牛磺酸緩解H2O2誘導的雞胚肝細胞氧化損傷

何程實, 李春暉, 吳建鑫, 韋張其, 劉國慶, 楊少華

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

雞胚是研究動物發育的重要模型,已被大量用于發育生物學的研究。文獻[1]研究表明胚胎在發育過程中對外界刺激敏感,其中氧化應激是導致早期胚胎發育損傷的機制之一;文獻[2-4]證實動物在受到外界有害因素作用時,會發生機體代謝功能紊亂。肝臟作為動物體內最大的消化腺,分泌膽汁促進脂肪的分解與吸收,而且是一個極其重要的物質代謝器官,參與機體多種物質(如糖原、膽固醇,膽鹽、脂蛋白和血漿蛋白)的合成、貯存、代謝和轉化過程。同時,肝臟脂質代謝旺盛,極易發生代謝性氧化損傷。研究表明肝細胞能夠行使絕大部分肝臟的功能[5]。因此,越來越多的研究者采用體外培養肝細胞代替動物來研究某些物質的毒理作用或者代謝途徑。

雞胚早期發育過程中,發育相關基因的表達及功能與人類胚胎有著極高的相似性[6],因此非常適于研究胚胎發育的相關疾病。目前,已經建立了眾多雞胚細胞模型。文獻[7]建立了馬立克氏病毒感染雞胚成纖維細胞模型,為研究人參皂瞀及其衍生物的體外抗病毒作用及其機制奠定了基礎;文獻[8]建立了小鼠胚胎DNA氧化損傷模型,采用不同濃度H2O2培養小鼠受精卵,觀察其對小鼠胚胎發育能力的影響;文獻[9]建立了利用H2O2誘導產蛋雞原代肝細胞氧化應激模型,為后續研究和開發應用于蛋雞的抗氧化添加劑提供技術平臺和理論參考。然而,目前對于雞胚原代肝細胞氧化損傷模型的建立報道還很少。基于此,本實驗通過分離培養雞胚原代肝細胞,以H2O2為刺激源,以細胞相對存活率、胞內丙二醛(MDA)生產量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和過氧化氫酶(CAT)活性為判斷指標,探索H2O2處理雞胚原代肝細胞后,引起雞胚原代肝細胞氧化應激的合適處理濃度及處理時間,旨在建立穩定的雞胚原代肝細胞氧化損傷模型。

牛磺酸是雞胚發育過程中含量變化最大的氨基酸之一。有研究表明[10],在雞胚發育過程中,牛磺酸增長了20倍。牛磺酸是人和動物必需的氨基酸之一,它具有特殊的化學結構和生理功能,能夠參與細胞穩態、視網膜發育、抗氧化和應激反應等多種生理活動。在抗氧化方面,文獻[11]發現牛磺酸能夠有效地抑制神經受到的氧化應激傷害。然而,牛磺酸對雞胚氧化損傷是否有緩解作用的相關報道并不多。基于此,本文建立了雞胚肝細胞氧化模型,并添加牛磺酸,通過MTT法比較細胞活力的差異,探究牛磺酸對雞胚肝細胞受到氧化損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

胎牛血清(貨號16000044)購自Gibco公司;M199培養基、氫化可的松、轉鐵蛋白、胰島素、青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶消化液、無水乙醇、L-谷氨酰胺均購自北京索萊寶有限公司;自制PBS緩沖液;丙二醛、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;細胞培養板購自Coming公司。

1.2 儀器

SW-CJ-1D超凈工作臺(蘇州設備有限公司);BPN-50CH(UV)CO2培養箱、DHG-9000電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司);Ti-E/Ti-U/Ti-S熒光倒置顯微鏡(尼康公司);VersaMax酶標儀(美國Molecular Devices公司);DSX-280B高壓滅菌鍋 (上海申安醫療機械廠)。

