的相似性，不同地理生態環境、不同種類的根瘤菌株之間的代謝功能特性的差異性等特點，本試驗從已純化的根瘤菌菌株種優先選擇其不同地域、不同種類的具有代表性的多花木藍根瘤菌作為盆栽篩選試驗供試菌株。

1.4.2盆栽播種 選取發芽率正常的百脈根種子，先用75%的乙醇浸泡2 min，無菌水清洗2～3次，再用3%的次氯酸鈉消毒10 min，無菌水清洗5～6次后，播種于基質為滅菌珍珠石的花缽中。將花盆置于室溫25℃、每天光照16 h的人工氣候室中培養。待種子發芽長出幼苗后，噴施Hoagland全營養液(上海國藥)，生長26 d后每盆保留生長一致的幼苗10株用于菌液回接處理。

1.4.3菌液培養 從—70℃超低溫冰箱中取出用于篩選試驗的保種根瘤菌株，無菌接種環蘸取劃線接種于YMA平板上，28℃恒溫倒置活化培養后，挑取單菌落接種于500 mL YMA液體培養基中，28℃，200 r·min-1振蕩培養5～7 d。

1.4.4盆栽回接篩選 每個菌株回接3個百脈根花盆(3次重復)，并以澆灌無菌YMA液體培養基作為空白對照(CK)，每個花盆回接菌液或培養基的體積為50 mL。每天澆灌少量Hoagland營養液保持基質濕潤。菌液回接68 d、盆栽生長94 d后，將盆內植株取出，沖凈后用吸水紙吸取根表面的水分，首先統計各處理植株的根瘤數，再在每一處理的每個重復中隨機選取3個百脈根植株，另外再選擇1個長勢適中的植株，共10個植株，取出沖洗干凈后統計根瘤數，計算單株根瘤數的平均值；然后將地上、地下部分分離，于105℃殺青30 min，在85℃下烘干12 h至恒重后，采用萬分之一電子天平稱重，測定各處理植株的地上生物量和地下生物量。

1.5 菌株的固氮酶活性測定

將所有待測菌株接種于CCM培養平板上劃線，28℃培養5～7 d，采用固氮酶(NITS)酶聯免疫分析試劑盒(青島科創質量檢測有限公司)測定固氮酶活性。以OD值為橫坐標，標準物的濃度為縱坐標，繪出標準曲線，通過標準曲線計算樣品中固氮酶(NITS)活性濃度，其中回歸方程為Y=95.842 0x-3.958 5，R2=0.997 2。根據結瘤數、促生效應及固氮酶活性篩選出高效菌株。

1.6 數據統計分析

采用Excel 2010整理數據，將獲得數據用LSD法進行多重比較，同時使用SPSS 18.0軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 分離獲得的根瘤菌菌株及其形態特征

利用加有剛果紅的YMA平板分離和純化培養，共得到77個純化菌株。純化的菌株經革蘭氏染色鑒定，獲得53個革蘭氏陰性(G-)保存菌株。對經分離純化和革蘭氏染色鑒定呈G-的53個菌株進行菌體形態觀察，菌體細胞均呈桿狀，長短不一，有莢膜或無莢膜，菌體表面均著生鞭毛，鞭毛端生、側生或周生，符合根瘤菌的基本形態特征(表1)。

表1 多花木藍根瘤菌菌株的形態特征Table 1 Morphological characteristics of Indigofera amblyantha rhizobial strains

2.2 根瘤菌株的種類鑒定與區系分析結果

利用細菌基因組DNA抽提試劑盒提取53個G-保存菌株的總DNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，均形成23 kb左右的條帶。利用P1—P6通用引物對，所有待測菌株均PCR擴增出約1.5 kb的序列片段。按照1.3.2 的方法進行菌株的種屬鑒定和分類，33個根瘤菌株的分子鑒定結果見表2。根據測定比對結果，結合菌體的形態結構特征，53個G-菌株中有共生根瘤菌33株，其余20個菌株屬于根瘤內生細菌。

表2 基于16S rDNA序列比對的多花木藍根瘤菌株分子鑒定結果Table 2 Taxonomic identification results of rhizobial strains of Indigofera amblyantha based on 16S rDNA sequence alignment

