發根農桿菌介導的白花草木樨毛狀根轉化體系的建立

王升升， 段 珍， 張吉宇

(蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室， 蘭州大學草地農業科技學院， 甘肅 蘭州 730020)

草木樨(Melilotusspp.) 是一年生或兩年生的豆科(Leguminosae)草本植物[1-2]，全世界共有 19 種，主要分布于歐亞大陸地中海區域、東歐和亞洲，白花草木樨是該屬最廣泛的栽培種之一[3-4]。草木樨適應環境能力強，可在許多牧草難以生長的鹽堿等地區種植，且具有較強的抗逆性，其中抗鹽和耐寒的能力在主要豆科牧草中尤其突出[5-6]。草木樨作為栽培面積僅次于紫花苜蓿的優良豆科牧草，營養價值十分豐富，其中粗蛋白質和粗脂肪的含量較高，并含有大量的胡蘿卜素和礦物質等，是家畜的優良飼草[7-8]。草木樨根系發達，既能夠固定空氣中的氮氣(N2)，改善土壤肥力，又可以保持土壤，防治水土流失[9]。目前對于草木樨的研究主要集中在栽培技術研制[10]、化學成分鑒定[11]、分子標記開發[12]及草木樨屬植物遺傳多樣性評價[13]等方面。駱凱等[14]從國內外引進了100份兩年生的草木樨種質進行了農藝性狀初步評價并分析了19份種質的品質性狀；Di等[15]對草木樨屬植物的形態學以及系統進化進行了研究；剡轉轉等[16]在白花草木樨中大規模開發設計了EST-SSR分子標記，進一步篩選了多態性高的標記；狄紅艷等[17]分析了18個地理種群的黃花和白花草木樨的ITS序列和葉綠體trnL-trnF序列，研究了這兩種草木樨之間的系統進化關系。但是，關于草木樨的突變體[18]和分子機制方面研究較少，Luo[19]和Wu[1]對草木樨的轉錄組和miRNAs進行了相關分析，但因為草木樨缺乏遺傳轉化方法，限制了對其基因功能的深入研究。

發根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)是一種根瘤菌科的革蘭氏陰性土壤桿菌，其攜帶的Ri質粒能夠侵染幾乎所有的雙子葉植物和少數單子葉植物，誘導植物受傷部位長出毛狀根，并產生大量有效的次生代謝產物[20]。目前，發根農桿菌介導的毛狀根轉化體系已成功應用到蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)[21]和大豆(Glycinemax)[22]等豆科植物中，用于驗證結瘤等相關基因的功能。ROP6是小GTPases亞家族ROP基因家族的成員，已證實該基因在百脈根(Lotusjaponicus)[23]和蒺藜苜蓿[24]中正向參與共生固氮信號轉導途徑，但在草木樨中尚未研究。本研究以白花草木樨結瘤基因MaROP6為例，開發了一套高效的白花草木樨毛狀根轉化體系，為深入研究草木樨的基因功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1植物材料 白花草木樨野生型Ma389(種子由加州大學洛杉磯分校的Hirsch教授友情提供)。

1.1.2菌株與質粒 發根農桿菌K599菌株(由中國科學院遺傳與發育生物學研究所謝旗研究員課題組友情提供)；DH5α大腸桿菌感受態(購自北京全式金生物公司)；表達載體質粒pBI121-DsRed2，該載體帶有DsRed2紅色熒光蛋白標記基因(購自武漢淼靈生物公司)。

1.1.3培養基 LB培養基(1 L)：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCL10.0 g，PH=7.4(固體培養基加15.0 g瓊脂)；

0.85%瓊脂的培養基(1 L)：瓊脂8.5 g；

1/2MS培養基(1 L)：MS(Murashige & Skoog Basal Medium With Vitamins)2.22 g，蔗糖8.0 g，PH=5.8(固體培養基加7.0 g瓊脂)；

營養液(1 L)參考陳安樂[25]：25 mg FeSO4·7H20，33.5 mg EDTA-Na2，98.6 mg MgS04·7H20，69.7 mg K2SO4，117.6 mg CaCl2·2H2O,34.8 mg K2HPO4，0.711 mg H3BO3，0.445 mg MnCl2·4H2O，0.037 mg CuSO4·5H20，0.102 mg ZnCl2，0.012 mg Na2MoO4·2H20；