1.3 方法

1.3.1 雞胚原代肝細胞的分離培養

參照文獻[12-13]雞胚肝細胞培養方法,加以改進。取大小差異不大、質量均等的孵化至16 d的雞胚蛋數枚,用無菌棉簽蘸取75%酒精擦拭雞蛋表面,隨后將雞胚蛋轉移至超凈工作臺內,點燃酒精燈。用鑷子將雞蛋殼敲碎,取出胚胎后置于滅菌培養皿中,斷頭,剪開胚胎腹部,用眼科手術剪刀和鑷子小心取出肝臟，放入4 ℃預冷過的 PBS緩沖液中,盡量擠壓出血液,洗滌3次。將肝臟組織轉移至新的培養皿中,剪成約l mm3大小的肝組織小塊,隨后用 PBS緩沖液沖洗2次,轉移至50 mL 離心管中,加入PBS緩沖液洗直至上清液中血液明顯減少。丟棄上清液,向沉淀中加入約為沉淀量3～4 倍體積的0.25% 胰酶和一定量的M199 細胞培養液(不含胎牛血清),于37 ℃水浴12 min。加入含有10%胎牛血清M199 培養基終止消化,用槍吹打以幫助組織塊消化完全,隨后用 100 μm 細胞過濾器過濾,過濾的細胞轉移至15 mL 離心管中,于100g離心5 min,離心完棄上清,加入5倍體積的 PBS 緩沖液吹勻后50g離心 5 min。棄上清液,加入 M199 完全培養基重懸細胞沉淀,將懸浮的肝細胞密度調至 5×105mL-1，以每孔100 μL 接種于0.01%多聚賴氨酸包被過的96孔培養板中。于37 ℃、5%CO2條件下培養,鋪板6 h后第1次換液,12 h后第2次換液,去除紅細胞和細胞碎片,以后每24 h換1次。

1.3.2 H2O2濃度區間的選擇

待細胞長至60%～70%融合狀態時,將所培養的細胞隨機分為8組,即正常組(無H2O2處理)、對照組(H2O2處理濃度分別為5、10、15、20、25、30、35 mmol/L)7組,每組重復3次。正常培養48 h后,測定細胞活力,確定H2O2濃度合適的區間。

1.3.3 實驗分組

將H2O2濃度分為2、4、6、8、10、12 mmol/L,加上空白對照組,共7組。將處理時間分為1、2、4、8、24 h。每組重復3次。

1.3.4 肝細胞存活率的檢測

MTT法[14]檢測。待細胞培養48 h后,加入設定濃度的H2O2。分別培養雞胚肝細胞1、2、4、8、24 h。去除處理細胞培養液,換新鮮培養液,每孔加20 μL 5 g/L的MTT,37 ℃、5% CO2孵育4 h,棄培養液及MTT,每孔加100 μL二甲基亞砜(DMSO)溶解藍紫色結晶,震蕩10 min,用酶標儀測定各孔在570 nm波長處的吸光度值。

1.3.5 PI染色

碘化丙啶(propidiumiodide,PI)是一種核酸染料,它不能穿透完整細胞膜,但能夠穿透晚期凋亡細胞和死細胞的破損細胞膜,并使細胞核紅染。PI染色雞胚肝細胞經過一段時間的H2O2誘導后棄去細胞培養液,用PBS洗滌細胞3次,重新加入含有PI的細胞培養液,保持PI的質量濃度為5 μg/mL,染色時間為20 min。棄去細胞培養液,PBS洗滌細胞3次,置熒光顯微鏡下觀察。

1.3.6 MDA、SOD、CAT的測定

不同濃度H2O2處理肝細胞一段時間后,無菌PBS清洗細胞3遍,將細胞鏟下,收集到15 mL離心管,1 000 r/min,離心10 min,收集細胞球,加1 mL PBS,細胞破碎儀破碎,12 000 r/min離心,收集上清液為待測樣本。參照相應試劑盒說明書,測定細胞內MDA產生量、SOD和 CAT活性,測定方法分別為TBA法、WST-1法和可見光法。

1.4 牛磺酸對氧化應激的抑制作用

1.4.1 藥物安全濃度的確定

提取分離的好雞胚肝細胞,將其密度調至5×105個/mL,接種到96板中,每孔添加100 μL,放置于37 ℃、5%CO2的培養箱培養24 h,換液清洗去除紅細胞和細胞碎片。然后分別加入濃度分別為6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00 mmol/L的牛磺酸,每個濃度重復3次。同時設置空白對照組,即只添加細胞生長液。繼續培養24 h,待細胞長至融合狀態時，每孔加入20 μL MTT溶液,孵育4 h。棄去培養液和MTT,加入100 μL的DMSO溶解藍紫色結晶。震蕩10 min,放置酶標儀上于570 nm處檢測吸光度。選擇吸光度不顯著小于正常培養細胞的濃度作為藥物培養的安全濃度。

1.4.2 雞胚肝細胞活力的檢測

將肝細胞接種到96孔板中,每孔100 μL,培養24 h后,按上述實驗選擇的安全濃度添加至含有牛磺酸的培養液作為實驗組,另設空白對照組和陰性對照組(只添加細胞培養液和H2O2),每組3個重復。繼續培養24 h后,除空白組,其余每組均添加6 mmol/L的H2O2。培養4 h后,加入MTT 20 μL孵育4 h,去掉培養液和MTT,加入100 μL DMSO。震蕩10 min,置于酶標儀上于570 nm處檢測吸光度。

