海風藤醇提物對慢性硬膜下血腫大鼠的治療作用及機制

夏士濤， 王培宇， 張開創， 魏靜

（黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院外三科，黑龍江哈爾濱 150040）

慢性硬膜下血腫（chronic subdural hematoma，CSDH）是最常見的一種繼發性顱腦損傷。有報道，顱腦創傷為CSDH發生的主要因素，但肝腎功能不全、老年癡呆、代謝性疾病、抗凝藥物應用等均亦可引起CSDH[1]。目前，以鉆孔引流為主的手術憑借其快捷、安全、方便等優點成為CSDH的首選療法，但術后死亡率、致殘率和復發率居高不下，且患者術后容易并發感染、腦水腫、器官功能不全等，死亡率高。因此，有必要開發安全、有效的CSDH治療新策略，以改善CSDH患者的預后。海風藤是胡椒科胡椒屬植物海風藤Piper kadsura（Choisy）Ohwi的干燥藤莖，味辛、苦，性微溫，入肝經，有祛風、止痛、通絡等功效，現代藥理研究表明，其具有抗炎、鎮痛等作用[2]。前期實驗發現，海風藤醇提物對CSDH有明顯的療效。故本研究以海風藤醇提物為研究藥物，以阿托伐他汀鈣為陽性對照藥[3-4]，通過動物實驗分析其對CSDH的治療作用及其可能機制，以期為臨床應用提供借鑒，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠60只，7周齡，體質量260~270 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019-0010。實驗前適應性飼養1周，室溫22~24℃，相對濕度40%~60%，自然光照，自由攝食飲水。本實驗方案滿足一般動物實驗倫理學原則，已通過本院倫理委員會批準，審批號：20190511。

1.2 藥物及制備海風藤，由湖北省青山中藥材公司生產提供，批號：20191204，已經華中科技大學同濟醫學院陳家春教授鑒定。制備方法：取海風藤7 kg，以體積分數70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，混合提取液，獲得乙醇提取物。回收乙醇，浸膏加水混懸，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，蒸干得到正丁醇377.37 g，以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液配制成7.72、15.44、30.88 mg∕kg海風藤醇提物溶液。阿托伐他汀鈣片，輝瑞制藥有限公司生產，規格：20 mg，批號：國藥準字H20051408。

1.3 試劑與儀器CMC-Na（濟寧市貝諾克生物科技有限公司生產）；白細胞介素6（IL-6）、IL-8酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海臻科生物科技有限公司）；凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）、纖維蛋白原（FIB）檢測試劑盒（上海將來實業股份有限公司）；小鼠抗大鼠CD31抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；兔抗大鼠缺氧誘導因子1α（HIF-1α）、緊密連接相關蛋白Claudin-5、GAPDH等抗體（海雅吉生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的免疫球蛋白（IgG）抗體（北京博爾西科技有限公司）。CA-7000全自動血凝分析儀（日本Sysmex公司）；M型小動物核磁共振成像系統（ASPECT Imaging公司）；680型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；BH2顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4 造模與分組抽取50只大鼠采用自體血反復多次顱內灌注法建立慢性硬膜下血腫模型[5]：麻醉大鼠，以俯臥位固定在立體定向架上，在額頂葉中心取切口，暴露顱骨，磨出直徑為1 mm的骨窗，在硬腦膜上剪開直徑為1 mm的十字切口。用無菌BD注射器取大鼠尾靜脈血700μL，注入于硬膜下腔，先以30μL∕min速度注血10 min，再以10μL∕min速度注血10 min。首次注血72 h后，再次取500μL自體血，劃開愈合的硬腦膜切口，再次注血，先以20μL∕min速度注血10 min，再以10μL∕min注血10 min。造模大鼠首次注血后第24天用MRI掃描大鼠頭部，血腫形成表示造模成功。共40只大鼠造模成功，將其隨機分為模型組，陽性對照組，海風藤醇提物低、高劑量組，每組各10只。剩余10只作為假手術組，其造模方法同上，但不注射自體血。

1.5 干預方法陽性對照組造模成功后次日灌胃126 mg∕kg阿托伐他汀鈣（以生理鹽水配制成溶液），海風藤醇提物低、高劑量組同一時間分別灌胃15.44、30.88 mg∕kg海風藤醇提物溶液[6]，模型組、假手術組亦同一時間灌胃等體積CMC-Na溶液。1次∕d，連續給藥14 d。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 大鼠腦血腫體積測定末次給藥后1 h，麻醉大鼠，將其置于MRI掃描專用線圈內，進行T2WI序列冠狀位掃描，層厚1 mm。選擇體積最大血腫的最大斷層截面，用核磁工作站軟件Volume Viewer 4.3測量血腫的橫、縱徑，計算血腫體積（mm3）。