滅菌條件：121℃，30 min。

1.1.4實驗引物 使用SnapGene軟件和DNAMAN軟件設計本實驗所需的引物。MaROP6-1為MaROP6和pBI121-DsRed2的融合引物，上下游分別帶有XbaI和BamH I酶(TaKaRa)切位點，用于克隆MaROP6全長片段。MaROP6-2為嵌合引物，上游取于表達載體pBI121-DsRed2，下游取于基因MaROP6，用于轉基因毛狀根的檢測。MaROP6-3和Maβ-tubulin[1](內參基因)用于qR7-PCR檢測。引物合成由北京擎科生物公司完成。

表1 PCR和qRT-PCR引物名稱、序列和用途Table 1 PCR and qRT-PCR Primer name,sequence and use

1.2 試驗方法

1.2.1RNA的提取與cDNA的合成 按照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(生工生物公司)的說明書，提取白花草木樨野生型Ma389的根以及轉MaROP6的毛狀根總RNA，使用TIANScript II RT Kit反轉錄試劑盒(天根生化公司)進行cDNA的合成，分別用于MaROP6全長片段的克隆以及MaROP6表達量的測定。

1.2.2MaROP6全長片段的克隆與載體構建 根據本課題組前期完成的草木樨基因組數據(BioProject ID:PRJNA674670)獲得MaROP6的CDS序列。使用融合引物MaROP6-1和Prime STAR HS高保真酶(TaKaRa)對MaROP6全長片段進行PCR擴增，使用限制性內切酶XbaI和BamHI對表達載體pBI121-DsRed2進行雙酶切，將擴增產物和酶切產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物公司)進行切膠回收。

用ClonExpress MultiS無縫克隆試劑盒(諾唯贊生物公司)將載體和MaROP6的回收產物連接在一起，使用大腸桿菌感受態細胞DH5α轉化連接產物后，用50 mg L-1卡那霉素(Kan)的LB固體培養基涂板，37℃培養箱培養至過夜，挑選陽性單克隆后測序，測序正確后用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒(生工生物公司)進行質粒pBI121-DsRed2-MaROP6的提取。

1.2.3MaROP6基因序列的生物信息學分析 將MaROP6序列提交到Expasy(http://www.expasy.org/tools/)，分析其氨基酸數目、分子量和等電點等理化性質。MaROP6基因的外顯子-內含子結構在Gene structure display server(GSDS,http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)上進行鑒定。利用DNAMAN軟件對MaROP6基因的CDS和氨基酸序列進行比對。

1.2.4pBI121-DsRed2-MaROP6載體轉化發根農桿菌K599 制備發根農桿菌K599感受態，使用電激轉化法將構建的載體pBI121-DsRed2-MaROP6轉入發根農桿菌K599感受態，在28℃搖床200 rpm復蘇3 h后，使用50 mg·L-1Kan和50 mg·L-1鏈霉素(Stre)的LB固體培養基篩選陽性單克隆，使用50 mg·L-1Kan和50 mg·L-1Stre的LB液體培養基在28℃，200 rpm培養2 d后，OD=1.8左右，用50%的甘油保菌于—80℃備用，用于白花草木樨毛狀根轉化。

1.2.5切根侵染法誘導白花草木樨毛狀根 農桿菌活化及培養。取保存于—80℃分別含有pBI121-DsRed2載體和pBI121-DsRed2-MaROP6載體的K599菌液200 uL，均勻涂板于含50 mg·L-1Kan，50 mg L-1Stre的LB固體培養基中，28℃倒置培養2 d(圖1A)備用。

種子處理。將白花草木樨Ma389種子，用濃硫酸處理3 min后，使用滅菌水清洗五次，用75%的乙醇處理30 s，5%的次氯酸鈉溶液處理5 min后，使用滅菌水清洗五次，在超凈工作臺中均勻的點在0.85%瓊脂培養基上。每次實驗可使用100粒種子。

種子萌發。將其置于4℃的冰箱春化2 d，再放置于25℃培養箱(16 h光照/8 h黑暗)培養3 d，待幼苗長出兩片子葉，下胚軸為5 mm左右時，進行侵染(圖1 B)。

外植體準備。在超凈工作臺中，準備兩個無菌培養皿，其中一個中加入少量無菌水，鑷子和手術刀用酒精燈消毒后，等恢復至正常溫度時，用鑷子輕輕夾取幼苗至空的培養皿中，用手術刀在根尖往上5 mm處快速切斷，然后放于含有少量無菌水的培養皿中，防止萎蔫。