1.5 統計分析

各組所得計量數據采用平均數±標準差(x±s)表示,用SPSS17.0 軟件處理數據,用完全隨機設計資料的方差分析,組間均數比較用SNK-q檢驗。P<0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 H2O2濃度區間的選擇結果

為了更好地建立氧化應激模型,需要選擇比較合適的H2O2濃度區間,因此預設了H2O2的濃度測定雞胚肝細胞的活力。H2O2濃度區間檢測結果如圖1所示。

圖1 不同濃度H2O2對細胞活性的影響

由圖1可知，H2O2的濃度為5 mmol/L時,A570與空白組相比有顯著差異。當H2O2濃度達到20 mmol/L以上時,吸光度只有空白組的1/2左右。因此本文選擇將0～15 mmol/L作為實驗的濃度區間。

2.2 H2O2處理對雞胚肝細胞活性的影響

為了探索不同濃度H2O2處理雞胚原代肝細胞一定時間后造成的損傷情況,分別準備了接種細胞的96孔板,以不同的濃度(0、2、4、6、8、10、12 mmol/L),經不同的處理時間(1、2、4、8、24 h),通過利用常規的MTT法檢測不同濃度H2O2在不同作用時間下對雞胚原代肝細胞的影響。H2O2處理細胞的致死率如圖2所示。

圖2 H2O2處理細胞的致死率

由圖2可知，細胞的致死率隨H2O2處理時間的延長和濃度的增大而增大,具有明顯的依賴性。雞胚肝細胞在不同H2O2濃度的培養液中刺激4 h后,細胞致死率上升,并且隨著H2O2濃度的增加,細胞致死率顯著上升,不同處理組的肝細胞致死率與正常對照組差異顯著(P<0.05)。2、4、6、8、10、12 mmol/L H2O2作用4 h后,細胞的致死率分別為16.4%、27.9%、40.2%、60.2%、80.2%、96.3%,高濃度的H2O2處理4 h后,10、12 mmol/LH2O2作用雞胚肝細胞后,肝細胞成片脫落,大量死亡,造成不可逆損傷,無法利用藥物進行修復。肝細胞在不同濃度H2O2作用下4 h的PI染色結果如圖3所示。由圖3可知,生長狀態良好的雞胚肝細胞貼壁牢固,細胞間呈島狀連接,鋪滿培養板后,融合形成連續單層狀;未用H2O2處理的雞胚肝細胞經PI染色后,細胞基本無死亡;隨著H2O2濃度的增加,雞胚肝細胞在經誘導4 h后,細胞出現不同程度的損傷情況；高濃度H2O2(10、12 mmol/L)處理肝細胞4 h后,細胞大面積死亡,成片脫落,染色結果與MTT法測得的結果相吻合；其他濃度H2O2(2、4、6、8 mmol/L)處理肝細胞4 h后,細胞核部分紅染,紅染比例隨H2O2濃度的增加而增加。

圖3 不同濃度H2O2處理肝細胞4 h PI染色情況

2.3 H2O2濃度對肝細胞MDA產生量的影響

H2O2處理雞胚肝細胞時間不同,細胞內部酶活性發生改變的大小也不同。通過上述實驗結果,本文統一選取處理時間為4 h,來觀察肝細胞內MDA產生量的變化以及相關酶活性的改變。H2O2處理細胞對MAD產生量的影響如圖4所示。

圖4 H2O2處理對細胞內MDA產生量的影響

從圖4可以看出，隨著H2O2濃度升高,肝細胞內MDA產生量逐漸增加,所有對照組均顯著高于正常對照組(P<0.05),并且MDA的產生量隨H2O2濃度的增加而增加,當H2O2濃度達到8 mmol/L之后,MDA產生量的增加速率變慢,并且在H2O2高濃度(8、10、12 mmol/L)時,細胞內MDA產生量明顯高于低濃度處理組(2、4、6 mmol/L)。

2.4 H2O2對肝細胞SOD和CAT 活性的影響

H2O2處理細胞對SOD活性的影響如圖5所示。從圖5可以看出，不同濃度的H2O2處理肝細胞4 h后,在H2O2濃度較低時,隨H2O2濃度的增加SOD活性逐漸升高,在H2O2濃度達到4 mmol/L之后, SOD活性隨著H2O2濃度增加而變小。隨后隨著H2O2濃度的增加,SOD活性隨之下降。但是SOD活性在H2O2濃度達到8 mmol/L之前,下降并不明顯;當H2O2濃度達到10 mmol/L時, SOD活性明顯小于H2O2低濃度處理組,但是其活性仍高于空白對照組。