1.6.2 ELISA法檢測大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-8含量MRI掃描后，腹主動脈采血，低溫離心取血清。參考IL-6、IL-8 ELISA試劑盒說明書檢測血清IL-6、IL-8水平，操作如下：在酶標包被板上設置空白孔、樣品孔、標準品孔，加樣后稀釋，溫育，洗滌，加入酶標試劑，顯色，終止，在450 nm波長下測定各孔光密度值，計算各樣本濃度值。

1.6.3 凝固法檢測血漿凝血功能指標取血漿用全自動血凝分析儀檢測，嚴格參考PT、TT、FIB試劑盒說明書，采用凝固法檢測血漿PT、TT、FIB含量，即將血漿樣本試管編號，根據儀器操作流程檢驗，將結果自動傳輸到計算機上，統計檢驗結果。

1.6.4 CD31免疫組織化學染色法檢測大鼠血腫包膜新生血管麻醉后處死大鼠，快速分離顱骨，獲得腦組織，取注血側的腦組織液氮冷凍，另一部分腦組織用冰凍組織切片包埋劑包埋腦組織，制作冠狀位連續切片（厚8μm），進行CD31血管免疫組織化學染色：將冰凍切片用甲醇固定，用小牛血清封閉，滴加小鼠抗大鼠CD31一抗（稀釋1∶100），4℃過夜，取出滴加HRP標記的IgG二抗（稀釋1∶1 200），37℃溫箱孵育20 min。DAB顯色，鏡下觀察顯色情況，蒸餾水終止反應，蘇木素復染，鹽水酒精分化，1%氨水返藍，脫水封片。以磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對照，其余操作同上。隨機選取5個血管密集區，顯微鏡（400倍）下計數單個條索狀CD31陽性血管內皮細胞與彼此分離的血管簇數目，計算平均值，轉化為包膜血管密度（MVD）。

1.6.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測大鼠腦組織HIF-1α、Claudin-5蛋白表達水平取液氮冷凍腦組織，放射免疫沉淀分析（RIPA）細胞裂解液進行裂解，離心取上清。二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白質，沸水浴變性，上樣，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉封閉。分別加入一抗稀釋液HIF-1α（1∶800）、Claudin-5（1∶600）、VEGF（1∶800）、GAPDH（1∶600）孵育過夜，次日加入HRP標記的IgG二抗（1∶2 000）室溫孵育0.5 h。加入電化學發光（ECL）試劑顯色，用Image J軟件分析目的蛋白與內參灰度值的比值。

1.7 統計方法采用SPSS 22.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠腦血腫體積以MRI觀測結果計算血腫體積，假手術組大鼠無顱內血腫不做統計。與模型組比較，海風藤醇提物低、高劑量組及陽性對照組大鼠血腫體積縮小（P＜0.05）；與陽性對照組比較，海風藤醇提物低、高劑量組血腫體積增大（P＜0.05）；與海風藤醇提物低劑量組比較，高劑量組大鼠血腫體積較小（P＜0.05）。結果見表1、圖1。

圖1 各組大鼠腦血腫體積MRI結果比較Figure 1 Comparion of MRIresults of brain hematoma volume in various groups

表1 各組大鼠腦血腫體積比較Table 1 Comparison of brain hematoma volume of rats in various groups （±s，mm3）

表1 各組大鼠腦血腫體積比較Table 1 Comparison of brain hematoma volume of rats in various groups （±s，mm3）

①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與陽性對照組比較；③P＜0.05，與海風藤醇提物低劑量組比較

血腫體積604.33±23.78 166.69±18.42①415.59±20.25①②241.79±19.47①②③組別模型組陽性對照組海風藤醇提物低劑量組海風藤醇提物高劑量組鼠數（只）10 10 10 10

2.2 大鼠血清炎癥因子與假手術組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-8水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組，海風藤醇提物低、高劑量組大鼠血清IL-6、IL-8水平降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，海風藤醇提物低、高劑量組大鼠血清IL-6、IL-8水平均升高（P＜0.05）；與海風藤醇提物低劑量組比較，高劑量組大鼠血清IL-6、IL-8水平均降低（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠血清IL-6、IL-8水平比較Table 2 Comparison of serum IL-6 and IL-8 levels of rats in various groups （±s，pg·mL-1）