表3顯示野生多花木藍根瘤菌種類和區系分布，共6屬22種根瘤菌。6個屬分別是：根瘤菌屬(Rhizobium)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)，其中根瘤菌屬的分布頻率最高，達33.33%，慢生根瘤菌屬其次，達30.30%，為優勢屬；慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)的分布頻率最高，達到15.15%，為優勢種。

5個生態功能區多花木藍根瘤菌的分類、種屬分布如表4。在北部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態區只鑒定出Rhizobium和Bradyrhizobium2個屬的4個種；在南部干熱河谷南亞熱帶季雨林生態區鑒定出Rhizobium，Bradyrhizobium，Burkholderia，Pseudomonas和Agrobacterium5個屬的8個種；在中部濕潤亞熱帶喀斯特脆弱生態區只鑒定出Rhizobium和Burkholderia2個屬的5個種；在東部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態區鑒定出Rhizobium，Bradyrhizobium，Mesorhizobium，Burkholderia，Pseudomonas和Agrobacterium6個屬的8個種；在西部半濕潤亞熱帶針闊混交林、草山喀斯特脆弱環境生態區僅鑒定出Bradyrhizobium1個屬的3個種。5個生態功能區多花木藍根瘤菌的種屬分布存在著明顯的差異，如：Mesorhizobium只在東部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態區被分離得到，西部半濕潤亞熱帶針闊混交林、草山喀斯特脆弱環境生態區僅鑒定出Bradyrhizobium，中部濕潤亞熱帶喀斯特脆弱生態區鑒定出屬于Rhizobium屬的種類分布最為豐富。

表3 多花木藍根瘤菌株區系分析結果Table 3 The result of floristic analysis of rhizobial strains of Indigofera amblyantha

表4 研究區多花木藍根瘤菌的種屬分布特征Table 4 Species distribution characteristics of Indigofera amblyantha rhizobia in the study area

續表4

2.3 共生結瘤固氮高效根瘤菌株的篩選

選擇來自不同地域、不同種類的13個根瘤菌株(CCIR3-1，WHIR26-2，LMIR32-1，MHIR57-2，SZIR67-2，SZIR67-5，DHIR236-3，HBIR252-6，MXIR316-1，LXIR323-2，JCIR335-1，JCIR336-2，JCIR336-6)回接百脈根幼苗進行篩選試驗。

菌液回接68 d、盆栽生長94 d后，經根瘤菌接種處理的百脈根長勢較好、植株較高、葉片顏色較深，未經根瘤菌接種處理的對照組(CK)長勢較差、植株弱小、葉片較小且顏色較淺，處理組與對照組相比表觀差異明顯(圖2)。

根瘤平均數、地上部干重、地下部干重的測定結果見表5。與對照組(CK)相比，試驗組中的13個菌株的共生結瘤和促生作用均有所提高，每盆平均結瘤數在6～50之間。綜合根瘤數、地上部干重和地下部干重3項測定指標，發現其中6個菌株(CCIR3-1，LMIR32-1，SZIR67-5，HBIR252-6，MXIR316-1和JCIR335-1)的結瘤促生效果十分明顯，與對照差異顯著(P<0.05)；其中，菌株LMIR32-1的根瘤數、地上地下部干重與其余12個供試菌株的差異顯著(P<0.05)。

圖2 百脈根盆栽回接篩選部分處理圖片Fig.2 Partial treatment pictures of Lotus corniculatus potted back inoculation screening experiment

表5 百脈根盆栽回接篩選試驗測定結果Table 5 The determination results of the potted back inoculation and screening test of Lotus corniculatus

2.5 供試菌株固氮酶的活性

13個供試根瘤菌株均具有固氮酶活力(37.33～263.05 IU·L-1)(表6)。不同菌株的固氮酶活性存在差異；其中促生效果較好的6個菌株的固氮酶活性也相對較高，活性大小順序為：LMIR32-1>MXIR316-1>SZIR67-5>JCIR335-1>CCIR3-1>HBIR252-6，與其余7個菌株間都呈現出顯著差異(P<0.05)。

表6 供試根瘤菌株固氮酶活性測定結果Table 6 Measured result of nitrogenase activity of the experimental rhizobium strains 單位:IU·L-1

