紅豆草種子形態和營養成分遺傳變異分析

魏少萍， 李景峰， 梁鵬飛， 陳 潔， 劉 鑫， 南麗麗

(甘肅農業大學草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室， 甘肅 蘭州 730070)

紅豆草(Onobrychisviciaefolia)為豆科(Leguminosae)驢食草屬(OnobrychisMill)深根型草本植物，播種當年根系生長迅速，適應環境的可塑性大，含有豐富的植物蛋白，廣泛用于城市綠地工程建設、水土保持工程建設、草田輪作、綠肥、混播和再生體系建立等[1-2]。植物表型是基因和環境共同作用的結果，反映了基因型在長期的環境變化壓力適應下的新選擇[3]。而種子生長環境與其他營養器官相比較為封閉，受到的外界環境因子的影響較小，因此，種子形態特征相對穩定[4]。植物種子形態主要受遺傳因素控制，但在不同的分布區域也會由于適應不同的生境而產生新表型，因此表型變異往往在適應和進化上有重要意義[5]。對種子形態特征和營養成分的研究對植物優良品種選育和品種鑒定具有較大的潛力。種子形態特征經常作為研究對象用以區分種類。

以往對紅豆草的研究主要集中在改土效益[6]、誘變選育[7]、基因克隆[8]、抗病性[9]、光合特征[10]、提純復壯[11]、抗逆性[12-13]及ISSR體系優化[14]等方面，而有關紅豆草種子形態及營養成分變異方面的研究少見報道。種子表型特征變異是植物遺傳變異的重要特征之一，在遺傳分類學上具有重要研究價值[15]。種子的形態特征是識別種子的重要依據，其與種子的擴散傳播能力、種子的萌發、幼苗定植，甚至種群的分布格局密切相關[16]。牧草種子的外部形態是各種牧草種子真實性和純度鑒定以及進行種子分級和檢驗的主要依據[17]。

本研究以國內外22份紅豆草種質資源為供試材料，研究紅豆草種子的面積、周長、長寬比、長度、寬度和千粒重等形態指標及種子中粗蛋白、粗脂肪、淀粉和水分等主要營養成分，通過方差分析、相關分析、主成分分析和聚類分析等綜合評價紅豆草種質的特性，深入探討紅豆草種質的變異情況，以期為篩選和綜合評價紅豆草優異新品種、種質鑒定及種質資源保護提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試紅豆草材料共22份，其中編號1，6，2323-1，1626，1668，1994，2049，2208，2323-2，2559，2668，7456，9155，9602，9699，9860，9977，10295，13523，13709共20份由農業部全國畜牧獸醫總站牧草種質資源搜集保護項目協作組(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所)從俄羅斯瓦維洛夫植物基因庫引進，‘蒙農紅豆草’(Onobrychisviciaefolia‘Mengnong’，MN，育成品種)種子由內蒙古農業大學提供，‘甘肅紅豆草’(Onobrychisviciaefolia‘Gansu’，GS，地方品種)種子由甘肅農業大學提供。

1.2 試驗地概況

將22份材料于2019年4月3日種植在甘肅農業大學武威黃羊鎮牧草試驗站(37°55′ N，102°40′ E)。該站海拔1 550.88 m，年均溫7.2℃，年降水量150 mm，年蒸發量2 019.9 mm，無霜期154 d，屬于溫帶干旱荒漠氣候，土壤類型為沙壤土[18]。人工開溝條播，播種深度3～4 cm，播種量60 kg·hm-2，小區面積20 m2(4.0 m×5.0 m)，小區間隔0.5 m。播前澆一次底墑水，生長期間，不施肥，于紅豆草出苗期、分枝期、現蕾期漫灌。現蕾期后每小區使用隔離網以防發生雜交，并在每小區放養熊蜂授粉，于2020年6月下旬待80%的莢果呈黑褐色時采集各材料的種子，帶回實驗室自然干燥后在種子袋中保存備用。

