瞬時熱脅迫對秋季3種植物葉片光系統Ⅱ活性和色素含量的影響*

宋佳寶，劉煜光，周曉慧，趙丹，史寶勝

(河北農業大學 園林與旅游學院，河北 保定 071000)

光系統活性是植物生長過程中的一項敏感指標，葉綠素熒光參數能夠反映植物葉片的光合效應以及熱耗散等情況，進而有效評估逆境對光合作用損傷的相關機制[1]。熱脅迫是一項重要的環境脅迫因素，發生在整個光合機構，阻礙線性電子及環式電子傳遞，導致植物光系統Ⅱ活性衰減，被不可逆損壞[2-3]。花色素苷是彩葉植物呈色的主要物質基礎，已有研究證明花色素苷能夠減弱過量ROS(活性氧自由基)的產生，保護處于逆境中植物的光合機構[4]。

日本晚櫻(Cerasusserrulata)、日本櫻花(C.yedo-ensis)為薔薇科(Rosaceae)櫻屬(CerasusMill.)植物，紫葉矮櫻(Prunus×cistena)為薔薇科李屬(PrunusL.)植物，樹形優美，花開絢麗，芳香四溢，在城鄉綠化美化、山地邊坡治理中應用廣泛，具有極高的生態、觀賞和經濟價值。目前，對于3種植物的研究主要集中在栽培繁殖技術[5]、生物學習性[6]、遺傳關系[7]等方面。前人對3種植物的耐旱性[8-9]、抗污染物能力[10]等已經開展了豐富的研究，但主要集中在生化指標的測定方面，葉綠素熒光參數和光合特性對熱脅迫的響應規律未見報導。因此，本研究以日本晚櫻、日本櫻花及富含花色素苷的紫葉矮櫻為研究材料，采用人工控制熱脅迫溫度和時間，探討熱脅迫下3種植物葉片熒光特性和色素含量及其他生理指標的變化情況和相關性，旨在揭示熱脅迫下其植物葉片光合響應機制及花色素苷對熱脅迫傷害的協調保護機制，為耐熱優質品種選育提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗區概況

試驗設在河北省保定市河北農業大學試驗基地位(38°48′26.13″N、115°24′58.30″E)，屬暖溫帶亞濕潤氣候，年平均氣溫12.7 ℃，年均降水量575.4 mm，年日照時數為2 560 h，年平均蒸發量1 760 mm，無霜期200 d，土壤類型為壤土，pH值7.6。

1.2 試驗材料

試驗于2020年9月底進行。供試材料為7～8 a生生長良好、長勢一致的日本晚櫻、紫葉矮櫻、日本櫻花，每種植物選取3株植株，每株間距3 m。所選植株四周無高大喬木和灌木遮陰，土壤氣候條件一致。每植株采摘向陽主枝頂端起第4～8葉序葉片，取樣葉片須完全展開，且無病蟲害。采摘后，迅速置于濕毛巾中帶回實驗室。

1.3 試驗設計

將采摘的3種植物的葉片置于內鋪濕潤濾紙的封口聚乙烯薄膜袋中，利用恒溫水浴鍋在完全避光條件下進行加熱。測量溫度為(25±0.2)、(30±0.2)、(33±0.2)、(36±0.2)、(39±0.2)、(42±0.2)、(45±0.2)、(48±0.2)、(51±0.2)℃，將溫度計置于水中，使玻璃泡與葉片浸沒于同一高度，確保溫度的準確性。處理時間為5、25、45 min。

1.4 指標測定

1.4.1 葉綠素熒光參數的測定

將不同處理下的葉片用葉夾進行暗適應30 min后，采用FluorPen手持式葉綠素熒光儀(PSI，捷克)測定葉片快相葉綠素熒光誘導曲線(OJIP)，測定時下鋪濕潤濾紙，盡可能減少葉片水分流失對葉片測定參數帶來的影響。每處理選取5個葉片的相應位置打取葉圓片作為5次重復，記錄葉綠素熒光參數(表1)。

表1 葉綠素熒光參數及含義

1.4.2 葉綠素含量的測定

熱脅迫處理后，每個處理每個重復均選取適量葉片，迅速擦凈、去主脈，然后剪碎混勻。每處理稱取0.1g葉片，3次重復。用95%乙醇作浸提液，置于暗處24h提取色素，用Thermo10S分光光度計(Cole-Parmer，美國)分別測定665、649、470nm處吸光值，用Arnon法修正公式計算葉綠素a(mg/g)、葉綠素b(mg/g)的含量[11]。