切根侵染。用鑷子夾取已切根的幼苗，在滅菌濾紙上吸去多余的水分，輕輕劃過菌膜，蘸取少量的農桿菌后，將其放置于不含抗生素的1/2 MS培養基上(圖1 C)，每個培養基中放12株，用封口膜封住培養基，并用錫箔紙外包進行暗處理，立放在22℃組培室(16 h光照/8 h黑暗)3 d。

幼苗除菌。在超凈工作臺，將幼苗從暗處理條件下拿出，將其放置于含有250 mg·L-1頭孢噻肟鈉(Caf)和250 mg·L-1羧芐青霉素(Car)的滅菌水中，在28℃搖床120 rpm除菌30 min，在超凈工作臺中，用滅菌水清洗三遍后，將其放在含有250 mg·L-1Caf和250 mg·L-1Car的1/2 MS培養基上，并采用濾紙-幼苗-濾紙的結構進行放置(圖1 D)，每個培養基放7株，用封口膜封住培養基，立放在22℃組培室(16 h光照/8 h黑暗)5 d。

幼苗液體培養。將幼苗從固體培養基中移入營養液中(圖1 F)，放置在22℃組培室(16 h光照/8 h黑暗)，等待幼苗長出發根，在這期間，營養液每2～3 d補充一次，每5 d更換一次，以免因為農桿菌的繁殖而影響植物生長。

圖1 草木樨毛狀根轉化Fig.1 Hairy roots transformation in Melilotus albus注：A：帶有pBI121-DsRed2-MaROP6的發根農桿菌；B：5 d幼苗及幼苗切根位置；C：幼苗切根處蘸取農桿菌后放在1/2 MS培養基上；D：幼苗轉移至含有250 mg·L-1Caf和250 mg·L-1Car的1/2 MS培養基；E：幼苗切根處膨大；F：幼苗轉移至液體培養基；G：幼苗長出毛狀根；H：幼苗長出側根；I：毛狀根在共聚焦激光掃描顯微鏡下出現紅色熒光。紅色箭頭指示切面；藍色箭頭指示側根；標尺為1 cm和100 μm(I)Note:A:Agrobacterium rhizogenes with pBI121-DsRed2-MaROP6;B:5-day seedling and seedling root cutting position;C:Dipping Agrobacterium at the root cutting part of the seedling and putting the seedling on a 1/2 MS culture medium;D:Transferring the seedlings to a 1/2 MS medium containing 250 mg·L-1 cephalosporin and 250 mg·L-1 carbenicillin;E:expanding at the cut root locus of the seedlings;F:Transferring seedlings to a liquid culture medium;G:Hairy roots grow from seedlings;H:Lateral roots grow from seedlings;I:Red fluorescence appeared in hairy roots under confocal scanning laser microscope. The sectioned surfaces are indicated by red arrows;the lateral roots are indicated by blue arrows. Scale bars=1 cm and 100 μm (I)

1.2.6毛狀根的繼代培養 選擇生長迅速、粗壯的3～5 cm的新生毛狀根，用無菌手術刀切取1～2 cm的根尖，轉移至含有250 mg·L-1Caf和250 mg·L-1Car的1/2 MS培養基上，使根尖緊貼在培養基的表面,每個培養基放7條毛狀根。將其置于25℃黑暗培養，每4～5 d將根系轉移至新的繼代培養基中，以自然生長的根作為對照，連續培養30 d。

1.2.7PCR檢測MaROP6轉基因毛狀根的轉化率 使用M5超光速Mix試劑盒(北京聚合美生物公司)和嵌合引物MaROP6-2進行PCR檢測，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。草木樨毛狀根轉化率=(陽性毛狀根數量/毛狀根數量)×100%。

1.2.8qRT-PCR測定轉基因毛狀根中MaROP6的表達量 按照Hieff qPCR試劑盒(元升生物公司)的說明書，使用引物MaROP6-3和Maβ-tubulin進行qRT-PCR測定轉基因毛狀根中MaROP6的表達量。每組實驗設置三個生物學重復，使用2-ΔΔCT[26]方法計算相對表達量。

2 結果與分析

2.1 MaROP6基因的克隆與載體構建

基因CDS序列為594 bp，編碼198個氨基酸，蛋白質分子量為21.604 kDa，等電點為9.32。MaROP6基因結構顯示，MaROP6是由七個外顯子和六個內含子組成(圖2)。