1.3 種子功能性狀測定

采用多功能種子分析儀(1903817S)對22份紅豆草種質進行種子功能性狀分析，每份種質300粒，測量種子的面積、周長、長寬比、長度、寬度。

具體操作如下：先將干凈的種子均勻的平鋪于背光板上，將高拍儀調整至適合的高度后，采用ScanMaker i600 Plus上下LED雙光源彩色掃描儀掃描種子，進行種子圖像采集。然后，根據工作區范圍進行二值和反色設置后，即可啟動圖像分析系統，將種子大小及形態性狀數字化，之后進一步分析和處理數據。

參照我國GB/T3543.7-1995《農作物種子檢驗規程其他項目檢驗》[19]文件中千粒重的測定方法，采用千粒法測定其帶莢千粒重。

1.4 種子發芽力測定

參考《草種子檢驗規程發芽實驗(GB/T 2930.4-2017)》[20]，發芽試驗采用紙上發芽法。從去掉莢果的充分混合的凈種子中隨機數取種子，每重復100粒，重復4次，整齊擺放在鋪有2張濾紙的培養盒(12 cm×12 cm)中，預先4℃冷凍7 d后置于變溫為20℃/30℃、光暗周期為16 h/8 h的光照培養箱中培養，從第2 d開始記錄，期間保持濾紙濕潤，第10 d后連續沒有種子發芽，故第14 d為末次計數時間，第4 d計算發芽勢，第10 d測定根長，并計算發芽指數、發芽率。

1.5 種子營養成分測定

取不同紅豆草材料種子于105℃烘箱中烘干至恒定質量后在研缽中磨碎，取樣測定相關指標，各指標重復3次。粗蛋白含量采用凱氏定氮法測定，淀粉含量采用蒽酮顯色法測定[21]，使用全自動脂肪測定儀(1804190S)測定粗脂肪，磷含量采用氫醌-亞硫酸鈉比色法測定，含水量采用我國農業部頒布的GB3543-83《農作物種子檢驗規程》中的105℃低恒溫烘干法測定[22]。

1.6 統計分析

采用多功能種子分析儀進行種子圖像采集和特征獲取，應用Microsoft Excel 2010軟件整理數據，計算各表型指標的平均值和變異系數(平均值±標準誤)，SPSS19.0軟件對表型數據進行單因素方差統計分析、相關性分析、主成分分析和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 紅豆草種子形態特征差異分析

由表1和圖1可知，不同來源紅豆草種子的面積、周長、長度、寬度、千粒重、根長、種皮色澤存在顯著差異(P<0.05)。種子面積均值為8.20 mm2，變化幅度為6.83～9.21 mm2，其中10295號面積最小，2668號最大，后者是前者的1.35倍；周長均值為10.91 mm，變化幅度為10.00～11.65 mm，其中10295號周長最小，9155號最大，后者是前者的1.17倍；長寬比均值為1.35，變化范圍為1.31～1.40，其中2323-1號長寬比最小，13709號最大；長度均值為3.88 mm，變化范圍為3.60～4.20 mm，其中10295號長度最短，9155最長，后者是前者的1.17倍；寬度均值為2.88 mm，變化幅度為2.60～3.07 mm，其中10295號種子最窄，2668號最寬，后者是前者的1.18倍；千粒重均值為21.40 g，其中6號最輕(16.50 g)，是平均值的0.77倍，GS最重，達25.30 g，是平均值的1.18倍；第10 d根長均值為6.32 cm，1668號可達10.27 cm。

表1 紅豆草種子主要形態特征參數Table 1 Main morphological characteristic parameters in sainfoin seeds

2.2 紅豆草種子營養成分和發芽指標差異分析

由表2可知，不同來源紅豆草種子主要營養成分含量差異顯著(P<0.05)。其中種子粗脂肪含量變化幅度為5.56%～11.38%，GS粗脂肪含量最低，9699號最高，后者是前者的2.05倍；種子淀粉含量變化范圍為4.84～24.71 mg·g-1，2049號淀粉含量最低，1994號最高，后者是前者的5.11倍；種子粗蛋白變化范圍為15.86%～19.97%，2323-1號種子粗蛋白含量最低，GS最高；磷含量MN最高；平均含水量為4.63%；9977號發芽勢和發芽率均最高，7456反之。比較紅豆草種子各形態指標和營養指標變異系數發現，種子形態指標的變異系數變化幅度為9.1%～18.6%，平均11.56%，而營養成分含量變異系數變幅為6.7%～20.4%，平均為12.18%。