1.4.3 花色素苷含量的測定

花色素苷含量的測定按照Pirie等[12]的方法。稱取適量葉片，用體積比1%鹽酸甲醇溶液浸提，提取液分別于600、530、325、280nm處測定吸收值，以OD530～600 nm=0.1作1個單位，以U表示。

1.4.4 葉色的測定

采用全自動色彩色差計CR-400(柯尼卡美能達，日本)每個處理重復測定3次。測定指標包括L*、a*、b*，其中L*表示光澤明亮度；a*值表示色澤紅綠程度；b*的正值表示黃色程度。

1.5 數據處理方法

運用Excel 2010和SPSS 26.0軟件對測定數據進行作圖及分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 瞬時熱脅迫對葉綠素熒光參數的影響

2.1.1 對初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)的影響

與25 ℃對照相比，5 min熱脅迫下紫葉矮櫻Fo值隨脅迫溫度的升高而不斷增加，51 ℃脅迫下的Fo值與CK差異顯著(P<0.05)(圖1A)；日本晚櫻、日本櫻花分別在48 ℃、51 ℃時差異達到顯著水平(圖1B、圖1C)。當脅迫時間延長至25和45 min，紫葉矮櫻、日本晚櫻、日本櫻花Fo值開始顯著增加的溫度分別為48 、45 和45 ℃，與5 min熱脅迫處理相比均降低3 ℃。本試驗中，熱脅迫提高了紫葉矮櫻、日本晚櫻葉片的Fo值，表明其葉片PS Ⅱ反應中心遭到破壞，且破壞程度隨脅迫時間延長和脅迫溫度升高而增加。

圖1 不同熱脅迫處理3種植物Fo值的變化

隨著溫度的升高，紫葉矮櫻、日本晚櫻Fm值表現出先升后降的“單峰”變化趨勢(圖2A、2B)：與對照相比，紫葉矮櫻Fm值在36 ℃達到峰值，隨后又逐漸下降，最終降低至較低水平；日本晚櫻Fm值在33 ℃左右達到峰值，之后不斷降低，至42 ℃以上迅速降低。日本櫻花Fm值在熱脅迫下的變化則呈“上升(30 ℃)-下降(36 ℃)-上升(42 ℃)-下降(51 ℃)”的雙峰型曲線(圖2C)。Fm值可以反映PS Ⅱ電子傳遞情況。較高溫度的熱脅迫使3種試材Fm值顯著減小，表明高溫阻礙葉片中PS Ⅱ電子傳遞。

圖2 不同熱脅迫處理3種植物Fm值的變化

2.1.2 對最大光化學效率(Fv/Fm)的影響

熱脅迫5 min處理下，隨著溫度的升高3種試材的Fv/Fm值呈緩慢下降趨勢，至45 ℃以上Fv/Fm值迅速降低；脅迫時間延長至25 min和45 min，紫葉矮櫻、日本晚櫻的Fv/Fm值在溫度升高至45 ℃以上就迅速降低，日本櫻花在脅迫溫度達到39 ℃以上時Fv/Fm值迅速降低，與5 min相比均有所提前(圖3)。可見，45 ℃以上的瞬時熱脅迫會顯著降低3種試材PS Ⅱ原初光能化學轉換率。

圖3 不同熱脅迫處理3種植物Fv/Fm的變化

2.1.3 對光系統Ⅱ反應中心活性參數的影響

由表2可知，5 min和25 min的較短時間脅迫下，與25 ℃對照相比，39～51 ℃的高溫處理使3種植物的ABS/RC、TRO/RC、DIO/RC值顯著升高，而在45 min較長時間的51 ℃高溫脅迫下3種植物的ETO/RC值顯著降低。25 min和45 min脅迫時間下ABS/RC、TRO/RC、DIO/RC、ETO/RC值發生顯著變化時的溫度(39～42 ℃)與5 min脅迫時間下(45～51 ℃)相比有所提前，幅度為3～6 ℃。最高熱脅迫溫度和最長熱脅迫時間組合處理下，與對照相比，紫葉矮櫻的ABS/RC、TRO/RC、DIO/RC值變幅最小，日本晚櫻的ETO/RC值變幅最大。