圖5 H2O2處理對細胞內SOD活性的影響

H2O2處理細胞對CAT活性的影響如圖6所示。由圖6可知，隨著H2O2濃度的增加,CAT活性也隨之逐漸上升,在H2O2濃度達到6 mmol/L時,CAT活性達到最大,隨后隨著H2O2濃度的增加,CAT活性會隨之變小。H2O2高濃度(8、10、12 mmol/L)處理時,CAT活性明顯低于H2O2低濃度(2、4、6 mmol/L)處理肝細胞,但是其活性也明顯高于空白對照組。

圖6 H2O2處理對細胞內CAT活性的影響

2.5 牛磺酸安全濃度的篩選

牛磺酸的安全濃度如圖7所示。

圖7 不同濃度牛磺酸對肝細胞活力的影響

從圖7可以看出,牛磺酸濃度為6.25、12.50 mmol/L時A570與空白對照組相比無顯著差異(P>0.05)。在該濃度區間,雞胚肝細胞活力與正常培養的肝細胞無明顯差異,這說明該濃度區間的牛磺酸有益于雞胚肝細胞的正常生長。當牛磺酸濃度達到25.00 mmol/L時,細胞的吸光度明顯小于空白對照組的吸光度,并且吸光度隨著牛磺酸濃度的增加而呈現下降趨勢,這說明一旦超過了25.00 mmol/L的濃度區間,牛磺酸也會對雞胚肝細胞產生傷害,因此選擇6.25、12.50 mmol/L作為牛磺酸的安全濃度。

2.6 雞胚肝細胞的活力變化

根據上述氧化模型的建立以及牛磺酸安全濃度的檢測,本文選擇了H2O2濃度為8 mmol/L,干擾時間4 h,牛磺酸濃度為6.25 和12.50 mmol/L。同時為了實驗的準確性并且盡可能地防止細胞活力過高影響檢測結果,實驗將減少肝細胞的培養濃度,正常培養24 h后添加牛磺酸培養24 h,再加入H2O2,4 h后,通過MTT法檢測肝細胞的活力。牛磺酸對H2O2的抑制作用如圖8所示。

圖8 不同濃度牛磺酸對H2O2的抑制

由圖8可知，加入過氧化氫組的細胞活力最低,并且顯著低于空白對照組(P<0.05),加入牛磺酸的藥物組,雖然比空白對照組的細胞活力低,但是與過氧化氫氧化組對比,要顯著高于氧化組(P<0.05),通過計算發現在牛磺酸濃度為12.50 mmol/L時,細胞的存活率接近80%。這表明牛磺酸添加量為6.25、12.50 mmol/L時,能夠顯著抑制H2O2對雞胚肝細胞的氧化刺激傷害。

不同處理組對細胞活性的影響如圖9所示。

從圖9可以看出,空白組的細胞生長正常,細胞邊界清晰可見,細胞相互融合層層密布,肝細胞聚集成團,形態完整良好;過氧化氫組的肝細胞受到氧化刺激后,大片的細胞死亡脫落,細胞數量明顯減少,大量的細胞聚集在一起,細胞之間的界限分辨不清;牛磺酸藥物組細胞數目與空白對照組相比,沒有明顯差異,比過氧化氫組顯著增多,細胞邊界較為模糊,整體形態比過氧化氫組要好很多。結果表明,牛磺酸在安全限度區間內,能夠有效地緩解過氧化氫對雞胚肝細胞的氧化刺激。