表2 各組大鼠血清IL-6、IL-8水平比較Table 2 Comparison of serum IL-6 and IL-8 levels of rats in various groups （±s，pg·mL-1）

①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽性對照組比較；④P＜0.05，與海風藤醇提物低劑量組比較

IL-8 49.87±3.41 255.15±14.46①92.16±4.66①②211.42±10.58①②③143.15±8.42①②③④組別假手術組模型組陽性對照組海風藤醇提物低劑量組海風藤醇提物高劑量組鼠數（只）10 10 10 10 10 IL-6 51.66±3.14 249.44±15.69①97.42±5.91①②198.63±10.36①②③147.84±7.59①②③④

2.3 大鼠血漿凝血功能與假手術組比較，模型組大鼠血漿PT、FIB含量降低，TT含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組，海風藤醇提物低、高劑量組大鼠血漿PT、FIB含量降低，TT含量升高（P＜0.05）；與陽性對照組比較，海風藤醇提物低、高劑量組大鼠血漿PT、FIB含量降低，TT含量升高（P＜0.05）；與海風藤醇提物低劑量組比較，高劑量組大鼠血漿PT、FIB含量升高，TT含量降低（P＜0.05）。結果見表3。

表3 各組大鼠血漿PT、TT、FIB含量比較Table 3 Comparison of plasma PT，TT，FIB levels of rats in various groups （±s）

表3 各組大鼠血漿PT、TT、FIB含量比較Table 3 Comparison of plasma PT，TT，FIB levels of rats in various groups （±s）

FIB（μg·mL-1）1.34±0.17 0.71±0.11①1.20±0.12①②0.98±0.12①②③1.07±0.13①②③④組別假手術組模型組陽性對照組海風藤醇提物低劑量組海風藤醇提物高劑量組鼠數（只）10 10 10 10 10 PT（pg·mL-1）99.15±5.42 60.31±2.34①87.66±2.48①②71.32±1.45①②③80.63±2.16①②③④TT（pg·mL-1）62.66±7.61 87.41±6.28①68.41±2.54①②80.69±4.12①②③74.36±3.69①②③④

2.4 大鼠血腫包膜MVDCD31為血管內皮標記，可作為血腫包膜MVD觀察指標。與模型組比較，陽性對照組，海風藤醇提物低、高劑量組血腫包膜MVD增大（P＜0.05）；與陽性對照組比較，海風藤醇提物低、高劑量組血腫包膜MVD數減小（P＜0.05）；與海風藤醇提物低劑量組比較，高劑量組血腫包膜MVD較高（P＜0.05）。結果見表4、圖2。

圖2 各組大鼠腦組織CD31陽性細胞分布比較（免疫組化染色法，×400）Figure 2 Comparison of distribution of CD31 positive cells in brain tissue of rats in various groups（by immunohistochemical staining，×400）

表4 各組大鼠腦血腫包膜MVD比較Table 4 Comparison of the MVD in the brain hematoma capsule of rats in various groups （±s，條）

表4 各組大鼠腦血腫包膜MVD比較Table 4 Comparison of the MVD in the brain hematoma capsule of rats in various groups （±s，條）

①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與陽性對照組比較；③P＜0.05，與海風藤醇提物低劑量組比較

MVD 9.31±0.78 69.61±5.14①15.69±1.91①②50.85±2.75①②③組別模型組陽性對照組海風藤醇提物低劑量組海風藤醇提物高劑量組鼠數（只）10 10 10 10

2.5 大鼠腦組織HIF-1α信號通路相關蛋白表達與假手術組比較，模型組大鼠腦組織HIF-1α蛋白表達水平升高、Claudin-5蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，海風藤醇提物低、高劑量組HIF-1α蛋白表達水平降低、Claudin-5蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與海風藤醇提物低劑量組比較，高劑量組HIF-1α蛋白表達水平降低、Claudin-5蛋白表達水平較高（P＜0.05）。結果見表5、圖3。

圖3 各組大鼠腦組織HIF-1α信號通路相關蛋白表達電泳圖Figure 3 Electrophoretic diagram of HIF-1αsignaling pathway related proteins in rat brain tissue of various groups

表5 各組大鼠腦組織HIF-1α信號通路相關蛋白表達比較Table 5 Comparison of HIF-1αsignaling pathway related proteins in brain tissue of rats in variou groups （±s）

表5 各組大鼠腦組織HIF-1α信號通路相關蛋白表達比較Table 5 Comparison of HIF-1αsignaling pathway related proteins in brain tissue of rats in variou groups （±s）