表2 不同熱脅迫處理3種植物PSⅡ反應中心活性參數的變化

2.1.4 對光系統Ⅱ能量分配比率的影響

由圖4可知：隨著熱脅迫溫度的升高，經45～51 ℃高溫處理后的3種植物葉片φPo值顯著下降、φDo值顯著增加；φEo隨著脅迫溫度升高呈降低、升高再降低的趨勢，脅迫程度最大，即51 ℃高溫處理45 min時的值顯著低于對照值，分別降低41.6%、77.0%、67.0%；隨溫度增加，日本晚櫻ψo先降低后升高，日本櫻花和紫葉矮櫻ψo值先升高后降低，經51 ℃熱脅迫后，3種植物ψo值均顯著低于對照，降幅為19.8%、65.3%、32.5%。這表明，高溫脅迫下，葉片光系統通過增加熱耗散、調節PSⅡ能量分配比率以適應熱脅迫。

圖4 不同熱脅迫處理3種植物葉片PSⅡ能量分配比率的變化

2.2 瞬時熱脅迫對葉綠素含量的影響

隨著熱脅迫溫度的升高，與25 ℃(對照)相比，5 min熱脅迫時間處理下，紫葉矮櫻的葉綠素含量呈現先緩慢上升再顯著下降的趨勢(圖5A)，日本晚櫻和日本櫻花的葉綠素含量表現為下降趨勢(圖5B、圖5C)，經33 ℃的熱脅迫后，3種植物葉片葉綠素含量與對照相比均顯著降低；脅迫時間延長20 min后，紫葉矮櫻葉綠素含量先波動變化(25～36 ℃)再顯著降低，日本晚櫻和日本櫻花的葉綠素含量逐漸降低；45 min的熱脅迫下，日本晚櫻和日本櫻花經過30 ℃熱脅迫后的葉綠素含量與對照相比顯著降低(P<0.05)，紫葉矮櫻發生這個過程的溫度為33 ℃，與其他2種櫻花相比溫度有所升高。最高熱脅迫溫度和最長熱脅迫時間組合處理下，紫葉矮櫻、日本晚櫻、日本櫻花葉綠素含量較對照分別降低44.5%、70.3%、69.2%，試驗結果表明：經高溫熱脅迫后紫葉矮櫻葉片的葉綠素含量降低的幅度最小。

圖5 不同熱脅迫處理3種植物葉綠素含量的變化

熱脅迫下，3種植物葉綠素a、葉綠素b含量逐漸減少，隨著脅迫溫度的升高和脅迫時間的增加，3種植物葉綠素a/b含量總體呈升高趨勢，溫度達到45～51 ℃，3種植物經歷一個先降后增的過程(圖6)。5 min熱脅迫時間處理下，紫葉矮櫻、日本晚櫻、日本櫻花葉綠素a/b值出現降低情況的溫度為51 ℃、51 ℃、42 ℃；25 min處理下的拐點溫度分別為51 ℃、45 ℃、45 ℃；45 min處理下則提前至48 ℃、45 ℃、42 ℃。51 ℃處理下3種植物葉綠素a/b分別增加23.2%、30.7%、45.5%，紫葉矮櫻增幅最小。

圖6 不同熱脅迫處理3種植物葉綠素a含量/葉綠素b含量的變化

2.3 瞬時熱脅迫對葉片花色素苷含量的影響

同一脅迫時間下，3種植物葉片花色素苷含量隨溫度的升高而減少；同一溫度下，花色素苷含量隨時間延長而減少(圖7)。當脅迫程度達到最大，即脅迫溫度為51 ℃、脅迫時間為45 min時，紫葉矮櫻、日本晚櫻、日本櫻花花色素苷含量分別為對照的66.6%、17.3%、16.7%。這說明高溫在一定程度上影響3種植物葉片中花色素苷的合成或分解，而紫葉矮櫻的花色素苷熱穩定性最高。

圖7 不同熱脅迫處理3種植物花色素苷含量的變化

2.4 瞬時熱脅迫對3種植物葉色的影響

隨熱脅迫溫度的升高和熱脅迫時間的延長，3種植物葉片L*逐漸降低，a*值逐漸增加，b*值有所降低(表3)。當熱脅迫程度達到最大(51 ℃、45 min組合處理)時，與對照相比，日本晚櫻、紫葉矮櫻、日本櫻花L*值分別降低19.81%、10.06%、11.17%，a*值分別增加31.15%、25.57%、48.73%，b*值分別降低56.69%、3.08%、25.4%。表明高溫能夠降低3種植物葉片的亮度，提高葉片紅綠比值，降低黃藍比值，使呈色偏向紅色。3種植物中，紫葉矮櫻葉色參數的變化最小。