圖1 供試22份紅豆草種子測量圖Fig.1 The survey sheet of twenty-two tested sainfoin seeds

表2 紅豆草種子主要營養成分含量Table 2 Main nutrients contents in sainfoin seeds

2.3 紅豆草種子特征參數的相關性分析

由表3可知，紅豆草種子形態特征參數間和各營養成分含量指標間存在一定的相關性。其種子面積與種子周長、長度、寬度呈極顯著正相關(P<0.01)；種子周長與種子長度、寬度呈極顯著正相關(P<0.01)；種子長度與種子寬度呈極顯著正相關(P<0.01)；種子千粒重與種子面積、寬度呈極顯著正相關(P<0.01)，與種子周長、長度呈顯著正相關(P<0.05)，與種子長寬比呈極顯著負相關(P<0.01)，與種子中粗脂肪含量呈顯著負相關(P<0.05)。

2.4 紅豆草種子特征參數主成分分析

以上分析表明，紅豆草種子不同特征參數間具有豐富的關聯性，為深層解釋其變化的主要原因，以種子形態特征和營養成分含量均值為指標，對22份紅豆草種質的種子進行主成分分析。表4中前3個主成分累計方差達到了83.477%，因此可以選擇這3個主成分進行提取分析。

表3 紅豆草種子主要特征參數間相關系數Table 3 Correlation coefficients among main characteristic parameters of sainfoin seeds

表4 紅豆草種子性狀的特征值與主成分貢獻率Table 4 Characteristic values and contribution rates of principal components of sainfoin seeds

由表5可得出第1主成分得分y1、第2主成分得分y2和第3主成分得分y3。方程為：y1=0.516x1+0.508x2+0.502x3+0.471x4+0.403x5-0.328x6-0.077x7+0.165x8-0.254x9

(1)

y2=0.022x1+0.078x2+0.104x3+0.184x4-0.254x5+0.337x6+0.638x7+0.324x8-0.073x9

(2)

y3=0.143x1+0.221x2+0.261x3+0.357x4-0.249x5+0.412x6-0.085x7-0.677x8+0.570x9

(3)

Z=0.55099×y1+0.15380×y2+0.12998×y3

(4)

在第1主成分上載荷量較大的因子由大至小依次是種子寬度、種子面積、種子周長、種子長度和千粒重，集中反映了種子的形態特征；在第2主成分上載荷量較大的因子由大至小依次為粗蛋白和淀粉含量，基本反映了種子的營養成分含量特征；在第3主成分上載荷量較大的因子是粗脂肪和長寬比。主成分分析結果顯示，影響紅豆草種子的主要性狀是種子形態特征中的寬度、面積和周長，其次為營養指標中的粗蛋白和淀粉含量。根據第1、第2、第3主成分的貢獻值，可分別計算第1、第2、第3主成分的得分，并根據得分和權重(方差貢獻率)的乘積得出綜合得分(2)，具體計算公式分別為(1)，(2)，(3)和(4)。

表5 各指標主成分載荷矩陣Table 5 Principal component load matrix of each index

表6對22份紅豆草種子材料進行主成分綜合得分排名可知，編號2668，9155，GS，MN，13523，2323-2和1994綜合排名較前。

2.5 聚類分析

以紅豆草種子發芽力、形態特征和營養成分含量為指標，對22份紅豆草種子進行聚類分析，結果如圖2所示。根據聚類圖可將供試22份種質種子劃分為3組，第1組包括11份材料，編號分別為1626，1668，GS，13523，2208，2668，MN，1994，2049，9860和9977，其特點是種子發芽力較強、較大較圓、重量較重、主要營養成分含量較高；第2組次之，材料有9699，6，2323-2，9602，1，9155，10295和2323-1；第3組有3份材料，為2559，7456和13709，其特點是種子形態指標偏小，發芽力較弱。說明這3組材料間具有明顯差異，這與前面的方差比較結果相符合，為進一步研究選育優良紅豆草種質提供了基礎依據。