①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與海風藤醇提物低劑量組比較

Claudin-5 0.99±0.09 0.12±0.03①0.39±0.08①②0.75±0.09①②③組別假手術組模型組海風藤醇提物低劑量組海風藤醇提物高劑量組鼠數（只）10 10 10 10 HIF-1α 0.52±0.11 1.25±0.18①0.84±0.13①②0.65±0.12①②③

3 討論

慢性硬膜下血腫（CSDH）作為一種慢性出血性神經系統疾病，往往因創傷性顱腦損傷，致硬腦膜與硬膜下腔處橋靜脈被撕裂，出血聚集在硬膜下腔，形成血腫。當前，CSDH發病機制的研究尚在起始階段。Fan等[7]研究表明，炎癥、血管生成在CSDH發病中發揮了關鍵作用。故探索與CSDH發作相關的炎癥反應、血管生成病理生理機制，開發可改善CSDH預后的新藥有一定的臨床意義。既往張柯媛等[8]研究表明，海風藤醇提物有抗炎作用，王偉等[9]報道其具有抗血小板聚集的作用。因此，本研究擬觀察海風藤醇提物治療慢性硬膜下血腫的效果及其作用機制。本研究通過腦MRI觀察發現：與模型組比較，海風藤醇提物低、高劑量組大鼠腦血腫體積減小，提示海風藤醇提物可促進腦血腫吸收，效果僅次于經典西藥阿托伐他汀。PT是凝血機制中心環節，活化后可形成TT，TT為蛋白水解酶，可水解多種凝血因子，并直接作用于血液中FIB，誘發凝血、血腫生成。一般情況下，PT、TT、FIB處于動態平衡中，CSDH發生后血漿PT活化生成TT，TT釋放大量毒性物質、細胞因子，損傷血腦屏障，降低其通透性，導致凝血因子進入血液循環，表現為TT升高、PT下降。本研究結果顯示：與模型組比較，海風藤醇提物低、高劑量組大鼠血漿PT、FIB含量升高，TT含量降低。結合免疫組化染色結果顯示：與模型組比較，海風藤醇提物低、高劑量組大鼠血腫包膜MVD增大。提示海風藤醇提物可調節凝血指標，促使血管形成，這可能是其促進血腫吸收的原因之一。

Zhao等[10]報道，炎癥與CSDH密切相關。IL-6是一種生物學功能較多的內源性促炎因子，可增加血管通透性，促進血液滲出，是CSDH形成過程中關鍵的炎性反應因子。IL-8不僅是炎癥反應因子，還可作為趨化因子，促進黏附因子吸引中性粒細胞并將其激活，強化血管內皮細胞等遷移功能，與血管生成密切相關。CSDH持續擴大的炎癥反應是IL-6、IL-8等共同作用的結果。本研究結果顯示：與模型組比較，海風藤醇提物低、高劑量組大鼠IL-6、IL-8水平持續降低，提示海風藤醇提物具有抗炎的功效。

CSDH發生后，凝聚在硬膜下腔的血塊壓迫皮質，形成局部缺血缺氧環境，導致HIF-1α不斷累積。HIF-1α是多種信號通路的上游調控因子，也是哺乳動物機體缺氧狀態下的重要轉錄調節因子，被認為在炎癥反應中發揮重要作用[11]。Lin等[12]研究表明，HIF-1α被激活后，可促進炎癥因子的產生，并激活下游許多經典靶基因如血管內皮生長因子（VEGF）轉錄，上調VEGF表達。Horecka等[13]報道VEGF與基質金屬蛋白酶9（MMP-9）正相關。HIF-1α活化后上調VEGF，導致MMP-9表達升高，降解內皮細胞間的緊密連接蛋白Claudin-5，從而破壞血腦屏障。Berndt等[14]報道Claudin-5是形成血腦屏障緊密連接的主要分子元件，是腦微血管內皮細胞緊密鏈接中特異性蛋白，其表達下調可影響血腦屏障結構完整性。本研究結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠腦組織HIF-1α表達上調，Claudin-5表達下調；與模型組比較，海風藤醇提物低、高劑量組大鼠腦組織HIF-1α表達下調，Claudin-5表達上調，提示海風藤醇提物可能通過降低血腫周圍組織缺氧生成的HIF-1α表達，降低下游產物MMP-9，從而上調Claudin-5表達，保持CSDH血腦屏障的完整性。

綜上所述，海風藤醇提物可促進CSDH吸收，調節凝血功能，其機制可能是通過下調HIF-1α信號通路實現的。