3 討論

3.1 瞬時高溫脅迫誘導植物光系統活性的降低

葉綠素熒光參數是在生理生化水平上了解熱脅迫和熱脅迫耐受性的重要指標。植物PS Ⅱ對逆境脅迫非常敏感，在植物正常生理條件下，其潛在的PS Ⅱ光化學效率Fv/Fm變化很小，而逆境條件下該參數則會明顯降低[13]。已有研究結果表明，高溫脅迫會導致植物葉片Fo增加，Fm、Fv/Fm顯著下降[14]。本研究與上述結果一致。說明PS Ⅱ反應中心及放氧復合體OEC受高溫影響失活，抑制QA向QB的電子傳遞，受體側電子QA不斷積累，PS Ⅱ穩定性降低，進而影響植物的光合功能[15-16]。此外發現，Fv/Fm在受到較低溫度(25～45 ℃)的熱脅迫和高溫熱脅迫(45 ℃以上)時下降程度不一，45 ℃以后顯著下降，推測3種植物在受到45 ℃以下的較低溫度脅迫時，能夠通過調節補光天線系統的方式減少PS Ⅱ供給側激發能的積累或利用其他方式來減少光系統傷害程度；在高溫熱脅迫逆境下，葉綠素穩定性遭到破壞，電子傳遞鏈受損，光化學效率降低以配合CO2同化能力的降低，PS Ⅱ受到破壞。日本櫻花經過連續45 min的48 ℃的熱脅迫后，φPo、Fv/Fm降為0，與油菜(BrassicanapusL.)經高溫脅迫后的結果一致[17]，進一步說明重度高溫脅迫致使葉片光系統Ⅱ發生不可逆損害。

表3 不同熱脅迫處理下3種植物L*、a*、b*的變化

試驗發現，3種植物在受短暫高溫脅迫后比活性參數與初始值無顯著差異，說明它們通過調節自身對光能的吸收、捕獲、傳遞和耗散，最終獲得較高的光能轉換能力，PS Ⅱ活動能夠正常進行[18]。ABS/RC、DIO/RC、TRO/RC值在最大熱脅迫程度下迅速升至高水平，可能是因為長時間(45 min)的高溫(51 ℃)處理致使3種植物因熱耗散不足而導致光能過剩，使得PS Ⅱ產生光抑制，光合機構被不可逆的損壞。而φDo升高，說明3種植物葉片通過提高熱耗散將過剩的光能散失，從而達到降低高溫傷害的目的，這也是3種植物自我保護的體現。隨高溫脅迫時間的增加，葉片φEo下降，說明高溫使QA傳遞受阻。當脅迫溫度超過45 ℃，這3種植物的φEo閾值存在差異，紫葉矮櫻明顯更低，說明其電子傳遞能力更強，光合效率更高。

3.2 花色素苷對光系統具有保護作用

不同植物對熱脅迫處理的生理反應明顯不同。紫葉矮櫻的Fo值及變幅、Fv/Fm的降幅最小，說明其耐熱性較高，這可能與花色素苷的保護作用有關，即當植物葉片吸收光能出現過剩時，葉片中大量的花色素苷可以通過吸收和過濾藍紫光，減輕葉片光抑制和光氧化傷害程度[19]。張會慧等研究證明，花色素苷能夠改變丁香葉片吸收和利用光能的途徑及耗散過剩光能的方式[20]。富含花色素苷的紫葉矮櫻的ABS/RC、ETo/RC、TRo/RC和DIo/RC低于花色素苷含量較低的日本晚櫻和日本櫻花，由此推測：紫葉矮櫻葉片因花色素苷的大量存在而減輕吸收的光能，對緩解高溫對PS Ⅱ反應中心的破壞具有積極作用。

高等植物光系統Ⅱ的補光天線(LHCⅡ b)是捕光色素蛋白復合物，代表葉綠素b向葉綠素a的能量傳遞，高溫使LHCⅡ b穩定性降低，葉綠素a/b增加[21-22]。本研究發現，紫葉矮櫻葉綠素a/b的的變幅最小，可能是因為其葉片中存在大量的花色素苷，能夠減少高溫對LHCⅡ的影響，進而使葉綠素a/b增加速度減緩[23]。這也印證了紫葉矮櫻耐熱性優于日本晚櫻和日本櫻花的說法。

總的來說，紫葉矮櫻葉片中較高含量的花色素苷可改變其對光能的吸收，從而具有有效緩解熱脅迫造成的光抑制、減輕熱脅迫對葉片光合機構尤其是PS Ⅱ反應中心的傷害、降低對細胞中葉綠素的破壞程度、保護光合機構的作用，這可能是紫葉矮櫻對高溫熱脅迫具有較強抗性的原因之一。