表6 主成分得分和綜合得分Table 6 Principal component score and comprehensive score

圖2 供試的22份紅豆草種子的聚類圖Fig.2 The cluster dendrogram of twenty-two tested sainfoin seeds

3 討論

在農業生產中，種子是最基本的生產資料，是植物遺傳和變異的載體[23]，而牧草種質資源在長期的突變、基因交流、隔離和遺傳分化的演化進程中，經過選擇蘊藏著豐富的基因資源，具有物種多樣性和遺傳多樣性，對于植物的栽培利用具有極為重要的意義[24]。而我國每年需要大量的牧草種子，自主培育品種少且質量不高，如果僅靠進口或野外收集，則不能滿足我國草地建設的要求，因此，培育出具有我國特色的優良牧草種子在生產實踐中則顯得非常重要。

方升佐等[25]研究表明，不同種源種子生長的環境條件(包括氣候和土壤條件)不同，種子中營養成分的積累也有所不同，從而影響種子品質的優劣。李娟等[26]的研究表明，不同種源閩楠(Phoebebournei)種子部分特征參數形態和主要營養成分含量變異由各環境因子綜合作用造成。但關于造成種子形態特征和營養成分含量差異的主要原因是自身遺傳變異特性還是外界環境因素尚不清楚，以至于不能完全辨析種子形態特征和營養成分含量的變異模式，科學準確的對各個種源進行劃分。本試驗表明，國內外22份紅豆草種子的形態特征和營養成分含量差異顯著。因22份材料種植于同一塊試驗田(武威黃羊鎮牧草試驗站)，其氣候、海拔、土壤等環境條件一致，可大致排除外界環境因素對種子形態和營養含量的影響，推測造成這種差異的主要因素是由種子的遺傳特性決定，這與張文標等[27]對導致同一區域夏臘梅(Calycanthuschinensis)果實和種子形態變異差異較大的因素可能與其母株個體的差異、果實和種子的生長位置等結論相似。

本研究相關分析表明，紅豆草種子形狀越近似圓形，種子內營養物質越多，則種子越重，這與眾多學者研究結果一致[28-30]。此外，本研究還發現紅豆草種子發芽率與種子面積、周長、長寬比、水分均呈一定的負相關關系，這可能是因為種子越小越圓，含水量很少，組織之間變得緊密堅實，其相對表面積越大，保水和吸水能力強，使得其發芽率較高。這與楊潔晶等[31]、宗文杰等[32]、張蕾等[33]認為小粒種子具有較高萌發率的研究結論相一致。

一般認為，種子內含營養物質越高，發芽迅速且整齊[34-35]。但在本研究中，成熟后的紅豆草種子中粗蛋白、粗脂肪和淀粉與其發芽率、發芽勢、發芽指數沒有顯著的相關性。種子的粗脂肪含量與粗蛋白含量、淀粉含量均呈不顯著負相關，其原因可能與紅豆草種子的儲存條件或后熟有關，一些破損種子入庫后導致脂肪的酸敗或種子后熟不完全，只有少量的糖類轉化為脂肪。因此，對紅豆草種質優良性狀的選擇和親緣關系的分類還需進一步進行田間試驗并從分子水平上進行深入探討。

4 結論

編號10295，2668，‘甘肅紅豆草’，9860，9155，‘蒙農紅豆草’，13709，1994，9977，7456的種子發芽力、形態性狀和主要營養成分含量方面與其他材料間存在顯著差異；而材料13523，2049，1994，1626，‘蒙農紅豆草’的綜合表現較好，其種子較圓、重量較重、主要營養成分含量較高、發芽力較強。研究結果為進一步研究紅豆草的遺傳多樣性和選育等提供基礎資料。