MaROP6屬于小G蛋白ROP基因家族，它的蛋白包含Zheng等[27]提出的七個功能域(圖3)，GTPase域(I和III)，GDP/GTP結合域(IV和VI)和效應域(II)都是高度保守的，但插入區(V)和C端區(VII)是可變的。

圖2 MaROP6基因結構Fig.2 MaROP6 gene structure

圖3 MaROP6的CDS和氨基酸序列Fig.3 CDS and amino acid sequence of MaROP6注：*為終止密碼子，Ⅰ-Ⅶ為MaROP6蛋白的七個功能域Note:* represents the Stop Codon,Ⅰ-Ⅶ are the seven functional domains of MaROP6 protein

以白花草木樨cDNA為模板，用MaROP6-1融合引物進行PCR擴增，在500 bp到750 bp之間發現有清晰的條帶出現，測序結果顯示與白花草木樨基因組數據完全符合，同時將載體pBI121-DsRed2雙酶切后備用(圖4)。

因為MaROP6-1的引物兩端帶有載體的同源

圖4 pBI121-DsRed2和MaROP6全長片段及 pBI121-DsRed2-MaROP6Fig.4 pBI121-DsRed2 and full length of the MaROP6 and pBI121-DsRed2-MaROP6注：條帶1為pBI121-DsRed2質粒，條帶2為酶切后的pBI121-DsRed2質粒，條帶3為克隆的MaROP6全長全段，條帶4為pBI121-DsRed2-MaROP6質粒Note:Band 1 is pBI121-DsRed2 plasmid,band 2 is the vector after restriction digestion,band 3 is the full length of the cloned MaROP6,band 4 is pBI121-DsRed2-MaROP6 plasmid

片段，所以無縫連接酶可以將基因與載體上的同源片段融合，使二者連接在一起(圖5)。

圖5 pBI121-DsRed2-MaROP6表達載體構建示意圖Fig.5 Schematic diagram of pBI121-DsRed2-MaROP6 expression vector construction

2.2 毛狀根的獲得與繼代培養

幼苗暗處理后，可以清晰的看到幼苗的切根處開始膨大，并且在不含抗生素的1/2 MS固體培養基上，可以觀察到幼苗切根處繁殖的發根農桿菌(圖1C)。幼苗進行除菌，在含有250 mg·L-1Caf和250 mg·L-1Car的1/2 MS固體培養基上生長5天后，可以看到幼苗的切根處比之前更加膨大(圖1E)。

將幼苗轉移到液體培養基中繼續生長，在營養液中培養4～5 d時，可以觀察到部分幼苗出現了毛狀根(圖1F)，7 d左右時，幼苗的毛狀根則可以生長到4～5 cm，并且可以看到在幼苗的切口處有側根的出現(圖1 H)。并且在共聚焦激光掃描顯微鏡下，可以看到轉基因毛狀根中載體pBI121-DsRed2所特有的紅色熒光(圖1 I)。

將轉化的毛狀根的1～2 cm的根尖置于繼代培養基中培養，每1～2 d觀察一次毛狀根的生長狀況。自然生長的根在繼代培養基中生長緩慢，5 d左右時根系逐漸變成褐色最終死亡(圖6A)，轉化的毛狀根在繼代培養基中生長迅速，2 d左右時可觀察到根尖伸長(圖6B)，7 d左右時可觀察到根系有大量側根長出(圖6C)，繼代培養30 d后，根系大量繁殖，長滿培養皿(圖6D)。

圖6 毛狀根在繼代培養基上的培養Fig.6 Cultivation of hairy roots on subculture medium注：A：自然生長的根尖繼代培養；B：毛狀根的根尖繼代培養；C：毛狀根繼代培養7 d時的生長狀況；D：毛狀根繼代培養30 d時的生長狀況。標尺為1 cmNote:A:Subculture of natural root tips;B:Subculture of hairy root tips;C:Growth of hairy roots in subculture for 7 days;D:Growth of hairy roots in subculture for 30 days. Scale bars=1 cm

2.3 毛狀根的發生率

通過統計100株轉化后白花草木樨幼苗長出毛狀根的數量，來計算毛狀根的發生率，實驗重復三次，發現平均有78株白花草木樨的幼苗在切口處能長出毛狀根，計算出白花草木樨毛狀根的發生率為78.00±2.00%。隨機挑選24株出現毛狀根的白花草木樨幼苗，統計出1株上平均有4.04±1.55條毛狀根。