綜合促生效果與結瘤固氮能力分析，在13個供試菌株中，分離自羅甸縣沫陽鎮野生多花木藍根瘤樣品的菌株LMIR32-1具有最高的固氮酶活性以及最強的結瘤促生能力，屬于供試菌株中的最優固氮根瘤菌株；另外，分別分離自長順長寨、三都中和、赫章白果、麻江杏山和劍河岑松多花木藍根瘤樣品的5個菌株CCIR3-1，SZIR67-5，HBIR252-6，MXIR316-1和JCIR335-1，與除最優根瘤菌株LMIR32-1以外的其余7個菌株的促生效果和結瘤固氮能力均呈現顯著或極顯著的差異，屬于篩選出的優良根瘤菌株。

3 討論

能與多花木藍識別共生的根瘤菌的種類范圍在國內尚無文獻報道，本研究在貴州5個不同生態功能區的野生多花木藍根瘤樣品中，共分離鑒定出6個屬22個種的根瘤菌，其中東部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態區和南部干熱河谷南亞熱帶季雨林生態區被分離鑒定出的多花木藍根瘤菌的種屬數量最多，中部濕潤亞熱帶喀斯特脆弱生態區和北部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態區的種屬數次之，西部半濕潤亞熱帶針闊混交林、草山喀斯特脆弱環境生態區的最少，只有1個屬的3個種。這說明，在5個不同氣候類型的生態功能區域中，因為不同的溫度、光照、土壤類型及水分條件，最終形成了多花木藍根瘤菌不同的區系分布特征，共生根瘤的形成直接受到細菌、植物及生態地理環境三個因素的共同影響，這一結果與陳文新等[13]的研究結論是一致的。

本研究在對多花木藍根瘤樣品進行菌株分離時，最初采用的是常規使用的根瘤壓破劃線法[21]，但隨即發現這一方法分離效率極低，原因可能是每一次都是野外連續幾天的調查采樣，當天采集的新鮮根瘤樣品不能得到及時的分離，待到分離時根瘤已經處于干燥狀態，即使用無菌水浸泡吸脹后，壓破的根瘤中的汁液依然很少。后來采用無菌水研磨根瘤涂布平板法，發現分離效果得到了明顯的提高。但總體而言，從44份野生多花木藍根瘤樣品中分離得到53個革蘭氏陰性菌株，經鑒定其中只有33個屬于共生根瘤菌，另有20個菌株屬于在根瘤內與根瘤菌一起共生的根瘤內生細菌，說明改進后的分離方法對于根瘤菌株的分離也未達到理想的效果，根瘤菌的分離手段尚需進一步的改良優化。盡管如此，本試驗所采用的改進后的研磨涂布平板法分離得到的菌株仍然能在一定程度上反映出不同生態功能區域多花木藍根瘤菌區系分布的差異性特征。

本研究在百脈根盆栽回接篩選試驗中，根據共生結瘤數、對共生宿主植物的促生效果以及菌株本身的固氮酶活性三項指標，篩選獲得了6株促生固氮效果良好的根瘤菌，結瘤促生效果和固氮酶活性與其余7個供試菌株都呈現出顯著或極顯著的差異，其中分離自羅甸縣沫陽鎮野生多花木藍根瘤樣品的菌株LMIR32-1被鑒定為優良菌株中的最優固氮根瘤菌株。由于根瘤菌的固氮促生機理十分復雜，其中根瘤內生細菌也具有不可忽視的協同作用，因此，根瘤菌的促生固氮能力不完全取決于菌株的固氮酶活性，但是固氮酶活力較高的菌株，其共生固氮能力一定較強[22]。

4 結論

從分離自貴州巖溶山區5個不同生態功能區的多花木藍根瘤菌中，優先選擇13個來自不同地域和不同種類的菌株作為篩選對象，其中6個菌株(LMIR32-1，MXIR316-1，SZIR67-5，JCIR335-1，CCIR3-1和HBIR252-6)對水土保持性能良好的抗逆先鋒植物百脈根具有良好的共生結瘤和固氮促生效果，具有開發應用潛力。篩選出的6個高效根瘤菌株及其與多花木藍和百脈根建立的優勢共生體系，將為地區草地生態畜牧業的可持續發展和喀斯特環境的修復與治理提供有效的物質和技術支持。