圖9 不同處理組對細胞活性的影響

3 討 論

氧化應激是指體內氧化與抗氧化作用失衡,傾向于氧化,導致中性粒細胞炎性浸潤,蛋白酶分泌增加,產生大量氧化中間產物。氧化應激是由自由基在體內產生的一種負面作用,并被認為是導致衰老和疾病的一個重要因素。當細胞內氧自由基產生過多, 超出機體清除能力時,氧化與抗氧化失衡,致氧自由基過量積聚,對細胞產生多種毒性作用[15]。雞胚發育是在半封閉的蛋殼中,不同于哺乳動物的胚胎發育,它們無法通過臍帶進行營養物質的攝入和代謝產物的排出,因此只能通過前期積累在蛋中的營養物質來維持。隨著雞胚的生長,需要更多的氧氣來進行組織維持,主要有細胞修復、神經元興奮性、排泄過程、心臟和呼吸功能;細胞增殖主要是組織和器官形成以及增加身體運動和產熱,因此,在孵化后期,胚胎更易受活性氧入侵。H2O2是體內最常見的一種氧自由基,在多種組織損傷中發揮了關鍵性作用[15]，并且成為了人們研究氧化損傷的重要誘導劑。文獻[16]成功利用H2O2誘導構建了斜帶石斑魚原代肝細胞氧化損傷模型,文獻[17]利用H2O2誘導構建了人卵巢顆粒細胞氧化應激模型。因此本文選取H2O2作為刺激源來誘導孵化至16 d的雞胚肝細胞并建立氧化應激模型。研究表明,在誘導細胞建立氧化應激模型時,細胞存活率要保持在50%～70%,若低于50%則表明細胞已經大量死亡,造成不可逆損失,無法修復;若細胞存活率高于70%,則表明細胞狀態較好,無明顯氧化損傷,無需修復[18]。因此本實驗將細胞存活率選為60%。當H2O2濃度為8 mmol/L,處理4 h后,細胞存活率降到59.8%。此時細胞內MDA的產生量明顯高于對照組。肝細胞受損明顯,同時細胞仍保持在一個較高的存活率,因此是理想的建模濃度。

作為胚胎抵御活性氧的第一道防線SOD、GSH-Px、CAT,它們共同作用來保護胚胎免受活性氧損傷。其中, SOD是清除生物體內超氧陰離子自由基的一種重要抗氧化酶,具有抗衰老、抗癌、防白內障等作用[19],可將超氧自由基轉化成H2O2。同時機體中CAT可以將H2O2轉化成完全無害的水。研究結果表明,H2O2處理雞胚肝細胞后,SOD和CAT活性顯著高于對照組,且2種過氧化物酶在高濃度處理組(10、12 mmol/L)要明顯高于低濃度處理組,其原因可能是細胞受到有害刺激后,會通過自身內源性調節進行自我保護與適應,啟動細胞內相關轉錄因子,與抗氧化酶順式反應元件相結合,促進抗氧化酶SOD和CAT的大量表達,進而提高抗氧化酶的活性。當H2O2處理濃度過高時,可能觸發了相反的應答途徑從而導致抗氧化酶活性的減弱[19]。

牛磺酸及其衍生物能夠通過清除一些氧化性有害物質,來防止動物免受氧化傷害。文獻[20]在肉雞飼料中添加牛磺酸,顯著地提高了肉雞的日增重,并且肉雛雞血清和肝臟中的GSH-Px、SOD、T-AOC的活性都有一定程度的增加,MDA產生量顯著下降；文獻[21]在兔飲水中添加了牛磺酸,同樣也提高了血液和肝臟中的SOD和GSH-Px活性。這些研究都證明了牛磺酸能夠提高幼齡家畜的抗氧化能力。文獻[22]利用牛乳腺上皮細胞,用乳房鏈球菌刺激產生氧化應激反應,通過添加牛磺酸發現可以激活Keap1-Nrf2信號通路,從而緩解了乳房鏈球菌帶來的氧化損傷;文獻[23]發現牛磺酸還可以激活Nrf2-Trx通路來緩解無機砷帶來的氧化傷害;文獻[24]研究表明甲基汞能夠抑制大鼠產生抗氧化酶GPX-1從而產生氧化應激傷害,而牛磺酸對這種抑制具有拮抗作用。這些研究都證明了牛磺酸能夠抑制氧化應激帶來的傷害。本研究從細胞水平角度,針對雞胚肝細胞,通過已經建立好的氧化模型,對肝細胞進行氧化刺激,同時預先添加牛磺酸,當牛磺酸的添加量在6.25 ～12.50 mmol/L區間時,結果表明能夠顯著抵抗H2O2對細胞的氧化傷害。這說明牛磺酸不僅可以提高活體的抗氧化能力,而且在細胞水平上也具有同樣的效果。這對后續研究雞胚抗氧化機理起到了積極作用。

4 結 論

本研究條件下8 mmol/LH2O2處理雞胚肝細胞4 h,細胞存活率達到60%左右,細胞內脂質過氧化產物MDA顯著升高,成功構建了以H2O2為誘導劑的肝細胞氧化應激模型。同時測定了牛磺酸對雞胚肝細胞的安全濃度,牛磺酸添加量在12.50 mmol/L以內,雞胚肝細胞活性不會受到損傷,并且驗證了牛磺酸在安全限度內能夠有效地抵抗H2O2對細胞的損傷。