2.4 毛狀根的轉化率

隨機挑選24株長出毛狀根的幼苗，從幼苗的切口處取毛狀根，用PCR來鑒定毛狀根的轉化率，實驗重復3次，如圖7所示，24株白花草木樨毛狀根中能檢測出17株有條帶，計算出白花草木樨毛狀根的轉化率為70.80±4.20%。

圖7 轉基因毛狀根的檢測Fig.7 Detection of transgenic hairy roots注：24株毛狀根中轉基因毛狀根鑒定的PCR擴增結果，陽性對照為pBI121-DsRed2-MaROP6重組質粒，陰性對照為dd水和空載體轉化株Note:PCR amplification results for identification of transgenic hairy roots among 24 hairy roots,The positive control is pBI121-DsRed2-MaROP6 recombinant plasmid,and the negative control is dd water and empty vector transformant

2.5 轉基因毛狀根中MaROP6的相對表達量

使用引物MaROP6-3和內參Maβ-tubulin，以空載體轉化的草木樨為對照，進行qRT-PCR實驗，來計算白花草木樨轉基因毛狀根中MaROP6的表達量。如圖8所示，17株的陽性根中，MaROP6最低和最高相對表達量分別為對照的6.70倍和134.83倍，平均表達量為對照的36.87倍。

圖8 轉基因毛狀根中MaROP6的表達水平Fig.8 The expression level of MaROP6 in transgenic hairy roots

3 討論

3.1 發根農桿菌的應用及切根侵染法誘導毛狀根的形成

自Smith和Townsend在1907年發現發根農桿菌能誘導植物形成毛狀根以來[28]，通過研究其侵染植物的原理及優化不同植物的轉化方法，目前已經在160多種植物中成功利用發根農桿菌侵染獲得了轉基因毛狀根[29]。陳安樂[25]使用K599菌株在大豆中建立了高效的毛狀根轉化體系，使得大豆幼苗在侵染一周后就產生了毛狀根，通過該方法介導GmFRD3基因在大豆中過表達，使得轉基因毛狀根的耐鋁性得到極大的提高；陳燕等[30]在百脈根中建立了毛狀根轉化體系，在百脈根子葉侵染后的10 d左右，即可獲得轉基因毛狀根；王天佐等[31]在花苜蓿中建立了高效的毛狀根轉化體系，在一周左右即可獲得轉基因毛狀根，毛狀根的轉化率可達到66.7%；劉佳[32]以苦參的不同部位作為外植體，和四種發根農桿菌作為轉化菌株，最終建立了以子葉節為外植體的高效苦參毛狀根轉化體系，在四周后即可獲得長勢良好的毛狀根。發根農桿菌誘導植物產生的轉基因毛狀根，因為具有生長速度快、分化程度高、遺傳穩定性強和操作簡便等特點[33]，現已廣泛應用在改良植物品種和植物基因工程等領域[34]。

切根侵染法是建立毛狀根轉化體系常用的方法之一，是在無菌環境下將原植物的根切除后，利用發根農桿菌介導在植物的切口處長出轉基因毛狀根，使用該方法產生的植物為嵌合植物，即地上部分是非轉基因的，而根是轉基因的[35]。使用切根侵染法獲得轉基因毛狀根比使用根癌農桿菌獲得轉基因株系更加快速、簡便，且切根侵染法作為分子生物學的研究手段，在無雜菌環境中培養的毛狀根可以作為轉基因的無菌苗進行后續實驗研究，Si等[36]利用切根法將發根農桿菌轉化蒺藜苜蓿，研究了MtDGD1在蒺藜苜蓿根瘤發育和共生固氮過程中的重要作用。

3.2 白花草木樨毛狀根轉化關鍵點分析

3.2.1侵染幼苗苗齡的選擇 白花草木樨種子萌發所用的培養基為0.85%水瓊脂培養基，能為種子萌發提供足夠的濕度和營養物質，白花草木樨種子的萌發率高，從萌發到進行切根侵染大約需要5 d，幼苗過小進行侵染，則容易被農桿菌侵染致死，出現幼苗顏色變為褐色的現象；幼苗過大進行侵染，則會降低毛狀根的發生率和轉化率；以剛長出兩片子葉苗齡大約為5 d的幼苗進行切根侵染效果最佳。

3.2.2暗處理時長 幼苗進行切根侵染后需要進行暗處理，暗處理時間少于3 d時，幼苗沒有明顯的切根處開始膨大的特征，處理時間多于5 d時，幼苗會出現幼苗的切根處變細、變軟和變白的現象，這都會阻礙毛狀根的形成，所以幼苗暗處理的時間為3～4 d最佳，培養基上有明顯的農桿菌繁殖的現象，但不足以影響幼苗正常生長，且幼苗的切根處有明顯膨大的特征。

3.2.3除菌條件的優化 幼苗暗處理后需要進行除菌處理，參考宗曉秋[37]大豆的除菌條件，設置單一抗生素Caf(250 mg·L-1或500 mg·L-1)或Car(250 mg·L-1或500 mg·L-1)時，培養基上出現農桿菌的單菌落，幼苗表面也有過度生長的農桿菌；設置250 mg·L-1Caf和250 mg·L-1Car時，培養基中沒有出現農桿菌的單菌落，且毛狀根生長旺盛；幼苗設置250 mg·L-1Caf和500 mg·L-1Car或500 mg·L-1Caf和250 mg·L-1Car時，培養基中雖然沒有農桿菌的單菌落，但幼苗生長緩慢，毛狀根生長減緩，顏色逐漸變為褐色。所以，幼苗除菌時選擇250 mg·L-1Caf和250 mg·L-1Car的滅菌水，在28℃搖床120 rpm除菌30 min，最后放置于含250 mg·L-1Caf和250 mg·L-1Car 1/2 MS培養基上的效果最佳。幼苗采用濾紙-幼苗-濾紙的結構放置在除菌培養基上，可以使幼苗更加充分的接觸培養基，且豎直放置時不會使幼苗跌落而影響生長。

綜合來看，采用切根侵染法誘導白花草木樨毛狀根的產生，可以在兩周左右獲得轉基因毛狀根，這比用根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系得到轉基因植株要更加快速和簡便。

3.3 白花草木樨毛狀根轉化效率分析

對轉MaROP6基因毛狀根的發生率和轉化率進行統計，實驗設置三個重復，計算出毛狀根的發生率和轉化率分別為78.00±2.00%和70.80±4.20%。相對于豆科植物中百脈根52.60±6.30%和紫花苜蓿52.20±6.40%的轉化率[36]，白花草木樨的轉化率明顯更高，與毛苕子75.00±4.80%[35]和花苜蓿66.70%[31]的轉化率相比相差不大，表明白花草木樨是易于轉化的豆科植物。qRT-PCR結果表明轉基因毛狀根中MaROP6的平均表達量為對照的36.87倍，而花苜蓿轉基因根中MrbZIP66的平均表達量為對照的34.13倍[31]，低于白花草木樨。這就表明本實驗建立的毛狀根轉化體系是一種高效的轉化體系，可以用于白花草木樨基因功能的驗證。

白花草木樨毛狀根的發生率和轉化率都在70%以上，且超表達MaROP6的相對平均表達量為對照的36.87倍。這就表明利用發根農桿菌介導的白花草木樨毛狀根轉化可以作為一種快速簡便的白花草木樨生物技術手段。

3.4 白花草木樨毛狀根誘導再生植株前景分析

目前草木樨尚未建立穩定的遺傳轉化體系，如何將草木樨的毛狀根誘導出愈傷組織進而再生成完整轉化植株需要進一步的探索。參考玉米[38]和北玄參[39]的毛狀根體系誘導愈傷組織和再生植株的成功條件，首先需要優化毛狀根的誘導和培養方法，增加毛狀根的生物量，其次參考玉米、北玄參和其他豆科植物由毛狀根誘導愈傷組織和再生植株的培養基配方，對于6-BA和NAA等的用量需要進一步探索，最后要進一步驗證草木樨合適的品種作為轉基因植物的前體材料。通過毛狀根誘導建立穩定的草木樨遺傳轉化體系，為草木樨基因功能的深入研究提供強有力的手段，是目前迫切需要解決的問題。

4 結論

本研究以白花草木樨為材料，以結瘤基因MaROP6為例，采用切根侵染法建立了一種高效的白花草木樨毛狀根轉化體系，并成功獲得了轉MaROP6基因的毛狀根，毛狀根的發生率和轉化率分別可以達到78.00±2.00%和70.80±4.20%，且轉基因毛狀根中MaROP6的相對平均表達量可以達到對照的36.87倍，表明毛狀根轉化體系已經成功應用到白花草木樨結瘤基因的功能研究中。白花草木樨毛狀根轉化體系的建立為白花草木樨結瘤基因功能的研究提供了強有力的手段，并可能將其應用到抗逆基因功能的研究等其他領域，為草木樨基因功能的驗證和遺傳選育奠定基礎。